Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы .8
1.1. Структурные и функциональные особенности организации фотосинтетического аппарата (ФСА) растений и водорослей 8
1.2. Механизм генерации быстрой флуоресценции хлорофилла а в фотосинтетических мембранах 14
1.3. Природа замедленной флуоресценции хлорофилла а в фотосинтетических мембранах .18
1.4. Регистрация флуоресценции хлорофилла а на однолучевых флуориметрах. JIP-тест 23
1.5. Регистрация флуоресценции хлорофилла а на флуориметрах типа РАМ 29
1.6. Токсичность металлов и их влияние на растительные организмы 1.6.1. Медь .34
1.6.2. Серебро 37
1.6.3. Наночастицы серебра .37
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 41
2.1.Материалы исследования 41
2.2. Методы исследования .43
2.2.1. Регистрация флуоресценции хлорофилла на флуориметре Aquapen-C 100 43
2.2.2. Регистрация индукционных кривых быстрой, замедленной флуоресценции и редокс превращения РЦ ФСI – Р700 (при 820 нм) на М-РЕА-2 43
2.2.3. Регистрация световых кривых фотохимического и нефотохимического тушения на флуориметре Water-PAM .46
2.2.4. Регистрация кинетики окисления/восстановления Р700 в темноте после освещения дальним красным светом
2.2.5. Спектральный анализ 47
2.2.6. Определение размера наночастиц 48
2.2.7. Обработка проб фитопланктона и оценка физико-химических параметров 48
2.3. Программное обеспечение 49
ГЛАВА 3. Результаты исследования и обсуждение .50
3.1. Влияние известных ингибиторов на параметры флуоресценции и окислительно-восстановительное превращение Р700 культуры зеленой водоросли Scenedesmus quadricauda 50
3.2. Влияние солей меди (CuSO4) на изменение индукционных кривых быстрой, замедленной флуоресценции и окислительно-восстановительного превращения P700 зеленой водоросли Scenedesmus quadricauda 57
3.3. Влияние серебряных наночастиц (AgНЧ) и солей серебра (AgNO3) на изменение индукционных кривых быстрой, замедленной флуоресценции и окислительно-восстановительного превращения P700 зеленой водоросли Chlamydomonas reinhardtii .68
3.4. Влияние солей меди (CuSO4) и серебра (AgNO3) на изменение параметров флуоресценции и окислительно-восстановительного превращения P700 листьев гороха Pisum sativum 76
3.5. Применение метода индукции быстрой флуоресценции хлорофилла а для оценки функционального состояния ФСА фитопланктона меромиктических водоемов Белого моря 81
3.6. Применение метода быстрых индукционных кривых флуоресценции хлорофилла а и окислительно-восстановительного превращения Р700 в исследовании эффекта УФ-С у водоросли Parachlorella kessleri 90
Заключение .98
Выводы .101
Список сокращений и условных обозначений .103
Список литературы
- Механизм генерации быстрой флуоресценции хлорофилла а в фотосинтетических мембранах
- Регистрация индукционных кривых быстрой, замедленной флуоресценции и редокс превращения РЦ ФСI – Р700 (при 820 нм) на М-РЕА-2
- Влияние солей меди (CuSO4) на изменение индукционных кривых быстрой, замедленной флуоресценции и окислительно-восстановительного превращения P700 зеленой водоросли Scenedesmus quadricauda
- Применение метода индукции быстрой флуоресценции хлорофилла а для оценки функционального состояния ФСА фитопланктона меромиктических водоемов Белого моря
Введение к работе
Актуальность исследования. Микроводоросли являются основными первичными продуцентами в водных экосистемах и одним из чувствительных звеньев к воздействию токсических веществ, они включены в системы мониторинга состояния водной среды, биотестирования и биоиндикации (Филенко, 2007). Оценка отклика микроводорослей на токсическое воздействие проводится по регистрации изменений численности, биомассы, скорости роста, скорости фотосинтетической фиксации углерода. Чтобы выявить изменение этих параметров в большинстве случаев требуется как минимум суточная экспозиция водорослей с токсикантом. Для оценки отклика микроводорослей на начальных этапах токсического воздействия широкое распространение получили методы регистрации параметров флуоресценции, таких, например, как квантовый выход флуоресценции (Fv/Fm) (Маторин, Рубин, 2012). Этот параметр отражает эффективность первичных процессов фотосинтеза, протекающих главным образом в фотосистеме II (ФСII), связанной с разложением H2O и выделением O2 (Schreiber, 1994). Световые реакции фотосинтеза представляют собой сложный и многостадийный процесс (Рубин, 2013), и токсические вещества могут воздействовать на разные его участки. Поэтому для выявления нарушений в протекании световых реакций фотосинтеза необходима характеристика процессов, происходящих не только в ФСII, но и в фотосистеме I (ФСI), а также в цепи переносчиков между фотосистемами, что может быть достигнуто при одновременной регистрации быстрой и замедленной флуоресценции, и окислительно-восстановительного состояния РЦ ФСI (P700) (Goltsev et al., 2009; Strasser et al., 2010). Практически полное отсутствие таких комплексных оценок изменений в протекании световых реакций фотосинтеза у микроводорослей на начальных этапах токсического воздействия определило цель работы.
Цель настоящей работы состояла в выявлении изменения характеристик световых реакций фотосинтеза (состояния ФСII, ФСI, промежуточных переносчиков между ними и энергизации мембран) у микроводорослей на начальных этапах токсического воздействия, а также в оценке функционального состояния природного фитопланктона по световым реакциям фотосинтеза.
