Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1 Описание дуба черешчатого (Quercus robur L.) 11
1.2 Молекулярно-генетические методы в исследовании древесных видов растений 35
1.3 Характеристика природных условий Ростовской области 44
1.3.1 Климат Ростовской области 44
1.3.2 Геоморфология и геология 50
1.3.3 Почвенный покров 52
1.3.4 Гидрография 54
1.3.5 Флора и растительность 55
Глава 2. Объект исследования. 61
Глава 3. Методы исследования. 76
3.1 Выделение ДНК 76
3.2 Определение концентрации ДНК 76
3.3 ISSR-анализ. ПЦР 76
3.4 RAPD-анализ. ПЦР 78
3.5 Электрофорез в агарозном геле 79
3.6 Статистический анализ 80
Глава 4. Результаты исследования и их обсуждение 81
4.1 Определение характера изменчивости ДНК-маркеров в ценопопуляциях дуба черешчатого (Quercus robur L.) различных мест произрастания на основе ISSR-анализа 81
4.2 Генетическая структура метапопуляции Quercus robur L. Ростовской области на основе RAPD-анализа 97
4.3 Филогенетические взаимоотношения в роде Дуб (Quercus) 100
4.4 Генетический анализ фенологических форм Quercus robur L. 106
Заключение 112
Выводы 115
Список использованных источников 117
Приложения 137
- Описание дуба черешчатого (Quercus robur L.)
- Флора и растительность
- Определение характера изменчивости ДНК-маркеров в ценопопуляциях дуба черешчатого (Quercus robur L.) различных мест произрастания на основе ISSR-анализа
- Генетический анализ фенологических форм Quercus robur L.
Описание дуба черешчатого (Quercus robur L.)
Дуб черешчатый (Quercus robur L., или Quercus pedunculata Ehrh.) широко распространен в естественных лесных ассоциациях (Kremeretall, 2012) умеренных широт и горных поясов северного полушария, а также в тропических и субтропических зонах Юго-Восточной Азии, Северной Африки, Северной и Центральной Америке (Фёдоров и др., 1980; Лосицкий, 1981). Quercus robur L. относится к роду дуб (Quercus L.), который насчитывает порядка 415 различных видов (Axelrod, 1983; Manosand Stanford, 2001). Род дуб (наряду с такими яркими представителями как бук и каштан) относится к семейству Буковые (Fagaceae), включающему в себя около 900 видов (Kremer et al., 2012). На территории России также встречаются и другие представители рода Quercus L.: дуб скальный (Quercus petraea, Liebl. L.), дуб грузинский (Quercus iberica) – обычный лесообразующий вид Северного Кавказа (Лесная энциклопедия, 1985), однако, по другим источникам, его рассматривают как подвид Quercus petraea (Флора Восточной Европы, 2004), дуб пушистый (Quercus pubescens Willd.) (Новосельцев и Бугаев, 1985), дуб Гартвиса (Quercus hartwissiana Steven), дуб крупнопыльниковый (Quercus macranthera Fisch. & C.A.Mey. ex Hohen.) (Зернов, 2006), дуб Далешампа (Медведева) (Quercus dalechampii Ten.) – встречаются на Кавказе; дуб монгольский (Quercus mongolica Fisch. Ex. Ledeb.), дуб зубчатый (Quercus dentata Thunb.) (Середюк, 2016) – встречаются на Дальнем Востоке.
Ряд авторов (Manos et al., 1999; Bellarosa et al., 2005; Oh and Manos, 2008; Denk and Grimm, 2010), используя молекулярную филогенетику рода Quercus, идентифицировали и изучили две основные клады. Наиболее крупная из двух клад упоминается как Новые Мировые дубы (New World oaks) с секциями Lobatae (красные и черные дубы), Protobalanus (золотистые дубы) и Quercus s.s. (белые дубы). Эта концепция подчеркивает предполагаемое происхождение и последующую диверсификацию в Северной и Южной Америке, за которой следует, по крайней мере, одна миграция предковой группы белых дубов в Евразию, что привело к небольшому образованию приблизительно 20 видов, размещенных в разделе Quercus s.s. (например, Quercus robur, Quercus mongolica). Меньшая клада строго Евразийская и объединяет две группы: 1) дубы Cerris (включая виды группы Ilex) – небольшое ответвление, состоящее приблизительно из 50 видов умеренного климата (например, Q. acutissima) и полузасушливого климата (например, Quercus ilex, Quercus suber) (Denk and Grimm, 2010), 2) тропический, вечнозеленый Cyclobalanopsis (например, Q. myrsinifolia), представленный около 90 видами (Deng 2007).
