Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Диагностика качества окружающей среды с использованием биологических методов анализа 11
1.1 Использование биологических методов для оценки качества окружающей среды 11
1.2 Клеточный биомониторинг состояния окружающей среды 20
1.3 Биологические особенности инфузорий, использующихся в качестве индикаторных организмов 24
1.4 Основные методы и приборы, используемые для регистрации тест-реакций простейших одноклеточных организмов 29
Глава 2 Методы исследования 38
2.1 Методика подготовки простейших одноклеточных организмов, используемых в биоиндикационных исследованиях 38
2.1.1 Особенности культивирования инфузорий Paramecium caudatum 38
2.1.2 Особенности культивирования инфузорий Tetrahymena pyriformis. 41
2.2 Методика подготовки объектов окружающей среды. 43
2.2.1 Подготовка посуды для отбора проб 44
2.2.2 Подготовка проб воды для биотестирования 44
2.2.3 Подготовка проб почвы для биотестирования 46
2.2.4 Подготовка кислотных вытяжек почв 48
2.3 Методика подготовки автоматизированной биотехнической системы «Биолат-2» к проведению биотестирования 49
2.4 Методика проведения физико-химических исследований 51
2.5 Методика биотестирования модельных растворов тяжелых металлов 52
2.6 Методика биотестирования модельных растворов, содержащих нефтепродукты 52
2.7 Методика биотестирования модельных растворов, содержащих СПАВ 53
2.8 Методика биотестирования модельных растворов, содержащих фенол 53
2.9 Методика проведения биотестирования образцов почвы и воды 53
2.10 Статистическая обработка полученных результатов 55
Глава 3 Результаты собственных исследований 56
3.1 Совершенствование методики подготовки инфузорий к биотестированию с применением автоматизированной биотехнической системы «Биолат-2» 56
3.2 Сравнительная характеристика чувствительности инфузорий к отдельным факторам окружающей среды с использованием автоматизированной биотехнической системы «Биолат-2» 62
3.2.1 Сравнительная характеристика чувствительности инфузорий к ионам тяжелых металлов 62
3.2.2 Сравнительная характеристика чувствительности инфузорий к органическим экотоксикантам 65
3.3 Использование автоматизированной биотехнической системы «Биолат-2» для комплексной оценки качества окружающей среды в санитарно-защитной зоне полигона ТБО 71
3.3.1 Характеристика полигона ТБО. 71
3.3.2 Исследование интегральной токсичности почв в границах санитарно-защитной зоны полигона ТБО 72
3.3.3 Исследование интегральной токсичности фильтрата и поверхностных вод полигона твердых бытовых отходов. 81
Заключение 91
Выводы 95
Библиографический список 98
Приложение
- Клеточный биомониторинг состояния окружающей среды
- Основные методы и приборы, используемые для регистрации тест-реакций простейших одноклеточных организмов
- Методика подготовки автоматизированной биотехнической системы «Биолат-2» к проведению биотестирования
- Сравнительная характеристика чувствительности инфузорий к отдельным факторам окружающей среды с использованием автоматизированной биотехнической системы «Биолат-2»
Введение к работе
Актуальность проблемы
Объективная интегральная информация о качестве окружающей среды с каждым днем становится все более востребованной В настоящее время оценка загрязнения объектов окружающей среды (воды, почвы, воздуха) производится главным образом на основе результатов физико-химического анализа Однако из-за огромного числа загрязняющих веществ, источников и выбросов, а также сложности и высокой стоимости химических анализов организовать эффективный экологический мониторинг средствами аналитической химии не всегда возможно
Многие загрязняющие вещества, попадая в окружающую среду, могут претерпевать в ней различные превращения, усиливая при этом свое токсичное действие Результирующий отклик биологической системы на комбинированное воздействие экотоксикантов нельзя предвидеть исходя только из информации о результатах физико-химического анализа или эффектах их раздельного действия По этой причине наиболее востребованными оказались методы интегральной оценки качества экосистемы и отдельных ее компонентов (воды, почвы, воздуха), в том числе и биотестирование
Наиболее часто в качестве биотестов используются бактерии и инфузории Чувствительность этих организмов и достоверность результатов биотестирования во многом зависят от условий их культивирования и подготовки к исследованию, поэтому изучение и стандартизация условий культивирования биологических тест-объектов приобретает особую значимость и актуальность