Для достижения поставленной цели решали следующие задачи:
-
Выявить изменения в индукционных кривых быстрой, замедленной флуоресценции и окислительно-восстановительного состояния пигмента ФСI (P700) при воздействии модельных ингибиторов с известными сайтами действия на электрон-транспортную цепь у зеленой водоросли Scenedesmus quadricauda (Turpin) Brbisson.
-
Оценить функциональное состояние ФСII, ФСI и цепи переноса электронов между ними по изменению параметров флуоресценции у зеленой водоросли Scenedesmus quadricauda и листьев высших растений Pisum sativum L. при воздействии солей серебра (AgNO3) и меди (CuSO4) после часовой и суточной инкубации.
-
Оценить функциональное состояние ФСII, ФСI и цепи переноса электронов между ними по изменению параметров флуоресценции у зеленой водоросли Chlamydomonas reinhardtii P.A.Dangeard при воздействии наночастиц серебра (AgНЧ) после часовой и суточной инкубации.
-
Выявить по параметрам флуоресценции особенности функционального состояния фотосинтетического аппарата природного фитопланктона меромиктических водоемов Белого моря.
Научная новизна. Впервые на основе одновременной регистрации быстрой и замедленной флуоресценции, а также редокс состояния пигмента ФСI (Р700) получена комплексная оценка изменения характеристик световых реакций фотосинтеза у зеленых водорослей Scenedesmus quadricauda и Chlamydomonas reinhardtii на начальных этапах токсического воздействия солей таких тяжелых металлов как медь и серебро, а также наночастиц серебра.
Установлена разная чувствительность параметров флуоресценции для регистрации воздействия низких концентраций токсикантов и начальных этапах токсического воздействия. Выявлены сайты воздействия меди и серебра в ФСII, ФСI и цепи переноса электронов между ними у Scenedesmus quadricauda и Chlamydomonas reinhardtii в зависимости от времени воздействия и концентрации токсикантов.
У водорослей после часовой экспозиции с токсикантами в их низкой концентрации установлено появление доли QB-невосстанавливающих центров (VJ), при которых снижалась вероятность электронного транспорта за переделы QA– (Eo), а также выявлено снижение квантового выхода электронного транспорта в ФСII (Eo), индекса производительности (PIABS), отражающего снижение функциональной активности ФСII, и замедление скорости восстановления Р700+.
При воздействии высоких концентраций токсикантов обнаружено нарушение электронного транспорта не только на акцепторной стороне ФСII, но и на донорной стороне между кислород-выделяющим комплексом (КВК) и РЦ, а также выявлено снижение скоростей фотоиндуцированного окисления и восстановления Р700, и увеличение диссипации энергии в тепло (Dlo/RC). Обнаружено появление медленной компоненты восстановления Р700+, свидетельствующей об активации циклического электронного транспорта. Также при высоких концентрациях выявлено снижение энергизации мембран, связанное с уменьшением как электрической, так и химической составляющей электрохимического потенциала. Увеличение времени контакта водорослей с токсикантами в их низкой концентрации вызывает нарушения, аналогичные таковым при часовом воздействии высоких концентраций.
Впервые получены вертикальные профили распределения параметров
быстрых индукционных кривых флуоресценции фитопланктона в
меромиктических водоемах. Впервые показано, что в слоях с наибольшей концентрацией фитопланктона, приуроченных к верхней границе хемоклина, несмотря на присутствие сероводорода функциональное состояние водорослей лучше такового у фитопланктона в выше лежащей аэробной зоне. При этом фотосинтетическая активность водорослей в слое наибольшего обилия
варьировала между водоемами и зависела от доминирующего вида. При
доминировании криптофитовых водорослей (Rhodomonas sp. и Cryptomonas sp.)
зафиксирована высокая активность фотосинтетического аппарата, что
проявлялось в величинах квантового выхода фотохимии ФСII (Fv/Fm), соответствующих максимально возможному, а также в высокой функциональной активности ФСII (PIABS), высокой доле активных РЦ (ABS/RC) и высоких значениях показателей электронного транспорта (Eo) в ФСII. При доминировании зеленых или эвгленовых водорослей значения показателей были ниже, чем при доминировании криптофитовых, а также ниже таковых, регистрируемых в культурах зеленых водорослей на экспоненциальной стадии роста.
Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные в работе данные позволили подробно и целостно оценить функциональную активность как отдельных фотосистем, так и переносчиков в цепи электронного транспорта между ними, а также уровень энергизации тилакоидных мембран при воздействии токсических веществ на культуры водорослей Chlamydomonas reinhardtii и Scenedesmus quadricauda с помощью одновременной регистрации параметров быстрой и замедленной флуоресценции. Полученные данные являются ценным источником информации о начальных стадиях воздействия токсикантов на процессы преобразования поглощенной энергии в световых реакциях фотосинтеза, что существенно расширяет границы существующих знаний.
Результаты настоящей работы используются в учебном процессе кафедры биофизики Биологического факультета МГУ, в частности в проведении практикума по экологической биофизике на Звенигородской биологической станции МГУ и большого практикума кафедры биофизики.
Научно-методологические подходы анализа быстрой индукции
флуоресценции внедрены в исследования, проводимые в Институте морских биологических исследований (ФГБУН ИМБИ РАН) в г. Севастополе. Предложено использовать метод быстрых индукционных кривых флуоресценции хлорофилла для оценки фотосинтетических процессов природного фитопланктона.