Ареал дуба черешчатого очень обширен, на западе он охватывает всю Западную Европу, северная граница в России проходит по линии Санкт-Петербург – Киров, в Европе тянется до Норвегии и Швеции (59-630 с.ш.), затем на востоке захватывает Заволжье и Южную часть Пермской области до Уральских гор, после чего сворачивает к югу, заходит в северную часть степи, захватывая край Ростовской области, где образует в основном байрачные леса. Также дуб черешчатый широко распространен в горных лесах Северного Кавказа, встречается в Крыму. На юге граница проходит через Малую Азию (Лосицкий, 1981; Новосельцев и Бугаев, 1985; Булыгин и Ярмишко, 2003).
По мнению ряда авторов (Фёдоров, 1980; Казанцева, 2014; Кружилин, 2008; Булыгин и Ярмишко, 2003) Quercus robur, который имеет ареал вида в границах подзоны широколиственных лесов и лесостепи европейской части России, выступает одной из основных пород древесных растений, который образует леса. В течении процесса эволюции природные насаждения Quercus robur пропали из флоры Западной Сибири, хотя есть данные, что в доледниковый период дубовые насаждения находились в лесостепной зоне Западной Сибири, Карелии, Архангельской области и Коми (Соколов и др., 1977). За последние примерно 500 лет ареал дуба черешчатого претерпел значительные изменения: северная граница существенно сместилась к югу, а в свою очередь южная граница сместилась к северу, приведя к исчезновению дуба в южных районах Украины и Дона (Демина, 2011). Очевидно, что ареал данного вида является подвижным: происходит его сокращение в результате смены быстрорастущими породами (Фёдоров, 1980; Соколов и др. 1977), а также вследствии повышения температур за последние несколько десятилетей (Панов и др., 2006; Демина, 2015).
Повышение температуры и недавние изменения режимов стока, наблюдаемые в Центральной Европе, могут изменить рост и относительное поглощение воды пойменными деревьями. Для прогнозирования реакции пойменных лесов на изменение климата, необходимо определить климатические контроли над ростом дерева и анатомией сосуда. В работе Тумаер и Тремл (Tumajer and Treml, 2016) проанализированы ответы ширины кольца дерева и анатомических параметров сосудов молодых деревьев (средняя площадь просвета сосуда, плотность сосуда и общая площадь просвета сосуда) дуба черешчатого (Quercus robur L.) произрастающего в пойме к гидроклиматическим условиям, представленых температурой, индексом засухи (scPDSI), речным стоком, уровнем грунтовых вод и возникновением наводнений и засухи. Собрана хронология для мест пойменных и опорных участков дуба и впоследствии проведена корреляция с временными рядами гидроклиматических условий. В результате показано, что на радиальный рост пойменных деревьев особенно положительно влияет температура в течение вегетационного периода и в течение лета предыдущего года. Напротив, рост эталонных деревьев сильно ограничен засухой. В молодых деревьях средние сосудистые области в области просвета как с поймы, так и с эталонных участков имеют положительный температурный сигнал с января по апрель. Однако влияние водообеспеченности (указываемой индексом засухи) на размер судов в основном отрицателен для пойменных деревьев (с максимальной реакцией на осень года, предшествующего формированию древесного кольца) и положительные или несущественные для эталонных деревьев. Плотность сосуда в хронологии, однако, имеет обратную экологическая информацию, в виде ширины древесного кольца с усиленными отрицательными корреляциями с текущего года температуры на пойменных участках. Общая площадь сосуда связана в основном с температурой в предыдущих мае и июне. Индекс засухи показал точно такую же информацию в кольцах деревьев, как делали речные стоки и уровни грунтовых вод. Результаты корреляционного и анализа тенденций показывает, что ширина кольца у Q. robur в пойме однозначно увеличивается с увеличением температуры; но, с другой стороны, засухи могут стать серьезной проблемой, влияющей на продуктивность выращивания эталонных деревьев в более отдаленных частях низменности. Размер сосуда Q. robur, растущего за пределами поймы, в последнее время имеет тенденцию к увеличению с ростом температуры, что делает ксилемы более эффективно для водного транспорта, но и более уязвимый к кавитации (Tumajer and Treml, 2016).