Использование инфузорий для тестирования имеет свои преимущества, так они имеют короткий цикл размножения, так что быстро достигается высокая численность популяции, просты в содержании и достаточно чувствительны В аналитическом аспекте инфузории интересны тем, что могут рассматриваться как простые рецепторно-эффекторные системы, обладающие способностью реагировать на химическое воздействие целым комплексом биологических, физиологических и биохимических изменений Подвижность инфузорий является весьма чувствительным параметром к действию как физических (электрических и магнитных полей), так и химических факторов среды обитания
Однако в доступной нам литературе отсутствовали или были противоречивыми данные о чувствительности инфузорий к
\
конкретным экотоксикантам, а, следовательно, о возможности их использования для биотестирования конкретных объектов окружающей среды Это определило актуальность данного направления наших исследований
Для оценки результатов биотестирования чаще всего используются методы рутинной микроскопии Основным их недостатком являются трудоемкость и определенная субъективность, так как наблюдение за движущимися объектами часто затруднено В связи с этим актуальными становятся проблема автоматизации процесса биотестирования и повышение достоверности получаемых результатов С этой целью в Московском государственном университете прикладной биотехнологии разработано автоматизированная биотехническая система оценки безопасности различных объектов по реакциям инфузорий [Черемных Е Г, 2003] Однако данный прибор не прошел широкой апробации при биотестировании объектов окружающей среды Это также определяет актуальность настоящей работы
Цель и задачи исследования
Целью исследования является биотестовая оценка качества отдельных объектов окружающей среды с использованием автоматизированной биотехнической системы и простейших микроорганизмов
В связи с этим были поставлены следующие задачи
-
Совершенствование методики подготовки инфузорий к исследованиям с применением автоматизированной биотехнической системы
-
Сравнительная характеристика чувствительности инфузорий к отдельным факторам окружающей среды с использованием автоматизированной биотехнической системы
-
Проведение сравнительной интегральной оценки качества отдельных объектов окружающей среды с использованием автоматизированной биотехнической системы в санитарно-защитной зоне полигона ТБО
-
Разработка технологического регламента биотестирования с применением автоматизированной биотехнической системы
Научная новизна
-
Изучены способы стандартизации условий культивирования инфузорий видов Paramecium caudatum и Tetrahymena pynformis в лабораторных условиях
-
Впервые дана сравнительная характеристика чувствительности инфузорий Tetrahymena pynformis и Paramecium caudatum к наиболее распространенным экотоксикантам (ионы тяжелых металлов, нефтепродукты, СПАВ и фенолы)
-
Впервые выполнена биотестовая интегральная оценка качества почв и водных объектов в санитарно-защитной зоне полигона ТБО с использованием автоматизированной биотехнической системы Показано наличие зависимости между результатами химического анализа и биотестирования с применением инфузорий, получена новая информация относительно взаимосвязи между присутствием различных химических компонентов в объектах окружающей среды и величиной показателя токсичности этих объектов
4 Разработан технологический регламент биотестирования
отдельных объектов окружающей среды с применением
автоматизированной биотехнической системы
Практическая значимость диссертационной работы заключается в разработке технологического регламента биотестирования отдельных объектов окружающей среды с применением автоматизированной биотехнической системы Это способствовало стандартизации условий культивирования инфузорий Paramecium caudatum и Tetrahymena pynformis, поддержанию их стабильного состояния при подготовке к биотестированию и в период между экспериментами, повышению достоверности результатов биотестирования
Автоматизированная биотехническая система оценки реакции инфузорий Paramecium caudatum и Tetrahymena pynformis на присутствие экотоксикантов «Биолат-2» позволяет быстро и эффективно получать количественную характеристику безопасности различных объектов окружающей среды
Она может широко использоваться для мониторинговой оценки качества почвы, водных объектов, кормов и пищевых продуктов
Материалы диссертации использованы в ряде учебных курсов КГПУ им К Э Циолковского «Экологическая токсикология», «Техногенные системы и экологический риск», «Чрезвычайные ситуации в техногенных системах», «Экологический мониторинг», а
также при организации и проведении спецкурса «Биотестирование объектов окружающей среды».