Представленные результаты могут быть использованы при проведении мониторинга водной среды, биотестирования, а также в биотехнологических работах с использованием микроводорослей.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на научных
конференциях: международной молодежной конференции «Биофизика
биоэнергетических процессов» (ЗБС МГУ, 2013); международной конференции «Photosynthesis Research for Sustainability – 2014» (Пущино, 2014); III Международной молодежной научно-практической конференции «Морские исследования и образование» (Москва, 2014); международной школе-конференции «White Sea Student Workshop of Coastal Waters» (ББС МГУ, 2014); всероссийской конференции «V съезд биофизиков России» (Ростов-на-Дону, 2015); всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Морские биологические исследования: достижения и перспективы»
(Севастополь, 2016). Результаты работы докладывались и обсуждались на
научных семинарах кафедры биофизики Биологического факультета МГУ.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 статей в журналах, из них 5 в рекомендованных ВАК и 3 цитируемые в международных базах данных Scopus и WoS, а также 7 материалов конференций.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследования и обсуждений, заключения, выводов, списка условных сокращений и обозначений, списка цитируемой литературы и приложений. Список литературы включает 203 источника, из которых 154 на английском языке. Работа изложена на 129 страницах машинного текста (в том числе 8 страниц в приложении), содержит 63 рисунка (в том числе 6 в приложении) и 8 таблиц (в том числе 3 в приложении).
Механизм генерации быстрой флуоресценции хлорофилла а в фотосинтетических мембранах
Для изучения световых реакций фотосинтеза широкое распространение получили флуориметрические методы (обзоры Lazar, 2003; Strasser et al., 2004; Govindjee, 2004), позволяющие получать информацию с интактного объекта в режиме реального времени. Это связано, главным образом, с развитием технологической базы и разработки различных методологических подходов к регистрации флуоресценции, что позволяет получать информацию с отдельных интактных клеток водорослей. Данный метод чрезвычайно важен в экологических исследованиях для получения экспресс данных в режиме реального времени, непосредственно в среде обитания in situ.
Как отмечалось ранее в тексте, первичным актом запасания энергии при фотосинтезе является поглощение квантов света молекулами фотосинтезирующих пигментов. В поглощении света у высших растений и водорослей участвуют три группы пигментов: каротиноиды, хлорофилл а и хлорофилл b; все они связаны с белковыми комплексами. Поле поглощения кванта света молекулами пигментов энергия возбуждения переносится по пигментной антенне к активным реакционным центрам. Однако не вся эта энергия используется в реакциях фотохимического преобразования в энергию разделенных зарядов в реакционных центрах ФСII и ФСI, часть переносимой энергии по антенне не достигает реакционного центра, рассеивается по колебательным степеням свободы в тепло или излучает квант света в красной области спектра, т.е. флуоресцирует (Говинджи, 1987).
Флуоресценция высших растений и водорослей испускается хлорофиллом а, находящимися преимущественно в антенных комплексах ФСII (Krause, Weis, 1991). Энергия же возбужденного состояния молекул хлорофилла b с высокой эффективностью (100%) передается на молекулы хлорофилла а, соответственно, из-за высокой скорости миграции энергии на хлорофилл, вспомогательные пигменты не флуоресцируют, за исключением фикобилипротеинов (Glazer, 1984). Эффективность и направленность миграции энергии по фотосинтетической пигментной матрице во многом зависит от локализации молекул пигмента в пределах пигмент-белкового комплекса (ПБК) и от взаиморасположения различных ПБК в фотосинтетической мембране (Рубин, 2013). Эти условия определяют перенос энергии между молекулами пигментов. Перенос энергии между молекулами хлорофилла а описывается резонансным механизмом, согласно которому поглощенная энергия стекает по антенному комплексу и передается к реакционным центрам ФСII и ФСI (Говинджи, 1987). Энергия возбуждения от периферических светособирающих комплексов с высокой эффективностью переносится на молекулы хлорофилла антенных комплексов реакционных центров, где затем используется в первичных реакциях фотохимического преобразования энергии.
Поглотив квант света, валентный электрон в молекуле хлорофилла переходит из основного (невозбужденного) состояния в возбужденное, т.е. переходит на более высокий энергетический уровень (Рис. 3). Для молекулы хлорофилла существуют два вероятных колебательных подуровня возбужденного электронного состояния: более высокий S 2 (при поглощении кванта синего излучения) и более низкий S i (при поглощении кванта красного излучения), что определяет в спектре поглощения хлорофилла два главных пика (Маторин, Рубин, 2012) (Рис. 3). При поглощении кванта синего света электрон за время 10"13 с переходит на нижний колебательный подуровень, т.е. релаксирует (внутренняя конверсия) в первое синглетное возбужденное состояние, не успев совершить химическую работу. С нижнего колебательного подуровня электрон возвращается в основное состояние (So) примерно за время 10"9 с, энергия которого расходуется в нескольких дезактивационных процессах первого порядка и квантовый выход равен соотношению константы флуоресценции к сумме констант дезактивационных процессов энергии электронного возбуждения: к, Я Р = , (1) К + К + к где Kf, Kd, Kp – константы скоростей излучения квантов флуоресценции, внутренней конверсии энергии возбуждения в тепло и фотохимической реакции. Максимум излучения флуоресценции хлорофилла а находится в более длинноволновой области спектра, чем максимум поглощения. Максимальная флуоресценция молекул хлорофилла в растворе петролейного эфира наблюдается при 668 нм, а максимум поглощения приходится на 663 нм. Это явление получило название сдвиг Стокса. В листьях максимум флуоресценции при комнатной температуре наблюдается около 685 нм (Холл, Рао, 1983) и продолжается до 800 нм (Krause, Weis, 1984).