Обширное распространение Q. robur в районе континентального климата характеризуется его зимо- и морозоустойчивостью (Ефимов, 1974; Карандина 1966). Взрослые образцы дуба черешчатого могут переносить морозы до -40-450С (Погребняк, 1968). Дуб черешчатый считается сравнительно теплолюбивой породой (Лосицкий, 1981), а также требователен к условиям местопроизрастания (Булыгин, Ярмишко, 2003; Погребняк, 1968; Ткаченко, 1955), вследствие чего довольно часто страдает от поздних весенних заморозков (Вересин, 1958; Ефимов, 1967; Миленин, 1997; Молчанов, 2011; Молчанов, 2012; Рубцов с соавт., 2007; Сильченко, 2012).
По мнению С. С. Пятницкого, Q. robur может произрастать на засоленных почвах (Пятницкий, 1960). Однако, некоторые авторы не согласны с такой постановкой вопроса (Богаченко, 1965; Мигунова, 1978). Лучше всего дуб черешчатый растет на черноземах, лугово-каштановых почвах и лугово-черноземных почвах, а также на свежих глубоких серых лесных суглинках и деградированных черноземах (Василькович, Даньшин, 1969).
Дуб считается достаточно засухоустойчивой породой (Пятницкий, 1960; Эйтинген, 1954), способный, однако, произрастать и в условиях повышенной увлажненности (Карандина, 1963). Дуб может переносить высокие температуры воздуха вплоть до +40-450С (Захаров, 1958). Так П.С. Погребняк, в своей работе показал, что Q. robur является ксеромезофитом (Погребняк, 1955). Обладая мощной корневой системой, дуб черешчатый хорошо переносит засуху и может расти на сухих бедных, каменистых почвах. Известно, что уже в первые годы жизни, маловетвящийся стержневой корень Q. robur может проникать на глубину 1 м и более (Захаров, 1955). Отличительной особенностью Q. robur является сокращение транспирации в засушливое время (Карандина, 1963; Пятницкий, 1954). В связи с тем, что дуб имеет мощную крону и сильноразветвленную корневую систему (проникающую на глубину свыше 5 метров), его можно назвать ветроустойчивой породой.
В молодом возрасте, когда дуб черешчатый растет медленно, в связи со своей относительной светолюбивостью может часто забиваться быстрорастущими породами, такими как берёза, осина, граб. Молодой дуб способен переносить затенение, в том числе и верхушечное (Булыгин, Ярмишко, 2003; Погребняк, 1968; Ткаченко, 1955). Отличительной чертой биологии дуба является его медленный рост (в особенности, в первые годы), что, однако, сглаживает его внутривидовое разнообразие (Царев и др., 2003). Период медленного роста дуба (первые 5-6 лет жизни) зависит от внешних условий. Медленный рост надземной части компенсируется мощным ростом стержневого корня. Впоследствии, примерно с 4-5 летнего возраста, прирост дуба в высоту может составлять до 0,5 м в год (Кружилин, 2008).
Границы низких широт умеренных и бореальных видов растений обычно состоят из рассеянных популяций, которые сохраняются локально в микрорефугиях. Остается плохо понятым фактом, как их рефугии влияют на характер потока генов и взаимосвязь, ключевых компонентов для их долгосрочной жизнеспособности и эволюции.