Результаты работы используются в учебных курсах «Экология» и «Экологические основы природопользования» Калужского технологического колледжа
Личный вклад автора
Личный вклад диссертанта состоял в проведении экспериментальных исследований по оптимизации условий культивирования инфузорий Paramecium caudatum и Tetrahymena pynformis, а также в разработке технологического регламента биотестирования отдельных объектов окружающей среды с применением автоматизированной биотехнической системы «Биолат-2»
Автором лично выполнены исследования сравнительной чувствительности инфузорий Tetrahymena pynformis и Paramecium caudatum к наиболее распространенным экотоксикантам (ионы тяжелых металлов, нефтепродукты, СПАВ и фенолы)
Автором самостоятельно выполнена биотестовая интегральная оценка качества почв и водных объектов в санитарно-защитной зоне полигона ТБО с использованием автоматизированной биотехнической системы
Основные положения, выносимые на зашиту
На защиту выносятся
-
Культивирование инфузорий Paramecium caudatum и Tetrahymena pynformis в лабораторных условиях целесообразно осуществлять с учетом особенностей развития их популяций Это способствует поддержанию стабильной численности особей и сохранению их чувствительности к экотоксикантам
-
Инфузории Tetrahymena pynformis и Paramecium caudatum могут быть использованы для биотестирования воды и почв, загрязненных наиболее распространенными экотоксикантами (ионы тяжелых металлов, нефтепродукты, СПАВ и фенолы)
-
Результаты биотестовой оценки качества объектов окружающей среды с использованием автоматизированной биотехнической системы «Биолат-2» и интегральные показатели их химического загрязнения имеют выраженную корреляционную зависимость
-
Для стандартизации условий биотестирования отдельных объектов окружающей среды с применением автоматизированной
биотехнической системы «Биолат-2» необходимо использовать разработанный технологический регламент
Апробация работы
Основные результаты и положения диссертации были обсуждены на V Международной научно-практической конференции «Экология и безопасность жизнедеятельности» (Пенза, 2005), VII Международном конгрессе «Вода экология и технология ЭКВАТЕК» (Москва, 2006), Всероссийской научно-методической конференции «Подготовка конкурентоспособного специалиста в условиях модернизации профессионального образования» (Калуга, 2006), VI Всероссийской конференции по анализу объектов окружающей среды «Экоаналитика- 2006» (Самара,2006), на ученом совете Московского государственного университета прикладной биотехнологии (Москва, 2006), Всероссийской научно-практической конференции «Экология питания в экологии человека» (Калуга, 2006), I Международной интерактивной научной конференции «Современные аспекты химии, экологии и экологического образования» (Астрахань, 2007)
Публикации
По теме диссертации опубликовано 7 статей, из них 1 в журнале, рекомендованном ВАК («Проблемы региональной экологии», 2007)
Структура и объем работы
Диссертация состоит из введения, 3 глав, заключения, выводов, списка литературы и приложений Объем основного текста составляет 117 страниц машинописного текста, 21 рисунок, 12 таблиц Список литературы объединяет 209 наименований источников, из них 172 отечественных и 37 зарубежных авторов Объем приложения - 40 страниц
Клеточный биомониторинг состояния окружающей среды
Использование в системе первичных биологических испытаний организмов, принадлежащих к более низкому по сравнению с млекопитающими филогенетическому уровню, дает возможность значительно упростить прогноз некоторых видов активности и токсичности химических соединений. Первостепенное значение в современных условиях получают методы, основанные на реакции простейших животных, так как позволяют за короткий срок определить возможный круг свойств исследуемого вещества и дать ряд рекомендаций по целесообразности дальнейшего его исследования. Существенное значение имеет и тот факт, что биологические методы исследований с использованием простейших резко уменьшают время, необходимое для изучения свойств веществ, и имеют относительно невысокую стоимость. Замена теплокровных животных на одноклеточные организмы позволяет уменьшить время токсикологических и фармацевтических исследований с 1 года до 1 месяца, а расходы на их проведение сокращаются в десятки раз [Штина, 1990; Пшеничное, 1995; Керис, 1998].