Уровень флуоресценции во многом зависит от окислительно-восстановительного состояния первичного акцептора хинонной природы QA, наличия или отсутствия фотоповрежения протеинов и степени деэпоксидации ксантофиллов, входящих в состав ФСП (Корнеев, 2002). В оптимальных условиях, при открытых реакционных центрах ФСII, когда первичный акцептор QA окислен, константа Кр является наибольшей из остальных трех констант, соответственно, энергия поглощенных квантов света используется в фотосинтезе, при этом часть энергии возбуждения ( 0,3%) теряется в виде флуоресценции за время переноса возбуждения к реакционному центру. Выход флуоресценции при открытых реакционных центрах минимален (Fo) и равен (1).
Интенсивность флуоресценции при открытых реакционных центрах называют постоянной флуоресценцией, которая связана с потерями энергии по пигментной антенне к реакционному центру ФСII. При закрытых реакционных центрах ФСII энергия не используется в фотосинтезе (Кр = 0) и квантовый выход флуоресценции существенно выше (FM), чем для ФСП с QA в окисленном состоянии и равен: cpF = Кf l(K f + Kd)
Разница между интенсивностью флуоресценции при закрытых (Fm) и открытых (Fo) реакционных центрах является переменной флуоресценцией хлорофилла (Fv), соответствующей той части поглощенной световой энергии, которая используется открытыми реакционными центрами в фотохимических реакциях (Krause, Weis, 1991). Отношение Fv/Fm, полученное из выражений для выхода флуоресценции при открытых (1) и закрытых реакционных центрах (2), является квантовым выходом использования энергии света открытыми реакционными центрами и отражает эффективность функционирования ФСII.
При полном окислении акцептора QA в кинетике затухания преобладает компонент со временем затухания 100 - 200 пс, который отражает перенос энергии от антенны к реакционному центру. При закрытых реакционных центрах, когда акцептор QA восстановлен, появляются долгоживущие компоненты (1-2 нс), соответствующие переменной флуоресценции (Климов и др., 1978). Увеличение квантового выхода флуоресценции связано с образованием первичной ион-радикальной пары Р68о+Фео, за которой далее следует вторичная реакция переноса электрона с Фео– на QA за время около 200 пс. Окисленный Р680+ восстанавливается от вторичного донора электронов Z (остаток кислоты тирозин белка D1), а Фео окисляется акцептором QA. В результате образуется состояние Р680QA–, т.е. закрытое состояние, при котором реакционный центр не может использовать поглощенную световую энергию в реакциях фотосинтеза, и вся энергия возбужденных состояний хлорофилла излучается в виде флуоресценции и рассеивается в тепло.
Регистрация индукционных кривых быстрой, замедленной флуоресценции и редокс превращения РЦ ФСI – Р700 (при 820 нм) на М-РЕА-2
Вторая медленная фаза (от секунд до десятков минут) включает переходы P-S-M и связана с развитием нефотохимического тушения флуоресценции, наблюдаемым после максимума Р (Lazar, 2006). Переходы на индукционной кривой флуоресценции отражают изменения суммарной восстановленности QA, зависящей от кинетики окислительно-восстановительных реакций между различными компонентами ЭТЦ (Stirbet et al., 2014).
При включении света наблюдается подъем флуоресценции до начального уровня Fo, который соответствует «открытому» состоянию РЦ и уровню О (20 или 50 мкс) на индукционной кривой. В «открытом» состоянии РЦ способны тушить флуоресценцию, т.е. все молекулы QA могут принять электрон от Р680. При освещении все молекулы QA постепенно восстанавливаются до уровня Р, (т.е. максимальной флуоресценции Fm, когда все активные РЦ «закрыты»). Между уровнями О и Р, наблюдаемые уровни или перегибы, отражают изменения суммарной восстановленности молекул QA, зависящей от кинетики окислительно-восстановительных реакций между различными компонентами ЭТЦ (Stirbet et al., 2014). Во время фазы O-J происходит восстановление акцепторной стороны ФСII, т.е. наблюдается постепенное восстановление QA. Относительная амплитуда и начальный наклон этой фазы зависят от числа фотонов, поглощенных исследуемым объектом. На данном уровне РЦ ФСII в основном находятся в состояниях QAQB, QA–QB и QA–QB–. Краткосрочное снижение интенсивности флуоресценции после J отражает реокисление QA– и накопление Р680+. На O-J фазу влияет фактор гетерогенности ФСII, связанный со способностью восстанавливать QB, а также с расположением ФСII в мембране. ФСII содержит как QB-восстанавливающие, так и QB-невосстанавливающие центры. Так, известно, что в присутствии диурона (DCMU) происходит быстрый рост амплитуды фазы O-J, поскольку в этих центрах затруднен отток электронов от QA на QB (Lazar, 2006). В ФСII выделяют два типа центров: димерные суперкомплексы (ФСII), расположенные в гранальных тилакоидах, и мономерные – (ФСII), доминирующие в стромальных ламеллах, -центры в отличие от -центров имеют антенны большего размера, а также они экситонно связаны. В -центрах скорость переноса электронов в пул хинонов более низкая, чем в -центрах. Наличие -центров приводит экспоненциальному росту O-J, поскольку -центры энергетически несвязаны друг с другом, в отличие от -центров, при которых O-J фаза имеет сигмоидальный вид за счет экситонной связанности единиц.
Дальнейший рост флуоресценции во время фазы J-I-P связывают с восстановлением пула пластохинонов (6 – 12 молекул пластохинона на молекулу ФСII) за счет переноса электронов от ФСII (Stirbet et al., 2014). Во время данной фазы происходит накопление QA– при различных состояниях пула хинонов. На уровне I центры ФСII находятся в состояниях QA–QB и QA–QB2– и в то же время остается небольшая доля открытых РЦ, которые постепенно редуцируются во время фазы I-P. В фазе I-P происходит постепенное уменьшение последующих акцепторов ФСI и полная редукция пластохинонового пула. Считается, что во время фазы J-I происходит восстановление быстрого пула хинонов, расположенных в гранальных тилакоидах, а во время I-P фазы восстанавливается медленный пул хинонов, расположенный в стромальных тилакоидах (Joliot et al., 1992).