Флора и растительность
В работах В.В. Федяевой, указывается, что во флоре Ростовской области описано 1922 вида дикорастущих сосудистых растений из шестисот семнадцати родов и ста двадцати семи семейств, включая 54 вида натурализовавшихся интродуцентов, главным образом, из числа древесных растений: Плауновидные – один вид, Хвощевидные – восемь видов, Папоротниковидные – тринадцать видов, Голосеменные – два вида, Покрытосеменные – тысяча восемьсот девяносто девять видов (Федяева и др., 2005).
Крупнейшими семействами флоры являются: Астровые (Asteraceae) – 258 видов, Злаковые или Мятликовые (Poaceae) – 161 вид, Бобовые (Fabaceae) – 132 вида, Капустные (Brassicaceae) – 103 вида, Розовые (Rosaceae) – 91 вид, Гвоздичные (Caryophyllaceae) – 75 видов. Наибольшим видовым разнообразием характеризуются роды Осока (Carex) – 39 видов, Астрагал (Astragalus) – 38 видов, Василек (Centaurea) – 37 видов, Шиповник (Rosa) – 34 вида, Вероника (Veronica) – 30 видов, Молочай (Euphorbia) – 27 видов, Подмаренник (Galium) – 23 вида, Фиалка (Viola) – 22 вида, Липчатка (Potentilla) – 21 вид и др. (Зозулин, Федяева, 1985). Флора Нижнего Дона имеет большое количество видов семейств Злаковые, Капустные и Гвоздичные, что определяется ее связями с древнесредиземноморскими флорогенетическими центрами (Зозулин, Федяева, 1985). Так по Г. М. Зозулину и В. В. Федяевой, по соотношению средних чисел видов, приходящихся на одно семейство, на один род, соотношение двудольных и однодольных, нижнедонская флора занимает промежуточное положение между флорами гумидных и аридных центров при большей близости к аридным.
Также в Ростовской области выявлено около 160 видов мохообразных (Бабенко, Федяева, 2001; Sereda, Ignatov, 2008) и 2090 видов микобиоты, из них макромицетов – тысяча тридцать два вида (Русанов и др., 2008). В составе микобиоты лихенизированных грибов (класс Lecanoromycetidae) – сто девяносто два вида, сумчатых грибов (отдел Ascomycota) – триста сорок семь видов, из них макромицетов сорок видов, базидиальных грибов (отдел Basidiomycota) – тысяча сто пятьдесят видов, из них макромицетов девятьсот девяносто два вида.
Ядро флоры Ростовской области в целом составляют степные виды. Во флорах отдельных районов области доля степных видов варьирует от двадцати двух-двадцати трех до тридцати-тридцати двух процентов, закономерно повышалось с северо-запада на юго-восток области (Зозулин, Федяева, 1986).
Ростовская область расположена в степной зоне Евразии. В ботанико-географическом отношении степи Ростовской области расположены в пределах Причерноморско-Казахстанской подобласти Евразиатской степной области (рис. 3).
Где большинство из них расположено в Причерноморской (Понтической) степной провинции и только степи крайнего юго-востока относятся к Заволжско-Казахстанской степной провинции (Лавренко, 1980; Лавренко и др., 1991). Степи, как зональный тип растительности, характерны для выравненных или слабо пологих водораздельных пространствам, где они развиваются на почвах тяжелого механического состава – глинистых и суглинистых. На территории Ростовской области представлены степи двух подзональных типов степной растительности – настоящие (разнотравно-дерновиннозлаковые и дерновиннозлаковые) и опустыненные (дерновиннозлаковые и полукустарничково-дерновиннозлаковые). До распашки степи покрывали около 80-85% территории области (Горбачев, 1974). Ростовская область относится к малолесным регионам России. Общая лесистость составляет около 250 тыс. га, или 2,47% от площади области. По данным Экологического вестника Дона (Экологический вестник Дона, 2015) леса произрастают на землях: а) лесного фонда, их площадь составляет 360,577 тыс. га (96,3% от общей площади лесов области) и б) населённых пунктов, на которых расположены городские леса площадью 13,7 тыс. га, или 3,7% от всех лесов.