Живые организмы, имеющие разный уровень организации, стоящие на различных ступенях иерархической лестницы в системе классификации, по-разному реагируют на действие токсичных веществ. Но все эти организмы объединяет то, что в основе их строения лежит «гениальное изобретение Природы» - клетка. Следовательно, все изменения, происходящие в организме, все реакции начинаются на клеточном уровне.
А.Л.Чижевский в 1931 году писал «...живая материя, те или иные клеточные образования являются чувствительнейшим реактивом по отношению к чрезвычайно малым дозам вещества и обнаруживают качественно и количественно различную возбудимость к различным веществам, в зависимости от химического состава и физического состояния».
В руководстве по краткосрочным тестам, изданном Всемирной организацией здравоохранения [Руководство..., Женева: ВОЗ, 1989], подчеркивается, что вот уже более ста лет культура клеток разного происхождения и вида успешно используется в медико-биологических исследованиях. Значимость этого метода при установлении токсичности исследуемых химических веществ и биологических соединений подтверждают дополнительные и комплементарные тесты.
В материалах 2-го и 3-го Всемирных конгрессов, состоявшихся в 1996 и 1999 годах в Нидерландах [ALTA Alternotives .., 1996; 1999], ЕВРОТОКСА 2001, проходившего в Стамбуле [Toxicology in vitro, 2001], приведены данные, свидетельствующие о высоких коэффициентах корреляции (более 0,7) и достаточной достоверности результатов (р 0,05) при определении зависимости между результатами, полученными на простых моделях, и величинами LD5o, полученными в опытах на лабораторных животных.
В теории и практике токсикологических исследований безопасности различных химических веществ перспективным является использование таких экспресс-методов, как цитотоксичность, тест на повреждение ДНК, определение микроядер в клетках костного мозга мышей, тест Эймса и др. [Animal Cell Culture, 1986].
Для определения цитотоксичности в однослойных культурах клеток различные авторы рекомендуют оценивать морфологические, цитохимические изменения, а также состояние ДНК и РНК. Причем изучение действия экотоксикантов на ДНК и РНК проводят, используя метод люминесцентной микроскопии. Для ДНК в норме характерно зеленое свечение, но под воздействием различных веществ её цвет изменяется в широком диапазоне [Методические рекомендации ..., 1979].
В тесте Эймса используют штаммы прокариотического организма Salmonella typhimurium: ТА 97, ТА 98 и ТА 100 [Оценка мутагенных свойств..., 1998]. Сущность метода заключается в регистрации способности исследуемого вещества и/или его метаболитов индуцировать реверс-мутации от ауксотрофности к прототрофности по гистидину у тестерных штаммов бактерий Salmonella thyphimurium, несущих his-мутации и не способных синтезировать гистидин [Методы первичного выявления.., 1985]. Для образования возможных метаболитов исследуемое вещество подвергают процессу биотрансформации с помощью ферментов микросомального окисления, содержащихся в постмитохондриальном супернатанте гомогената печени крыс - фракции S-9. Для этого бактерии Salmonella thyphimurium инкубируют вместе с исследуемым веществом, а также микросомальной активирующей смесью - S-9 mix (фракция S-9+Ко-факторы: НАДФ и глюкозо-6-фосфат) [Mortelmans, Zeiger, 2000; Будников, 1996].
