Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11
1.1. Экологическая характеристика Карского моря 11
1.2. Исследования микробных сообществ Карского моря 13
1.3. Исследования микробных сообществ холодноводных морей 24
ГЛАВА 2. Обьекты и методы исследований
2.1. Обьекты исследований 34
2.2. Методы исследований
2.2.1. Микробиологические методы 41
2.2.2. Молекулярные методы 41
2.2.3. Химические методы 49
2.2.3.1. Эксперименты по деградации нефти чистыми культурами в условиях различной солености 49
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение
3.1. Исследование культивируемого микробного сообщества донных осадков шельфа Карского моря и прилегающих заливов
3.2. Исследование природного микробного сообщества донных осадков шельфа Карского моря и прилегающих заливов с учетом минерализации поровых вод двумя методами 57
3.2.1. Исследование природного микробного сообщества методом секвенирования по Сенгеру 57
3.2.2. Исследование природного микробного сообщества на основе данных массового параллельного секвенирования (платформа Roche) 67
3.3. Исследование в природном микробном сообществе донных осадков Карского моря функциональных генов метанмонооксогеназ (pmoA), метил-коэнзим М редуктаз (mcrA), алкангидрогсилаз (alk)
3.4. Экспериментальные исследования деградации н-алканов нефти чистыми культурами бактерий, изолированных из донных осадков
Карского моря и прилегающих заливов 98
Заключение 106
Выводы 109
Список литературы
- Исследования микробных сообществ холодноводных морей
- Микробиологические методы
- Исследование природного микробного сообщества донных осадков шельфа Карского моря и прилегающих заливов с учетом минерализации поровых вод двумя методами
- Исследование в природном микробном сообществе донных осадков Карского моря функциональных генов метанмонооксогеназ (pmoA), метил-коэнзим М редуктаз (mcrA), алкангидрогсилаз (alk)
Исследования микробных сообществ холодноводных морей
Исследования микроорганизмов Карского моря впервые были проведены академиком Б. Л. Исаченко [36;37]. В своих работах он показал, что морские арктические грунты весьма богаты бактериями, которые участвуют в формировании донных отложений. Первым количественно оценил микробную биомассу Карского бассейна В. С. Буткевич во время высокоширотной экспедиции в 1935 г. Среди 86 проб, полученных им на 22 станциях в северной части моря, подавляющее большинство содержало от 103 до 104 кл/мл микроорганизмов, их биомасса составляла 3.5- 7.0 мкг/л [12].
После организации дрейфующих научных станций «Северный полюс» микробиологические исследования были проведены в отдельных районах Центральной Арктики А. Е Криссом в 1954 г. На нескольких микробиологических станциях, располагавшихся на широтах от 82 с.ш. до 90 в.д., была изучена численность сапрофитных бактерий водной толщи открытой части Карского моря [44]. М. В. Гусевым с соавт. летом 1974 г. была изучена нефтеокисляющая микрофлора арктических морей СССР. Проведенные исследования показали, что нефтеокисляющие микроорганизмы имеются во всех пробах воды, взятых по трассе Северного морского пути. Было отмечено, что чистые культуры нефтеокисляющих микроорганизмов арктических морей характеризуются разной активностью при разложении нефтепродуктов [22]. Впервые исследования бактериопланктона р. Енисей вплоть до пос. Сопочная Карга были проведены, начиная с 1972 по 1979 гг. В. В. Дрюккером и В. И. Петровой [26]. Было изучено пространственное распределение, особенности динамики (сезонной и межгодовой) общей численности гетеротрофных микроорганизмов на верхнем, среднем и нижнем участках реки, определена численность фенол-, углеводородокисляющих (УВОМ), целлюлозоразлагающих и нитрифицирующих бактерий, которые играют важную роль в процессах самоочищения экосистемы реки. По итогам многолетних исследований был разработан прогноз формирования бактериопланктона и качества воды для искусственных водоемов [26].