В точке Р флуоресценция достигает своего максимума, когда РЦ ФСII переходят в закрытое состояние. После достижения максимума Р флуоресценция снижается до уровня S, за которым следует медленная фаза SMT. Спад между уровнями Р и S связывают с ускоренной передачей энергии возбуждения от ФСII к ФСI и формированием протонного градиента за счет увеличения протонов во внутреннем пространстве тилакоидов. Фаза Р-S связана с зависимым от энергии тушением (qE), который является основным компонентом нефотохимического тушения. qE активируется за счет трансмембранного градиента протонов в ходе фотосинтетического электронного транспорта и в конечном итоге приводит к диссипации излишней энергии возбуждения в форме тепла. В процессах рН-зависимого нефотохимического тушения участвуют белок PsbS, эпоксидные соединения ксантофилового цикла зеаксантин и антераксантин, СР26 и СР29, минорные светособирающие комплексы ФСII (Корнеев, 2002; Stirbet et al., 2014).
На индукционной кривой также могут наблюдаться дополнительные пики, заметные после математической обработки кривых, так в области 200–300 мкс наблюдается рост флуоресценции, известный как пик К. Появление данного пика происходит при воздействии определенных стрессовых условий (высокая температура, высокая интенсивность света, дефицит азота), когда ингибируется процесс расщепления воды и блокируется перенос электрона между КВК и тирозином (TyrZ) (Strasser et al., 2004). При инактивации КВК флуоресценция возрастает, как и при нормальных условиях: QA получает электрон после разделения зарядов между Р680 и Фео, а Р680+ восстанавливается от TyrZ. Однако при инактивации КВК Р680+ не может быть восстановлен во второй раз и TyrZ+ остается окисленным. Тушение флуоресценции происходит за счет Р680+, а также в результате быстрой рекомбинации QA– и Р680+, приводящей к появлению пика К (Stirbet et al., 2014).
Рост флуоресценции между уровнями флуоресценции О и К (пик L) отражает степень энергетического взаимодействия между РЦ ФСII. Исследуемый объект представляет собой смесь открытых и закрытых РЦ. Эффективность фотосинтетических реакций в данных центрах будет зависеть от возможности переноса экситона от антенных комплексов закрытых РЦ к открытым. Численно взаимодействие между единицами ФСII на уровне антенных комплексов можно выразить с помощью коэффициента p2G, подробно описанного в работах (Strasser et al., 2004; Stirbet et al., 2014; Гольцев и др., 2014).
Появление OJIP переходов в определенные временные моменты на индукционной кривой позволяет рассчитать ряд параметров флуоресценции с помощью, так называемого JIP-теста (Strasser et al., 2004), основанного на теории энергетических потоков в мембранах, которая отражает баланс между притоком и оттоком энергии и дает информацию о вероятной судьбе поглощенной энергии (Strasser, 1978, 1981). Эта теория сформулирована в общем виде и может быть применена к любой анализируемой пигментной системе в любом типе фотосинтезирующиз мембран. В JIP-тесте используются следующие данные индукционной кривой флуоресценции, полученные непосредственно из измерения флуоресценции: а) интенсивность флуоресценции при 20 или 50 мкс, 100 мкс, 300 мкс, 2 мс, 30 мс и 1 с; б) время, необходимое для достижения максимальной флуоресценции (TFm); в) площадь над индукционной кривой до уровня Fm (Am или Area) (Рис.4) (Strasser et al., 2004).
Анализ OJIP кривых с помощью JIP-теста проводится по нескольким группам биофизических параметров, среди которых выделяют: энергетические потоки, которые рассчитываются на единицу возбуждаемой поверхности фотосинтезирующего объекта (феноменологические потоки) или на один активный РЦ ФСII (специфические потоки); квантовые выходы, показывающие отношение количества перенесенных электронов на определенном этапе световой фазы к числу поглощенных квантов света ФСII; эффективности, отражающие вероятности переноса электронов через определенный участок ЭТЦ; продуктивности работы фотосинтетического аппарата, которые представляют произведения частных потенциалов на определенных этапах преобразования энергии (Гольцев и др., 2014).
Энергетические потоки включают ряд параметров, отражающих поток, поглощенный антенной (ABS – «absorption flux»), поток энергии, захваченный РЦ и ведущий к фотохимической редукции QA (TR0 – «trapping flux»), электронный транспорт (реокисление QA–) (ET0 – «electron transport flux»), рассеивание энергии в виде тепла или флуоресценции (Dl0 – «dissipation flux»), поток электронов, переносимый через один активный РЦ и редуцирующий крайние акцепторы ФСI (RE0) (Рис.4). Энергетические потоки выражаются по отношению к активному РЦ (специфические потоки – RC), т.е. QA восстанавливающему, либо относятся к площади возбуждаемой поверхности (феноменологические потоки – CS). Индекс «0» обозначает, что значения берутся в начальный момент времени после включения света, т.е. при t = 0 (Рис.7).