Общий запас лесных насаждений составляет 19,28 млн м3, а средний ежегодный прирост на 1 га составляет 2,1 м3. Леса и лесонасаждения лесного фонда Ростовской области расположены крайне неравномерно. Основными лесообразующими породами является дуб и сосна, составляющие 31,9% и 31,0 % соответственно (Шапошников и др., 1962; Засоба, 2007; Сидорюк, 2009; Экологический вестник Дона, 2015).
В Ростовской области естественные лесные массивы занимают примерно 70 тысяч гектар, в то время как остальная площадь, покрытая лесами, приходится на искусственные посадки. Естественные леса расширились на юг до долины нижнего течения Дона, не встречаясь на его левобережье. По Г. М. Зозулину данные леса представлены тремя топологическими группами (экотопами) – это байрачные (в балках и на береговых склонах), пойменные (в поймах крупных и средних рек) и аренные (на песчаных массивах надпойменных террас) (Зозулин, 1992).
На территории Ростовской области по данным Г. М. Зозулина байрачные леса расположены в полосе распространения разнотравно-дерновиннозлаковых степей. Южная граница распространения байрачных лесов проистекает от Куйбышевского района через Октябрьский и Усть-Донецкий к Морозовскому и Обливскому районам; южнее распространены только байрачные кустарниковые заросли. На возвышенностях севера Ростовской области и на высоких плато Донецкого кряжа байрачные леса достигают приводораздельных склонов. Основной формацией байрачных лесов являются дубравы представленные Quercus robur (90% площади байрачных лесов). Их можно разделить на несколько групп: сложные дубравы (со спутниками дуба в древесном ярусе, обеднённым кустарниковым ярусом и типичными неморальными видами в травяном ярусе), упрощённые дубравы (из спутников дуба сохраняются только клён полевой и ясень обыкновенный, кустарниковый ярус и многие типичные лесные виды трав отсутствуют) и простые дубравы (древесный ярус образован только дубом, травяной ярус обычно образован перловником пёстрым, ежой или сорно-лесными видами) (Зозулин, 1992).
Среди естественных лесов Ростовской области по площади и широте распространения (около 47 %) лидируют пойменные леса. Они сконцентрированы в поймах среднего и нижнего течения Дона, Северского Донца, Миуса. Наиболее встречаемыми являются пойменные дубравы, которые занимают центральные повышенные участки пойм (Зозулин, 1992).
Аренные леса в Ростовской области встречаются в понижениях на песчаных надпойменных террасах в виде колковых (округлых) и ленточных (вытянутых вдоль ложбин) лесов. Флористическое своеобразие аренных лесов определяется участием в них псаммофитов и редких для степной зоны реликтовых бореальных видов (папоротников, орхидей). Формационно аренные леса весьма разнообразны, что обусловлено глубиной залегания грунтовых вод, их минерализацией, степенью сформированности почв и др. (Зозулин, 1992).
Все леса области отнесены к защитным лесам, основное их назначение – выполнение водоохранных, защитных, санитарно-гигиенических, оздоровительных функций. Часть из ООПТ областного значения расположена полностью или частично (отдельные кварталы) на землях лесного фонда. Обычно это хорошо сохранившиеся участки естественных байрачных, пойменных или аренных лесов, или сочетания названных типов лесов с искусственными лесонасаждениями.
Определение характера изменчивости ДНК-маркеров в ценопопуляциях дуба черешчатого (Quercus robur L.) различных мест произрастания на основе ISSR-анализа
Популяционно-генетический анализ лесообразующих древесных растений необходим для разработки научных основ селекционных исследований, связанных с изучением и поддержанием генетического потенциала видов (Путенихин, Фарукшина, 2007; Каган, 2012).