В исследованиях, проведенных Т. В. Коронелли с соавт. в прибрежных акваториях арх. Северная Земля (о-в Голомянный) и в районах Центральной Арктики, из образцов арктических вод и льдов удалось выделить 125 штаммов УВОМ. Как отмечают исследователи, при последовательных пересевах 12 штаммов прекратили рост на среде с парафином. Для трех штаммов поддерживать рост на этой среде удавалось лишь путем их периодического проведения через МПБ (мясопептонный бульон), что свидетельствовало о неспособности данных микроорганизмов синтезировать все необходимые вещества при использовании одних только углеводородов [41].
Микробиологами Мурманского морского биологического института (ММБИ) были получены новые данные по численности, биомассе и продукции бактерий в северных морях, в том числе в западных районах Карского моря [5;73]. По данным Н. Г. Теплинской выявлены более высокие концентрации бактериальных клеток по сравнению с данными А. Е. Крисса, общая численность бактерий и биомасса в юго-западной части Карского моря около Новой Земли составила 18–150 тыс. кл/мл и 16-60 мкг/л [73]. Общая численность микроорганизмов (ОЧМ) в Карском море измерялась тысячами и десятками тысяч кл/мл, что на порядок ниже, чем в других морях Арктического бассейна [249].
В то же время проводились экспедиционные работы в районе Карского моря, подверженного влиянию стока крупных рек - Оби и Енисея. Сотрудниками Института микробиологии РАН были проведены комплексные гидрофизические и гидрохимические измерения, впервые исследовался поток вещества, взвеси в Арктике, особое внимание уделялось гидрооптическим, а также литологическим и геохимическим исследованиям районов эстуариев Карской экосистемы [10; 13; 52].
Важная роль была отведена изучению бактерий в воде, взвеси и донных осадках, а также оценке интенсивности микробных процессов циклов углерода и серы Карского моря [48; 54; 57]. Было отобрано 215 проб воды с 32 станций на четырех меридиальных разрезах, пересекающих море от 76 с.ш. и эстуариях Оби и Енисея. Было установлено, что в морской части исследованной акватории содержание бактерий в водной толще колебалось от 2-3 тысяч до 250-280 тыс. кл/мл, что близко к данным более ранних работ [5; 73]. В слое 0-25 или 0-30 м численность бактерий была более высокой, чем в нижерасположенных слоях водной толщи. Более или менее выраженные пики численности наблюдались в слое термо- и галоклина, а также в придонном слое.
Микробиологические методы
За последние десятилетия достижения в области современной биологии внесли значительный вклад в понимание микробного разнообразия и значительно расширили данные о составе природных сообществ [299]. Были выявлены новые таксоны прокариот, определены наиболее многочисленные и широко распространенные в морских экосистемах [98; 131; 134]. Внедрение методов молекулярной биологии позволяет микробиологам изучать микробное разнообразие, что ранее не удавалось определить методами культивирования на питательных средах [159; 227]. Проводятся исследования разнообразия природных микробных сообществ, микроорганизмы которых участвуют в процессах круговорота различных веществ [119]. Работы такого плана имеют масштабный характер, учитывая доступность и развитие молекулярных методов.
И, тем не менее, по сравнению с современными методами, использование методов культивирования на питательных средах может дать более подробную информацию о физиологических и метаболических характеристиках микроорганизмов в ответ на изменения окружающей среды. Со стремительным развитием технологий выращивания в лабораторных условиях становиться возможным получение чистых культур бактерий из разнообразных природных образцов и изучение их физиологии и генетики [299].