Наличие мутагенного эффекта учитывают по индукции обратных мутаций от ауксотрофности к прототрофности по гистидину [Maron, Ames. 1983]. Содержание мутагенных веществ Вардуни [1997] рекомендует определять с использованием метода учета точечных мутаций.
В настоящее время для тестирования мутагенности окружающей среды нашел широкое применение микроядерный тест [Ильинских с соавт., 1988]. Этот метод основан на выявлении микроядер в эритроцитах млекопитающих [Оценка мутагенной активности.., 1984], в клетках эмбрионов [Титенко, Евсиков, 1977], корневой меристеме бобов [Rizzoni et al., 1995] и мейотических клетках традесканции [Ма, 1981; Fiskesjo, 1997; Илющенко, Щегольков, 1990; Евсеева, 1999; Евсеева, Зайнуллин, 2000].
Основные методы и приборы, используемые для регистрации тест-реакций простейших одноклеточных организмов
Методика регистрации тест-реакций простейших одноклеточных организмов различна и зависит от того, какие цели и задачи стоят перед исследователем. Но независимо от выбора тест-объекта и методики проведения анализа подсчет организмов чаще всего проводится с использованием микроскопии. Этот прием универсальный, но достаточно субъективный и трудоемкий, если речь идет о подсчете подвижных организмов, поэтому организмы фиксируют.
Наиболее общая схема проведения анализа на общую токсичность методами биотестирования изложена в ГОСТ Р 52337-2005. В эту схему входит экспресс-биотестирование параллельно водной и ацетоновой вытяжек из кормов на инфузориях стилонихиях (Stylonychia mutilus). Причем оценка общей токсичности основана на сравнении количества инфузорий в микроаквариумах (лунках) до введения пробы и через один час после введения.
В случае токсичности исследуемого образца стилонихии изменяют свою обычную вытянуто-овальную форму на округлую, а движение на беспорядочное с поворотом вокруг своей оси. Кроме того, они могут прекращать движение или подвергаться лизису, при этом количество лизированных клеток зависит от степени токсичности исследуемого образца.
Для биотестирования также применяют инфузории Colpoda steinii [ГОСТ 13496.7-97; Виноходов, 1995]. При этом используется сухая культура, которая представляет собой округлые цисты покоя. За 12-24 часа до анализа флаконы с культурой вскрывают, заливают питательную среду и ставят в термостат при температуре 26-28С. Критерием токсичности служит время от начала воздействия испытуемого раствора до гибели более 90% инфузорий. Факт гибели констатируют на основании прекращения движения и наличия лизиса клеток.
Исследуемый образец считается остротоксичным, если гибель инфузорий наступила в течение одного или трех часов исследования (в зависимости от вида анализируемого раствора). Если по истечении времени анализа большинство инфузорий остались подвижными, исследуемый образец считается нетоксичным.
В токсикологических исследованиях широко используются инфузории, относящиеся к роду Paramecium. Существуют разработанные способы оценки токсичности сточных вод [Селивановская и соавт., 1993], есть упоминания об использовании Paramecium caudatum в медицинских исследованиях [Лавров и соавт., 1986].
В методике оценки интегральной токсичности кормов на инфузориях Paramecium caudatum [Гроздов, 1994] регламентированы условия культивирования и проведения исследований. Для биотестирования используется 3-10-суточная культура. Оценку токсичности проводят аналогично тесту на стилонихиях: определяют процент выживаемости парамеций за три часа экспозиции. Гибель парамеций характеризуется потерей характерной веретенообразной формы, прекращением движения, наличием лизиса клеток.