На основании анализа полученных электрофореграмм установлено, что число ISSR-фрагментов на общую проанализированную выборку варьировало от 40 (праймер UBC 811) до 49 (праймер UBC 880). Среднее число фрагментов составило 45,5, всего детектировано 226 фрагментов (табл. 6). Длина фрагментов укладывалась в диапазон от 200 п.н. (праймер UBC 857) до 1650 п.н. (праймеры UBC 841 и UBC 880).
Для изученных ценопопуляций Q. robur были рассчитаны основные показатели генетической изменчивости. Так, абсолютное число аллелей (na) варьировало от 1,3929 для ценопопуляции Кп – Кундрюченские пески (Нижне Кундрюченское лесничество, Усть-Донецкий лесхоз) до 1,9917 для ценопопуляции Кр – Крыйдянный лес (Журавское лесничество, Чертковский лесхоз) (табл. 7). Эффективное число аллелей (ne) вошло в диапазон от 1,2778 для ценопопуляции Кп – Кундрюченские пески (Нижне-Кундрюченское лесничество, Усть-Донецкий лесхоз) до 1,5996 для Л – урочище «Липяги» (Киевское лесничество, Кашарский лесхоз). Среднее число эффективных аллелей по всем локусам составило 1,6683. Количество полиморфных локусов и процент полиморфизма в изученных ценопопуляциях Q. robur варьировало от 11 (4,87%) для Кп – Кундрюченские пески (Нижне-Кундрюченское лесничество, Усть-Донецкий лесхоз) до 119 (52,65%) для Кр – Крыйдянный лес (Журавское лесничество, Чертковский лесхоз).
Распределение ожидаемой гетерозиготности (Hе) в среднем по всем ценопопуляциям составило 0,3848, где минимальная ожидаемая гетерозиготность установлена для ценопопуляции Кп – Кундрюченские пески (Нижне Кундрюченское лесничество, Усть-Донецкий лесхоз) (Hе = 0,1627), а максимальная – для ценопопуляции Л – урочище «Липяги» (Киевское лесничество, Кашарский лесхоз) (Hе = 0,3485).
Полученные результаты указывают на то, что уровень генетического разнообразия в ценопопуляциях дуба черешчатого весьма пластичен. По-видимому это связано с тем, что некоторые из изученных 13 ценопопуляций Q. robur произрастают в различных экотопах.
Прямой анализ частот встречаемости аллелей и расчет показателей генетического полиморфизма позволяют описать состояние популяционно генетических ресурсов. Не менее важным является вопрос о том, как распределяется изменчивость в пределах популяций исследуемого вида (Каган, 2007). На основе межмикросателлитного анализа была проведена оценка степени генетической подразделенности внутри и между исследуемыми ценопопуляциями дуба черешчатого. В таблице 8 представлены значения показателей G-статистик Неи: общего генетического разнообразия (НТ), внутрипопуляционной генетической изменчивости (HS), доли межпопуляционного разнообразия (GST), генного потока от GST (Nm) (McDermottand, McDonald, 1993).
На основе полученных данных можно сделать вывод, что общее генетическое разнообразие в общей выборке среди всех популяций составляет 24%, среднее внутрипопуляционное генетическое разнообразие по всем локусам составляет 0,1319. Показатель подразделенности исследованных нами 13 ценопопуляций составляет 1% (GST = 1,0055). Для центральной части ареала древесного вида характерна слабая дифференциация (GST = 2–6%), которая возрастает до 8–10% при включении краевых популяций, обычно изолированных от основного ареала (Алтухов и др., 2004). Из этого следует, что исследованные 13 ценопопуляций слабо дифференцированы друг от друга, и, по-видимому, могут быть отнесены к дубовой формации центральной части ареала степной зоны Европейской части России.
Генный поток (Nm) находится на уровне 1%., т. е. в каждой из исследованных ценопопуляций дуба черешчатого в среднем одно дерево имеет геномы, привнесенные из соседних популяций.