Из донных осадков и водной толщи шельфа Карского моря, Гыданской губы и Енисейского залива коллективом авторов под руководством М.Ю. Сусловой была выделена коллекция штаммов чистых культур бактерий. По морфологическим признакам полученные микроорганизмы принадлежали филумами Firmicutes, Actinobacteria и Bacteroidetes, так же классу -Proteobacteria, родам Streptomyces, Rhodococcus, Micrococcus, Bacillus,
Pseudomonas, Acinetobacter, Flavobacterium и Marinococcus. Из 100 выделенных культур бактерий до рода идентифицированы 83 штамма. Культуры актинобактерий отнесены к трем родам: Streptomyces (29 штаммов), Rhodococcus (4 штамма) и Micrococcus (4 штамма), 29 штаммов определены как представители рода Bacillus, 1 штамм – Brevibacillus, 8 штаммов – Pseudomonas, 2 – Acinetobacter, 2 – Flavobacterium, 2 Marinococcus, 1 – Aeromonas и 1 – Plantibacter. Микроорганизмы, выделенные из донных осадков, представлены родами Streptomyces и Bacillus. Особое внимание было уделено спорообразующим микроорганизмам в связи с их высокой степенью устойчивости к разнообразным природным факторам [1; 224], в частности, к низким температурам и повышенной солености воды. Это представители родов Streptomyces и Bacillus. Тридцать штаммов определены как представители рода Bacillus, образующие эндоспоры. Следует отметить, что исследуемый район отличался наличием большого разнообразия бактерий данной группы.
Изучение ферментативной активности у бактерий косвенно позволяет судить о продукционно-деструкционных процессах, происходящих или происходивших в донных осадках исследуемых районов. В связи с этим у семи культур, изолированнфх из донных осадков шельфа Карского моря и прилегающих заливов была изучена потенциальная активность следующих ферментов: протеазы, фосфатазы, лецитиназы, амилазы. Лецитинизной активностью обладали 2 штамма, фосфотазной – 2 штамма. Амилолитические и протеазные ферменты были обнаружены у 2 и 3 штаммов, соответсвенно (табл. 3). Следует отметить, что все штаммы проявляли ряд активностей, но ни один из них не обладал способностью продуцировать ферменты всего исследуемого спектра (табл. 3). Относительно невысокая ферментативная активность исследуемых штаммов, вероятно, связана с низким содержанием Cорг и Nорг в органическом веществе донных осадков исследуемых районов (табл. 1).
У штаммов была определена структура нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК (около 1300 п.н.), которая имела высокий процент сходства (99-100 %) с ДНК бактерий из различных природных экосистем, как морских, так и пресноводных (табл. 3). Из семи исследуемых штаммов пять были представлены бактериями порядкa Bacillales филума Firmicutes.
Нуклеотидная последовательность штамма Ар. 9/17-09 имела 100 % сходство с последовательностью бактерии, выделенной из почвы, загрязненной урановыми отходами (Bacillus sp., AM293003) (рис. 2). Последовательность штамма Ар. 20/42-09 имела высокий процент сходства (100) с Bacillus sp., выделенной из снега с вершины горы в Японии (AB576891), штамма Ар. 25/47-09 – 99 % (EU308307, солеварня, Греция), соответственно. Последовательность штамма Ар. 10/20-09 имела 99 % сходства с Bacillus sp. (AB533800), выделенной из соленого озера в Калифорнии, США.
Как представлено на филогенетическом дереве (рис. 2), последовательности Ар. 10/20-09, Ар. 20/42-09 и Ар.25/ 47-09 относятся к I морфологической группе B. subtilis - I, при этом формируя две отдельных подгруппы: одна кластеризовалась с подгруппой B. pumilis (штаммы Ар.20/42-09 и Ар. 25/47-09), вторая с подгруппой B. firmus (штамм Ар. 10/20-09). Последовательность штамма Ар. 9/16-09 оказалась наиболее близка к представителям другого филогенетического подразделения спектра бацилл -«группе 4», которые в настоящее время выделены в род Brevibacillus. Последовательность этого штамма на 100 % сходна с Brevibacillus laterosporus (DQ371289, Китай).