В работе Гроздова приведена характеристика трех видов инфузорий: Stylonychia mutilus, Tetrahymena pyriformis, Paramecium caudatum.
Инфузории Tetrahymena pyriformis давно и успешно применяются для оценки токсичности различных объектов [Харатьян, 1973; Богдан, 1998; Козлов и соавт, 2004]. Разработана единая методическая схема комплексной оценки различных объектов на Tetrahymena pyriformis [Богдан, 1998]. Схема включает три этапа:
1. Первичная токсикологическая оценка - включает 96-часовую экспозицию исследуемых проб с популяцией инфузорий. В течение этого времени острая токсичность пробы наблюдается через 6 часов, через 24 часа - подострая, а через 48-96 часов - хроническая токсичность. По минимальным изменениям жизнедеятельности организмов без их гибели оценивается порог токсического действия.
2. При оценке объектов в хроническом эксперименте пробы исследуются в концентрациях, не проявивших выраженного токсического действия на предыдущем этапе. По закономерностям роста популяции в течение 96 часов (4 суток) можно определить адаптогенные свойства, иммуномодулирующее действие и мутагенную активность исследуемых объектов.
3. В пролонгированном эксперименте в течение 384 часов (16 суток) проводятся уточняющие исследования результатов. Оценка производится на основе анализа характера роста популяции и сравнения реакции на повышенные концентрации исследуемых проб опытной и контрольной популяции.
В исследуемые пробы после их стерилизации вносят по 0,05 см3 культуры Tetrahymena pyriformis и ставят в термостат на 1-4 суток. Наличие роста, его степень контролируют ежедневно под микроскопом (МБС-10) при увеличении 2x8. Это позволяет просматривать пробы прямо в пробирке без нарушения стерильности. Это является предварительным контролем. Затем на предметное стекло пастеровской пипеткой берут каплю и просматривают при увеличении 7x90. Угнетение подвижности, наличие гибели даже единичных особей или их деформация свидетельствует о токсичности пробы. Если необходимо, производят количественный подсчет выросших особей в счетной камере Фукса-Розенталя или Горяева [Метод, рекомендации, 1977].
В работе [Гроздов, 1994] автором сделан вывод о том, что любая методика, использующая инфузорий в качестве тест-организмов, может давать объективные результаты, если подготовленная проба продукта является представительной с точки зрения присутствия в ней токсических компонентов из исследуемого продукта.
Методика подготовки автоматизированной биотехнической системы «Биолат-2» к проведению биотестирования
Автоматизированная биотехническая система «Биолат-2» предназначена для оценки токсичности различных объектов с помощью биотестирования. В качестве одноклеточных тест-организмов используются инфузории. Оценка токсичности основана на регистрации изменения количества подвижных инфузорий в поле зрения микроскопа с помощью цифровой видеокамеры. Биолат позволяет в автоматическом режиме производить многократный подсчет подвижных тест-организмов и по окончании исследования оценку безопасности исследуемых объектов.
Автоматизированная биотехническая система «Биолат-2» (рис.3) представляет собой электромеханическое устройство, состоящее из узла цифровой видеокамеры (1), светодиодной подсветки (2), электронного узла согласования и механического узла (3) перемещения планшетки. Планшетка представляет собою диск с 20 стеклянными лунками (4).
Механический узел цифровой видеокамеры предназначен для преобразования оптической информации (изображение лунки с инфузориями) в электрический сигнал.
Механический узел перемещения планшетки предназначен для позиционирования емкостей (лунок) планшетки под объектив видеокамеры. Управление двигателем этого узла осуществляется через компьютерный порт LPT1 и электронный узел согласования.