Влияние солей меди (CuSO4) на изменение индукционных кривых быстрой, замедленной флуоресценции и окислительно-восстановительного превращения P700 зеленой водоросли Scenedesmus quadricauda
При воздействии ингибиторов наблюдали изменение индукционных кривых ЗФ (Рис. 19). Известно, что во время быстрой фазы, начинающейся подъемом свечения к максимуму I1 и заканчивающейся минимумом D2, происходит наработка электрического потенциала на мембране, обусловленная окислением Р700 и накоплением РЦ в состоянии S3ZP680+QA– и S3ZP680QA–. Медленная фаза от минимума D2 и продолжающаяся до достижения интенсивности ЗФ светового стационарного уровня, связана с образованием градиента протонов на мембране (Гольцев и др., 2014). На рисунке 19 (А) представлены индукционные кривые ЗФ в микросекундном временном диапазоне (0 – 0,09 мкс) контрольной культуры и культур, обработанным ингибиторами. Известно, что ЗФ в данном временном диапазоне определяется активностью КВК, т.е. донированием электрона от тирозина Z к окисленному Р680+, и является результатом рекомбинации зарядов РЦ в состоянии S3ZP680+QA– (Гольцев и др., 2014). Как видно из представленного рисунка, при воздействии ингибиторов наблюдали снижение нарастания интенсивности флуоресценции к пику I1. Известно, что увеличение флуоресценции до максимума I1 отражает образование РЦ в состоянии S3ZP680+QA– в результате перехода КВК из состояния S1 в S3 после поглощения двух квантов света, при котором в состоянии S3 наблюдается существенное излучение ЗФ в течение всего S-цикла (Buchta et al., 2007; Strasser et al., 2010). Снижение пика I1 было, вероятно, обусловлено снижением образования РЦ в состоянии S3ZP680+QA–, в частности при воздейсвтии гидроксиламина, который взаимодействует в основном с КВК в состояниях S2 и S3, и усиливает их релаксацию в состояние S1 (Sharp, Yocum, 1981). На рисунке 19 (Б) представлены индукционные кривые ЗФ в субмиллисекундном временном диапазоне (0,01 – 0,1 мс), связанные с процессами переноса электронов на акцепторной стороне ФСII. Кинетика затухания в этом временном диапазоне генерируется РЦ в состоянии Z+P680QA–QB и будет определяться реакциями по реокислению QA– следующим акцептором QB (Гольцев и др., 2014). Как видно из рисунка, в присутствии диурона отсутствуют быстрая и медленная фаза ЗФ. Это связано с тем, что в кинетике затухания ЗФ при воздействии диурона существует одна компонента, связанная с рекомбинацией между QA– и КВК в состояниях S2 и/или S3 из-за того, что QA– не может быть окислен дальнейшими переносчиками в результате ингибирования электронного транспорта (Rappaport et al., 2002). Как видно из рисунка 19 (Б) при воздействии ДБТХ происходило снижение интенсивности пика I2 вследствие ингибирования процессов по реокислению пула пластохинонов.
На рисунке 19 (В) представлены индукционные кривые в миллисекундном временном диапазоне (1 – 2,3 мс). Кинетика затухания в этом временном диапазоне определяется реакциями на донорной и акцепторной сторонах ФСII, связанными с исчезновением S3-состояний КВК и окислением QB= молекулами пластохинона (Гольцев и др., 2014). Как видно из рисунка, в присутствии ингибиторов отсутствовало нарастание флуоресценции в фазе D2 – I4. Это было связано со снижением образования градиента протонов, обусловленное ингибированием электронного транспорта в ФСII.
Таким образом, с помощью ингибиторного анализа изучена активность различных участков электрон-транспортной цепи по изменению параметров флуоресценции, измеренных одновременно на одном тест-объекте культуре водоросли S. quadricauda. Показано, что при воздействии диурона, ДБТХ и метилвиологена снижалось количество невосстановленных акцепторов электронов в ФСII (Sm). Это приводило к отсутствию медленной фазы в кинетике Р700, обусловленной ингибированием электронного транспорта на уровне ФСII (диурон и ДБТХ), а также искусственным акцептированием электронов (метилвиологен). При воздействии диурона происходит увеличение амплитуды фазы OJ с максимумом на уровне J в результате накопления доли QB-невосстанавливающих центров (VJ), которые приводят к снижению параметров Eo и Eo. Воздействие гидроксиламина гидрохлорида проявлялось в появлении пика К в районе 300 мкс между уровнями O и J. 3.2. Влияние солей меди (CuSO4) на изменение индукционных кривых быстрой, замедленной флуоресценции и окислительно-восстановительного превращения P700 зеленой водоросли Scenedesmus quadricauda
Соединения тяжелых металлов являются наиболее распространенными загрязнителями в водных экосистемах. Они ингибируют большинство физиологических процессов на разных уровнях метаболизма, оказывая негативное воздействие на биопродуктивность и состояние водоемов в целом. Среди тяжелых металлов, поступающих в водоемы с промышленными стоками, одними из наиболее токсичных для фитопланктона являются соединения меди (Bertrand, Poirier, 2005), соли которых используются в качестве альгицидов для борьбы с обрастаниями (Федоров, Даллакян, 1986; Плеханов и др., 1990). В ряде работ показано ингибирующее воздействие меди на фотосинтез (Fernandes, Henriques, 1991; Полынов и др., 1993; Perale-Vela et al., 2007; Антал и др., 2009; Wodala et al., 2012; Тодоренко и др., 2014; Cuchiara et al., 2015).