Представители семейства Bacillaceae способны разрушать субстраты, получаемые из растительных и животных остатков, гидролизировать большое количество биополимеров. Известно что, по мере накопления трудно разлагаемых соединений виды рода Bacillus начинают занимать доминирующее положение в различных экологических нишах.
Исследование природного микробного сообщества донных осадков шельфа Карского моря и прилегающих заливов с учетом минерализации поровых вод двумя методами
В результате исследования суммарной ДНК из поверхностного слоя донных осадков пяти станций получена библиотека клонов, содержащая фрагменты гена 16S рРНК эубактерий и архей длиной до 900 п.н. Методом секвенирования по Сенгеру определено 375 нуклеотидных последовательностей, набольшая часть которых имеет высокий процент сходства (97-100 %) с некультивируемыми микроорганизмами, выделенными из водной толщи и донных отложений морей, в том числе и холодноводных, а также из почв различных регионов мира. Для подтверждения таксономического статуса были построены филогенетические деревья, где полученные нуклеотидные последовательности были сопоставлены с последовательностями ближайших родственников, в том числе из сходных мест обитания и типовыми штаммами микроорганизмов (рис. 3, 4).
В образце суммарной ДНК из донных отложений южной части Гыданской губы (ст. 17), характеризующихся самым низким уровнем минерализации поровых вод, идентифицированы представители бактерий филумов Actinobacteria, Acidobacteria, Chloroflexi, Planctomycetes, Spirochaetes, Synergistetes, классы -, -, -, - Proteobacteria, а также археи филума Euryarchaeota (всего 84 клона) (приложение 4). К филуму Actinobacteria отнесено 29 клонов, один из которых (17-23) (рис. 3) принадлежит сем. Micrococcineae, его ближайший родственник, Leifsonia sp., найден в мангровых осадках Бразилии (99 %). 23 клона проявили высокий уровень сходства с представителями рода Rhodococcus, причем девять имели сходство с видом Rhodococcus qingshengii, который может в качестве единственного источника углерода или азота использовать противогрибковые препараты, применяемые в сельском хозяйстве [288]. Еще 12 последовательностей проявили высокий уровень сходства с последовательностью Rhodococcus sp., выделенной из загрязненной нефтью почвы, Китай. Нуклеотидная последовательность клона 17-51, представляющая филум Spirochaetes, была сходна с последовательностью бактерии из микробных матов (97 %). Представители Spirochaetes относятся к хемоорганогетеротрофам, аэробные и анаэробные виды которых встречаются как в почвенных, так и в водных экосистемах [165]. К классу -Proteobacteria отнесено три клона. Клон 17-57 имел 99 % сходства с некультивируемой бактерией из поверхностного слоя загрязненных осадков, а клон 17-7 – с бактерией из гиперсоленных микробных матов в Тихом океане. Представители этого класса способны окислять разнообразный спектр органических веществ [136].