В основе способа выявления реакции инфузории на исследуемые воздействия лежит сравнение их количества в лунках через заданные промежутки времени. Признаки, позволяющие объект идентифицировать как живой, - это размеры и самостоятельное перемещение. Скорость перемещения инфузорий составляет примерно 0,01-2 мм/с. Так как общая площадь лунки (18 мм) значительно превышает размеры измеряемого
В отобранных пробах почв и воды содержание тяжелых металлов определяли, используя метод атомно-абсорбционной спектрометрии и стандартные образцы [ПНД Ф 16.1:2.2:2.3.36 - 2002; ПНД Ф 14.1:2.22-95]. Исследование проводили на атомно-абсорбционном спектрометре «Квант» с пламенным атомизатором.
Физико-химические исследования образцов воды осуществляли по методам, указанным в таблице 1. Нитраты тяжелых металлов (меди, цинка, никеля, кобальта, кадмия, свинца) по отдельности растворяли в дистиллированной воде и готовили серии растворов соответствующих концентраций. Культуру Tetrahymena pyriformis готовили в соответствии с методикой культивирования простейших одноклеточных организмов, используемых в биоиндикационных исследованиях (см. п. 2.1).
Биотестирование проводили с использованием автоматизированной биотехнической системы «Биолат-2» (см. Регламент, приложение 1). В качестве нефтепродуктов использовали солярное масло, которое добавляли к дистиллированной воде в различных концентрациях.
Культуру Tetrahymena pyriformis готовили в соответствии с методикой культивирования простейших одноклеточных организмов, используемых в биоиндикационных исследованиях (см. п. 2.1). Биотестирование проводили с использованием автоматизированной биотехнической системы «Биолат-2» (см. Регламент, приложение 1)
В качестве СПАВ использовали стиральный порошок «Новость», который добавляли в дистиллированную воду в различных концентрациях.
Культуру Tetrahymena pyriformis готовили в соответствии с методикой культивирования простейших одноклеточных организмов, используемых в биоиндикационных исследованиях (см. п. 2.1).
Биотестирование проводили с использованием автоматизированной биотехнической системы «Биолат-2» (см. Регламент, приложение 1). фенол В дистиллированной воде готовили различные концентрации фенола.
Культуру Tetrahymena pyriformis готовили в соответствии с методикой культивирования простейших одноклеточных организмов, используемых в биоиндикационных исследованиях (см. п. 2.1).
Биотестирование проводили с использованием автоматизированной биотехнической системы «Биолат-2» (см. Регламент, приложение 1).
Водородный показатель водной вытяжки из почв поддерживали в диапазоне 3,0-4,5. Непосредственно перед началом биотестирования измеряли температуру водной вытяжки, ее значения лежали в интервале 20-22С, рН раствора доводили до 7,0. Водные почвенные вытяжки и образцы воды подвергали биотестированию с использованием культур двух видов инфузорий: Paramecium caudatum и Tetrahymena pyriformis.
Вначале оценивали острую токсичность образцов при экспозиции 3 часа с использованием культуры Paramecium caudatum. Затем для оценки кумулятивного воздействия использовали инфузорий Tetrahymena pyriformis.
В пробирки вносили по 3 мл исследуемого раствора. Приготовленные пробы перед внесением культуры автоклавировали под давлением пара 1 атм. в течение 30 минут. При анализе почвенных образцов в качестве растворителя для компонентов стандартной питательной среды, на которой культивировали Tetrahymena pyriformis, использовали почвенные вытяжки. Это было сделано по той причине, что данный вид живет в богатой питательными веществами среде, а почвенная вытяжка содержит в основном минеральные соли и не поддерживает жизнедеятельности данных организмов.
Затем в подготовленные пробирки со средой петлей вносили культуру инфузорий. Через сутки количество особей в пробах регистировали с помощью биотехнической автоматизированной системы «Биолат-2». При отсутствии токсического эффекта наблюдался прирост культуры, а при его наличии - угнетение роста популяции.