Исследовано влияние ионов меди на параметры флуоресценции пигментный состав и скорость роста культуры S. quadricauda. Показано, что после 1 часа инкубации изменений в спектрах поглощения при воздействии различных концентраций меди не наблюдалось. Спектры поглощения хлорофилла контроля и экспериментальных проб совпадали по максимумам и амплитуде (Приложение 3). Изменения в пигментном составе при воздействии меди наблюдали после продолжительной инкубации (24 ч). Изменение скорости роста регистрировали по параметру Fo, который был предварительно откалиброван по количеству клеток, подсчитанных в камере Горяева, согласно работе (Matorin et al., 2004). Показано, что в начальные часы инкубации соли меди не воздействовали на скорость роста культуры (Приложение 3), в то время как изменения в функциональном состоянии фотосинтетического аппарата по параметрам флуоресценции отмечались задолго до появления изменений в пигментном составе и скорости роста.
После часовой инкубации в присутствии солей меди наблюдали изменения амплитуды и формы индукционных кривых быстрой флуоресценции (OJIP) культуры S. quadricauda. При воздействии 20 и 50 мкМ солей меди наблюдали значительное подавление амплитуды ОР, что свидетельствует о снижении фотохимически активных РЦ ФСII. Снижение Fo (уровень О) при воздействии металлов может быть связано со структурными изменениями в ССКII (Murthy et al, 1990) или неспецифическим тушением возбужденного состояния хлорофилла (Arellano et al, 1995; Yruela et al., 1996b). Ранее было показано, что при длительном воздействии меди происходит снижение как Fo, так и Fm (уровень Р) у пресноводных и морских диатомовых водорослей (Rijstenil et al, 1994; Ivorra, 2000). После нормирования OJIP кривых на уровень О, т.е. F(t)/Fo - 1 в присутствии 20 мкМ солей меди происходило снижение фазы ГР, обусловленной снижением переноса электрона между фотосистемами, тогда как при 50 мкМ наблюдали подавление фазы ЛР (Рис. 20 А). Это свидетельствует о снижении фотохимии ФСП в результате нарушения электронного транспорта от ФСП в пул пластохинонов и к ФСІ. При воздействии 5 и 10 мкМ солей меди снижение вклада ЛР фазы наблюдали после суточной инкубации (Рис. 18 Б). Изменения в полифазном характере индукционной кривой быстрой флуоресценции при воздействии солей меди после часовой инкубации были получены после нормирования на амплитуду ОР. Таким образом, индукционные кривые были представлены в виде переменной флуоресценции в момент времени t: Vt = (Ft - Fo)/(Fm - Fo) и разности значений функций AVt = (Уцмедь) - У,(контРоль)) (Рис. 21 А, Б). На рисунке видно, что при воздействии 20 и 50 мкМ солей меди наблюдали существенный рост фаз OJ и 01.
Применение метода индукции быстрой флуоресценции хлорофилла а для оценки функционального состояния ФСА фитопланктона меромиктических водоемов Белого моря
В последнее время активно развивается направление биотехнологии, связанное с массовым культивированием водорослей в открытых бассейнах. При таком культивировании одним из факторов, влияющих на продуктивность водорослей, является воздействие ультрафиолетового излучения (УФ). Для постоянного мониторинга состояния водорослей при массовом культивировании перспективными считаются флуоресцентные методы (Saleh et al, 2014 a,b).
Из литературных данных известно, что УФ-излучение вызывает повреждения различных процессов в частности генетических и физиологических (Stapleton et al., 1992). В растительных клетках УФ-излучение разрушает пигменты, повреждает липиды и аминокислоты, нарушает процесс фотосинтеза (Sicora et al., 2003). Во многих исследованиях было показано снижение работы ФСII и ФСI под воздействием УФ-излучения (Okada et al., 1976; Карапетян, Бухов, 1985; Hermann et al., 1997). У фотосинтезирующих организмов хлорофилл и другие пигменты могут вносить значительный вклад в экранирование ДНК от фотоповреждений (Vass et al., 2005).
В настоящей работе с помощью быстрых индукционных кривых и редокс превращения Р700 исследован эффект УФ-С на первичные реакции фотосинтеза зеленой водоросли P. kessleri. Штамм P. kessleri культивировали на твердой питательной среде в трех чашках Петри. Водоросли в одной чашке облучали УФ-С с длиной волны 254 нм в течение 3 минут (штамм PC Mut2), а из второй – 10 минут (штамм PC Mut4). Водоросли из третей чашки рассматривались в качестве контроля (дикий тип). Штаммы переносили на жидкую питательную среду и культивировали 15 суток. У штаммов PC Mut2 и PC Mut4 обнаружены изменения в протекании реакций в ФСII и ФСI. На рисунке 48 представлены индукционные кривые быстрой флуоресценции (OJIP) в виде (Ft – Fo)/FI после нормирования на амплитуду ОI. Как видно из представленного рисунка, у штаммов, облучавшихся в течение 10 минут, наблюдали снижение амплитуды ОР по сравнению с диким типом, главным образом, за счет снижения Fm. Подавление амплитуды ОР обусловлено инактивацией РЦ (ABS/RC). У культур, облучавшихся УФ-С, наблюдали значительное снижение первичной фотохимической реакции в ФСII (Fv/Fm) по сравнению с диким типом (Рис. 53). УФ-излучение, воздействуя на РЦ, усиливало сброс поглощенной энергии в тепло, что вызывало тушение переменной флуоресценции, а также приводило к росту величины параметра флуоресценции Dlo/RC (Рис. 53). Усиление сброса энергии в тепло (Dlo/RC), вероятно, связанно с регуляторными механизмами защиты штаммов против УФ-С ингибирования, тогда как в клетках дикого типа диссипация поглощенной энергии была минимальной (Рис. 53).
Индукционные кривые быстрой флуоресценции (OJIP) дикого типа P. kessleri и штаммов, облучавшихся в течение 3 (PC Mut2) и 10 (PC Mut4) минут УФ-С. Индукционные кривые представлены в виде (Ft – Fo)/FI после нормирования на амплитуду ОI.