Степень генетических различий между исследованными ценопопуляциями дуба черешчатого была установлена на основании генетических дистаниций DN и генетического сходства IN, рассчитанных по результатам ISSR-анализа (табл. 9). Так, наиболее генетически близкими ценопопуляциями являются Кп (Нижне-Кундрюченское лесничество, Усть-Донецкий лесхоз) и ПЛ (Ереминское лесничества, Верхнедонский район), IN равен 0,9197 (что составляет примерно 92%). Наиболее генетически удаленными (IN = 0,6551) можно считать ценопопуляции К (Куйбышевское лесничество, Матвеево-Курганский район) и Кр (Журавское лесничество, Чертковский район). В целом все ценопопуляции Q. robur находились на сравнительно одинаковом уровне генетического родства.
На основании рассчитанных значений коэффициентов генетической дистанции Неи (табл. 9), посредством невзвешенного парно-группового метода кластерного анализа (UPGMA), была построена дендрограмма для исследованных насаждений Q. robur (рис. 5).
Исходя из классификации экотопов ценопопуляций дуба черешчатого, на данной дендрограмме зеленым цветом обозначены байрачные экотопы (Кр, Ор, Рс, Чб, В, ПЛ, Ф, Л), синим цветом обозначены аренные экотопы (Кп, Чп, Ск), оранжевым цветом обозначен пойменные экотопы (К, Х).
Все исследуемые ценопопуляции разделились на 2 кластера. Урочище «Хоботок» (Х), ценопопуляция, входящая в экотоп пойменного леса, расположена вне клад. Ценопопуляция Крыйдянный лес (Кр) также не вошла в состав ни одного из кластеров, что может быть обусловлено их географической изоляцией от остальных ценопопуляций.
Первый кластер образован следующими кладами: Песковатско Лопатинский лес (ПЛ) (байрачный экотоп) совместно с Кундрюченскими песками (Кп) (аренный экотоп) образуют совместную кладу. Также к ним присоединяется Черная балка (Чб) (которая по нашей классификации относится к байрачным экотопам). К кладе ценопопуляций Песковатско-Лопатинский лес (ПЛ), Кундрюченские пески (Кп) и Черная балка (Чб) примыкает ценопопуляции относящиеся к байрачному экотопу: Филькино (Ф), Веденеево (В) и Липяги (Л). Далее идёт узел с искусственной посадкой Куйбышевский лес (К) (пойменный экотоп), который логично выходит из клады. Нарушение логического строя клад вносят последующие узлы байрачного экотопа Ореховой балки (Ор) и искусственного лесонасаждения аренного экотопа Чернышевские пески (Чп).
Второй кластер, меньший по размеру, образован байрачным экотопом Раздорских склонов (Рс) и искусственным лесонасаждением аренного экотопа Степные колки (Ск). Из всего вышесказанного можно сделать вывод, что при использовании иерархического кластерного анализа на основе генетических дистанций Неи формирования самостоятельных кластеров для различных экотопов не происходит. Однако, наряду с этим, прослеживается закономерность в построении узлов, обусловленная слабой дифференциацией изученных ценопопуляций относительно друг друга (GST = 1,0055) и сходным средним уровнем ожидаемой гетерозиготности в пойменном и аренном экотопах (рис. 7). Характер распределения на дендрограмме искусственных ценопопуляций объясняется использованием при их создании генетического материала из байрачных и аренных экотопов Q. robur.
В таблице 10 приведены средние значения гетерозиготностей для изученных экотопов Q. robur.
Генетический анализ фенологических форм Quercus robur L.
С целью определения уровня генетической дифференциации материнского растения и семенного поколения на основании выбранных нами праймеров было изучено семенное потомство (образцы под номерами 7-11) позднораспускающейся формы Q. robur (образец под номером 6).