Сравнительная характеристика чувствительности инфузорий к отдельным факторам окружающей среды с использованием автоматизированной биотехнической системы «Биолат-2»
Инфузории проявляют высокую чувствительность к токсическому действию различных поллютантов, но литературные данные по вопросу токсического воздействия тяжелых металлов в низких концентрациях немногочисленны. Методики проведения экспериментов по этому вопросу различны, поэтому данные, имеющиеся в литературе, трудно сравнимы. Кроме этого, очень важно знать степень адаптации каждого вида инфузорий к концентрации тяжелых металлов, так как наличие этого фактора может привести к искажению результатов биотестирования.
Для того чтобы оценить чувствительность каждого вида инфузорий, нами было исследовано влияние на них растворов солей тяжелых металлов различной концентрации. Для исследования использовали нитраты меди (II), свинца (II), кадмия, никеля, кобальта и цинка. Растворы солей готовили на дистиллированной воде.
Исследования с использованием автоматизированной биотехнической системы «Биолат-2» показали, что простейшие одноклеточные организмы отличаются высокой чувствительностью к тяжелым металлам. Достоверное снижение количества Paramecium caudatum наблюдается уже при концентрации 0,01 мг/л (рис. 8). Наибольшей токсичностью обладают ионы меди, никеля и кадмия.
В ходе многочисленных исследований нами отмечено снижение скорости отмирания клеток на 7 сутки. По-видимому, это связано с адаптационной способностью инфузорий. При сравнительном биотестировании ионов тяжелых металлов в водных растворах в концентрации 0,1 мг/л отмечено, что ионы свинца оказывают меньшее токсическое действие, чем остальные тяжелые металлы. Кроме того, на 9 день наблюдался рост культуры, что, по-нашему мнению, свидетельствует об адаптации культуры Paramecium caudatum к действию соли свинца в данной концентрации (рис.9).
Увеличение концентрации тяжелых металлов до 1 мг/л приводит к значительному снижению количества выживших инфузорий. Наиболее интенсивное воздействие оказывают ионы меди, никеля и кадмия (рис. 10). Например, в среде, содержащей никель, гибель культуры Paramecium caudatum наступала на 3 день. В растворах солей кадмия и меди - на 4 день.
Таким образом, наибольшую чувствительность Paramecium caudatum проявляют в отношении меди, никеля и кадмия. Аналогичные исследования, проведенные с культурой инфузорий Tetrahymena pyriformis, выявили у неё более высокую чувствительность к ионам тяжелых металлов. Но в тоже время большую чувствительность Tetrahymena pyriformis проявляет по отношению к ионам свинца и цинка (рис. 11). Из этого можно сделать вывод о том, что Tetrahymena pyriformis более чувствительна к загрязнению, вызванному тяжелыми металлами, чем Paramecium caudatum.
Кроме анализа чувствительности на ионы тяжелых металлов было проведено исследование влияния на данные виды инфузорий различных концентраций нефтепродуктов (на примере солярного масла), СПАВ и фенола.
Исследования с использованием автоматизированной биотехнической системы «Биолат-2», показали, что культура Paramecium caudatum проявляет незначительную чувствительность к нефтепродуктам в исследуемых концентрациях, что совпадает с литературными данными (рис. 12).
В то же время на выживаемость Tetrahymena pyriformis нефтепродукты оказывают влияние уже в концентрации 0,01 мг/л. Но наиболее наглядно динамика выживаемости Tetrahymena pyriformis проявляется, начиная с концентрации 0,05 мг/л (рис. 13).
Высокой чувствительностью клетки Paramecium caudatum и Tetrahymena pyriformis обладают в отношении синтетических поверхностно-активных веществ (СПАВ). Причем и увеличение концентрации СПАВ, и увеличение экспозиции способствует выраженному отмиранию инфузорий (рис. 14, 15).
Похожие диссертации на Использование автоматизированной биотехнической системы и простейших одноклеточных организмов для биотестирования объектов окружающей среды