Спектры поглощения суспензий дикого типа P. kessleri (1) и штаммов, облучавшихся в течение 3 (PC Mut2) (2) и 10 (PC Mut4) (3) минут УФ-С. Спектры поглощения нормировались на максимум поглощения хлорофилла а при 675 нм. Рис. 50. Спектры флуоресценции при возбуждении 430 нм дикого типа P. kessleri (1) и штаммов, облучавшихся в течение 3 (PC Mut2) (2) и 10 (PC Mut4) (3) минут УФ-С. Спектры флуоресценции нормировались на максимальные значения флуоресценции при 690 нм.
Спектры флуоресценции при возбуждении 720 нм дикого типа P. kessleri (1) и штаммов, облучавшихся в течение 3 (PC Mut2) (2) и 10 (PC Mut4) (3) минут УФ-С. Спектры флуоресценции нормировались на максимальные значения флуоресценции при 690 нм.
Одним из механизмов защиты фотосинтезирующих организмов от УФ-излучения является накопление фотозащитных пигментов каротиноидов, которые способны перехватывать значительную часть света, снижая риск фотоокислительного повреждения (Соловченко, Мерзляк, 2008). Так, у штамма PC Mut4, облучавшегося в течение 10 минут УФ-С, наблюдали увеличение поглощения в области каротиноидов (Рис. 49). Изменения в спектрах возбуждения флуоресценции также отмечались в коротковолной области ФАР, спектр которых был больше у штаммов PC Mut2 и PC Mut4 по сравнению с диким типом (Рис. 50, 51). Предполагаем, что продолжительное воздействие УФ-С излучения на P. kessleri связано с синтезом вторичных каротиноидов, участвующих в экранировании ФСА. представлены индукционные кривые в виде переменной флуоресценции в момент времени t: Vt. Как видно из рисунка, у штаммов PC Mut2 и PC Mut4 наблюдали изменения в форме индукционных кривых. Наиболее заметные изменения были отмечены в увеличении роста амплитуды OI в основном за счет вклада фазы OJ. Наблюдаемый рост фазы OJ у штаммов PC Mut2 и PC Mut4 по сравнению с диким типом, сопровождающийся увеличением пика J, обусловлен замедлением скорости переноса электронов с акцепторной стороны ФСII в результате более быстрого восстановления QA. Результаты проведенного JIP-теста (Рис. 53) свидетельствуют о снижении электронного транспорта на акцепторной стороне ФСII (Eo) и, как следствие, более быстром закрытии РЦ (Мо) за счет появления доли QB-невосстанавливающих центров (VJ). Полученные данные по кинетикам затухания флуоресценции подтверждают появление таких центров.
На рисунке 54 представлены кинетики затухания флуоресценции затухания дикого типа P. kessleri и штаммов, облучавшихся в течение 3 (PC Mut2) и 10 (PC Mut4) минут УФ-С, которые аппроксимировали суммой двух экспонент, одна из которых связана с захватом энергии (быстрая компонента), а другая – со стабилизацией зарядов и рекомбинацией в РЦ ФСII (медленная компонента) (Volgusheva et al., 2007). Как видно из таблицы 5, у дикого типа обнаружена быстрая компонента со временем затухания 1 = 1 нс и амплитудой 40% и медленная компонента – 2 = 2,24 и амплитудой 60%. Время затухания быстрой компоненты у штаммов, облучавшихся УФ-С, составило 1 нс. Относительная амплитуда быстрой комоненты была снижена у штаммов PC Mut2 и PC Mut4 по сравнению с диким типом, которая для PC Mut2 составила 37%, а для PC Mut4 – 28%. Время затухания и амплитуда медленной компоненты у PC Mut4 значительно увеличивались по сравнению с диким типом. Это связано с накоплением восстановленного QA в результате появления QB-невосстанавливающих центров.
Об этом также свидетельствует снижение максимальной скорости нециклического электронного транспорта (rETRmax) (Рис. 55). Из рисунка видно, что rETRmax у штаммов PC Mut2 и PC Mut4 снижалась по сравнению с диким типом, причем у PC Mut4 величина rETRmax была в большей степени снижена, чем у PC Mut2. Снижение величины параметра rETRmax является результатом снижения скорости реокисления QA последующим акцептором QB.
У штаммов PC Mut4 обнаружена низкая активность ФСI по сравнению с диким типом и PC Mut2. Ранее отмечалось, что ФСI и цитохром b6/f менее подвержены воздействию УФ по сравнению с ФСII (Turcasnyi et al., 2000; Hollosy, 2002). На рисунке 56 светоиндуцированные переходы РЦ ФСI – P700 дикого типа P. kessleri и штаммов, облучавшихся в течение 3 (PC Mut2) и 10 (PC Mut4) минут УФ-С. Как видно из представленного рисунка, штамм PC Mut2 способен к процессам окисления и восстановления Р700 в отличие от PC Mut4, у которого наблюдали нарушения редокс активности Р700. После нахождения максимальных скоростей окисления (Vox) и восстановления (Vred) Р700 показано, что у PC Mut4 Vox значительно замедлялась по сравнению с диким типом. Это свидетельствует о нарушении электронного транспорта между Р700 и первичными акцепторами в ФСI. Снижение Vred у PC Mut4 обусловлено снижением потока электронов от ФСII в результате нарушения электронного транспорта на акцепторной стороне ФСII. Полученные данные согласовывались с параметром JIP-теста Ro, отражающими снижение эффективности восстановления переносчиков на акцепторной стороне ФСI.