Принадлежность к классу -Proteobacteria показало 14 клонов, из них клон 17-10 (рис. 4) был идентифицирован как представитель рода Dechlorosoma, изолированного из грунтовых вод, США. Бактерии этого рода известны как деструкторы хлората и перхлорота (до хлорида), некоторые используют нитрат в качестве акцептора электрона [136]. Две последовательности были идентифицированы как Burkholderia sp., известных своей способностью разрушать хлорорганические пестициды и полихлорированные бифенилы (ПХБ) [136]. Принадлежность роду Variovorax определена для последовательности 17-93 с уровнем сходства 93 %. Для последовательности 17-27 наибольшее сходство отмечено с бактерией Variovorax paradoxus, изолированной из ризосферы в Гималаях. Представители этого рода способны разрушать различные загрязняющие вещества, включая пестициды и сырую нефть [263]. Шесть клонов проявили высокий уровень сходства (99%) с представителями рода Thauera sp. сем. Rhodocyclaceae, известных своей способностью к метаболизму ароматических соединений в бескислородных условиях. Ближайшие родственники полученных клонов выделены из осадков в США, загрязненной хромом почвы в Индии и тяжелыми металлами в Китае, а также из эстуарных осадков. Представители этого рода встречаются в донных осадках и загрязненных пресных водах [136]. Четыре последовательности отнесены к классу -Proteobacteria. Последовательность клона 17-14 на 99 % сходна с Pseudomonas sp. из почвы в Китае. Еще один клон, (17-61), показал высокое сходство с последовательностью из района естественных нефтепроявлений оз. Байкал (прилож. 4). Четыре клона отнесено к классу -Proteobacteria, причем последовательность 17-22 сходна на 99 % с Pelobacter sp. из ледника в Индии. Клон 17-105 показал 98 % сходства с видом Desulforegula conservatrix из пресноводного озера в Австралии, который окисляет неразветвленные карбоновые кислоты [241]. Принадлежность к бактериям филума Chloroflexi, представители которых способны окислять аммоний, показали два клона, один из них, (17-106), проявил 98 % сходства с некультивируемой почвенной бактерией из Кореи. Еще три последовательности принадлежат филуму Acidobacteria, одна из них, 17-112, на 98% идентична некультивируемой бактерии из осадков в устье р. Янцзы, Китай. Бактерии этого филума часто встречаются в донных отложениях и почвах, способны деградировать низко и высокомолекулярные формы органических веществ, восстанавливать нитраты и нитриты (Ward, 2009).
Принадлежность к филуму Synergistetes показала последовательность клона 17-103, проявив 98% сходства с некультивируемой бактерией из почвы в Японии. Представители этого филума являются облигатными анаэробами, способны разрушать аминокислоты, и, как правило, составляют незначительную часть бактериального сообщества в каждой конкретной среде обитания [160]. Следует отметить низкую степень сходства (93%) клона 17-28 с бактерией из антарктического озера. На филогенетическом дереве он кластеризуется с представителями филума Planctomycetes (рис. 3).
Исследование в природном микробном сообществе донных осадков Карского моря функциональных генов метанмонооксогеназ (pmoA), метил-коэнзим М редуктаз (mcrA), алкангидрогсилаз (alk)
Полученные образцы суммарной ДНК, выделенной из поверхностного слоя донных осадках шельфа Карского моря (ст. 9, ст. 20), Енисейского залива (ст. 20) и Гыданской губы (ст. 13, ст. 17) были исследованы на наличие функциональных генов алкангидроксилаз (аlk), отвечающих за способность микроорганизмов участвовать в деградации коротко- и длинноцепочечных алканов. Для этого использовали праймеры аlk B1, аlk B2 и аlk B3, а также праймеры аlk с инозином [56; 254]. Исследования показали, что представители этой группы участвуют в разрушении н-алканов с различной длиной цепи (С6-С30).
По результатам ПЦР-анализа ген аlk B3 был идентифицирован только в образце ст. 24 (табл. 6) В других образцах присутствие генов аlk по выбранным праймерам обнаружено не было.
Также было проведено тестирование на наличие аlk генов штаммов чистых культур, изолированных из донных осадков шельфа Карского моря (штаммы Ар. 42-09, Ар.20-09, Ар. 17-09 и Ар. 16-09) и Енисейского залива (штаммы Ар. 46-09, Ар. 47-09 и Ар. 55-09) (таблица 3). ПЦР-анализ показал, что только у двух штаммов было определено наличие гена alk B-3 – штамма Bacillus sp. (Ар. 47-09) и Aeromonas piscicola (Ар. 46-09). Обе бактерии изолированы из донных осадков южной части Енисейского залива (ст. 25).