Проанализированные образцы познораспускающейся формы дуба черешчатого (Q. robur var. tardiflora) являются высоко зимостойкими – после типичных и экстремальных зим повреждений не наблюдается. Изученные фенологические формы засухоустойчивы – хорошо растут и развиваются без достаточного увлажнения, при этом засуху переносят без явного повреждения надземных органов, почки и семена нормального развития, и в следующий после год засухи хорошо растут и цветут. Листья всего на 3 балла поражены листогрызущими насекомыми и мучнистой росой. В отдельные годы образец № 6 не подвержен поражению первой генерации дубовой листовертки из-за более поздних сроков распускания листьев и наступления фенологических фаз. Цветут регулярно, но плодоносят с периодичностью в 2-3 года (3 балла). Дуб нуждается в перекрестном опылении для хорошего плодоношения, но для фенологической формы Q. robur var. tardiflora это крайне затруднено, вследствие расхождения фенологических ритмов с другими образцами Q. r. var. prаecox из искусственной ценопопуляции Ботанического сада. Предположительно у зимней формы происходит самоопыление. Пораженных желудей семяедами от 10 до 30%, неповрежденные семена имеют высокую всхожесть (до 100%). Декоративная долговечность более 100 лет.
Получены семенные поколения выделенных форм Q. r. var. tardiflora 1 (образец № 6) путем осеннего посева семян. В семенных поколениях хорошо воспроизводятся фенологические особенности материнского – сеянцы начинают вегетировать в среднем на 10 позже, чем сеянцы от образцов Q. r. var. prаecox.
На рисунке 14 показано, что полученные спектры сеянцев № 7-11, произошедших от образца Q. r. var. tardiflora 1 (образец № 6), визуально значительно отличаются от остальных образцов (Чохели и др., 2016).
По результатам изучения полученных электрофореграмм для оценки генетической дифференциации материнского растения и семенного поколения с использованием невзвешенного парно-группового метода кластерного анализа, или UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean), была построена дендрограмма, основанная на коэффициентах генетической дистанции Неи (рис. 15).
На полученной дендрограмме сформировано 3 клады:
- Клада с образцами № 13, № 8, № 6, № 4 и № 5;
- Клада с образцами № 2, № 1 и № 11;
- Клада с образцами № 10, № 7 и № 3.
Образцы под номерами № 12 и № 9 лежат вне клад.
Значения коэффициентов генетической дистанции Неи для проанализированных образцов Q. robur var. tardiflora 1 и её семенного поколения представлены в таблице 16.
Большинство образцов семенного поколения Q. robur var. tardiflora 1 генетически дифференцированы друг от друга, при этом наиболее генетически удаленными являются пары № 8 и № 7, № 10 и № 8, № 11 и № 7. Наименьшее генетическое расстояние наблюдается между парами № 8 и № 6, № 9 и № 7, № 10 и № 7, № 11 и № 6.
Для оценки генетического сходства между фенологическими формами дуба черешчатого, был использован коэффициент Жаккара. Генетическое сходство для пар образцов дуба представлено в таблице 17.
Наиболее генетически близки образцы № 1 и № 2. При этом наиболее генетически удаленными являются № 7 и № 8, № 8 и № 10, № 12 и № 11, № 7 и № 11, № 1 и № 7, № 2 и № 7, № 3 и № 8, № 3 и № 11, № 3 и № 1, № 3 и № 2, № 5 и № 9, № 5 и № 3, № 7 и № 13, № 10 и № 13.
Из таблицы 8 следует, что выделенный как плюсовой образец Q. r. var. tardiflora 1 (образец № 6) имеет относительно высокое сходство с образцами Q. r. var. praecox 1-5 (образцы № 1-5) и низкую степень сходства с собственным семенным поколением (образцы № 7-11). Данное явление может быть результатом эффекта инцухта при самоопылении. При этом, как отмечено выше, Q. r. var. tardiflora 1 (образец № 6) по своим фенотипическим признакам также значительно отличается от остальных образцов.
В целом, проведенный анализ показывает высокий полиморфизм в группе образцов Q. robur, отобранных из искусственной популяции Ботанического сада ЮФУ. Изученные ISSR-маркеры могут с высокой надежностью использоваться для генетической паспортизации уникальных и коллекционных образцов видов рода Quercus и последующей их идентификации. Однако, их применение не позволяет эффективно дифференцировать фенологические формы Q. robur, произрастающие в сходных экологических условиях.