Таким образом, проведенная работа по поиску генов алкангидроксилаз групп B1, В2 и В3 свидетельствует об их отсутствие в образцах суммарной ДНК и в чистых культурах, что согласуется с результатами экспериментов по деградации нефти. 3.4. Экспериментальные исследования по деградации н-алканов нефти чистыми культурами бактерий, изолированными из водной толщи и донных осадков Карского моря
Микроорганизмы природных экосистем являются важным звеном в самоочищении водоемов, используя углерод как один из распространенных источников энергии для метаболизма. В арктических условиях биодеградация имеет определенные трудности, так как темпы разложения в загрязненных почвах проходят очень медленно и нефть имеет тенденцию сохраняться в течение десятилетий [244; 283]. Условия окружающей среды в высокоширотных районах Арктики часто ассоциируются с низкими температурами и продолжительным ледовым покровом в течение года. Соленость в морских водоемах за пределами оптимального уровня также имеет тенденцию к увеличению задержки фазы роста микроорганизмов, а также к уменьшению скорость роста и синтеза биомассы [149]. Показано также, что деградация нефти ингибируется повышенной соленостью [145; 210]. Дж. Уолворт с соавт. предположили, что снижение деградации углеводородов при высоких концентрациях солей обусловлено увеличением солености воды, которая ингибирует микробную деструкцию углеводородов. [279]. Исследования такого рода сложны по своей природе, так как углеводороды нефти считаются биологически активными и относятся к опасным загрязняющим веществам. Их длительное воздействие ведет к нарушениям сложившегося равновесие природных экосистем.
Мы провели лабораторный эксперимент для оценки роли микроорганизмов в процессе биодеградации нефти в условиях различной солености при +10 C. Для эксперимента была создана смесь культур Bacillus sp. Brevibacillus laterosporus, Aeromonas piscicola и Plantibacter sp., изолированных из поверхностного слоя донных осадков шельфа Карского моря и Енисейского залива, далее именуемая смесь №1. Для сравнения была взяты чистые культуры байкальских бактерий, изолированных из водной толщи и донных осадков районов естественных нефтепроявлений м. Горевой Утес и района грязевых вулканов Кукуйского кайона K2 (Microbacterium sp., Paenibacillus sp., Rhodococcus sp., Rhodococcus sp.). Байкальские штаммы представлены в эксперименте под смесью №2. Бактериальная смесь №3 состояла из смесей №1 и №2.
Модельный эксперимент проводили в лабораторных условиях на минеральной среде с добавлением нефти в трех сериях. Каждая серия включала образцы с добавлением в среду разных концентраций NaCl (0, 7, 15 и 30 мг/мл), в качестве контроля использовали смесь среды и нефти. Убыль н-алканов определяли через 3, 8, 15 и 30 сутки методом хроматомасс-спектрометрии на приборе «Agilent, 6890 GC, 5973 MSD».
В результате эксперимента со смесью микроорганизмов Карского моря (№1) количество н-алканов в среде без добавления NaCl уменьшилось за 30 дней на 30 % (табл. 7, рис. 14, А). При увеличении концентраций NaCl отмечалось замедление процесса конверсии н-алканов. В опытах со смесью байкальских микроорганизмов (№2) или в среде со смесью (№3) при концентрациях 7–15 мг/мл NaCl обнаружена практически полная конверсия нормальных углеводородов за 30 дней эксперимента (рис. 14, Б, В). При отсутствии NaCl или увеличении концентрации до 30 мг/мл отмечалось замедление процесса конверсии н-алканов. Так, за 8 дней культивирования микроорганизмов смесь байкальских бактерий (№2) при концентрации 30 мг/мл и без добавления NaCl количество н-алканов уменьшилось на 40-50 %, тогда как при увеличении концентрации до 7–15 мг/мл конверсия нормальных углеводородов за тот же интервал времени достигала 80-95 %. На хроматограмме нефти, выбранной для проведения модельных экспериментов, был идентифицирован гомологический ряд алканов от С11 до С32, пики изопреноидов – пристана (Pr) и фитана (Ph), с соотношением Pr/Ph = 1.42, нафтены - в виде неразрешенного горба (рис. 15).