Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 13
1.1. Тяжелые металлы - опасные загрязнители окружающей среды 13
1.1.1. Источники техногенного загрязнения почвы тяжелыми металлами 13
1.1.2. Влияние тяжелых металлов на почвенные микроорганизмы 17
1.1.3. Влияние тяжелых металлов на почвенные ферменты 20
1.1.4. Механизмы устойчивости микроорганизмов к тяжелым металлам 23
1.1.5. Использование микроорганизмов в биотехнологии очистки воды от тяжелых металлов 1.2. Экологическое состояние почв в районах подземных хранилищ природного газа 33
1.3. Применение микробиологических, ферментативных и магнитных показателей в экологическом мониторинге почв в условиях антропогенного загрязнения 36
Глава 2. Материалы и методы 43
2.1. Почвенные пробы и характеристика территорий 43
2.1.1. Характеристика г. Медногорска Оренбургской области 43
2.1.2. Характеристика п.г.т. Степное и Степновского подземного хранилища природного газа Саратовской области 44
2.1.3. Характеристика г. Красный Кут Саратовской области 46
2.1.4. Отбор и подготовка почвенных проб для анализов 47
2.2. Эколого-геохимические и петромагнитные методы изучения почв 49
2.3. Микробиологический анализ почв 51
2.4. Определение активности почвенных ферментов и расчет интегрального показателя биологического состояния почвы 53
2.5. Бактериальные штаммы и методы их изучения 55
Глава 3. Эколого-функциональная характеристика микробоценозов высокомагнитных почв г. Медногорска Оренбургской области 59
3.1. Микробиологический анализ почв г. Медногорска в сочетании с оценкой ферментативных и магнитных показателей 59
3.1.1. Общая численность гетеротрофных микроорганизмов в почвенных микробоценозах г. Медногорска 63
3.1.2. Численность железоокисляющих и марганецокисляющих микроорганизмов в почвенных микробоценозах г. Медногорска 65
3.1.3. Результаты оценки активности ферментов в почве г. Медногорска 71
3.2. Экологический потенциал микроорганизмов, выделенных из высокомагнитной почвы г. Медногорска, для использования в очистке воды от повышенного содержания железа 76
3.2.1. Железоокисляющая активность микроорганизмов, выделенных из высокомагнитной почвы г. Медногорска 76
3.2.2. Результаты идентификации микробных штаммов с максимальными ростовыми характеристиками и железоокисляющей активностью 85
Глава 4. Эколого-функциональные особенности микробных сообществ слабомагнитных степных почв в условиях слабого и умеренного техногенного воздействия в малопромышленных городах Саратовской области 90
4.1. Регионально-типологические особенности микробоценозов почвы п.г.т. Степное 91
4.2. Регионально-типологические особенности микробоценозов почвы г. Красный Кут 103
Глава 5. Специфика развития организмов микробных сообществ почвы с повышенным термомагнитным эффектом над Степновским подземным хранилищем природного газа Саратовской области 113
5.1. Оценка количественных изменений в микробоценозах почвы над Степновским подземным хранилищем природного газа 115
5.2. Результаты анализа активности ферментов в почве над Степновским подземным хранилищем природного газа и корреляционных взаимосвязей 124
Заключение 129
Список использованной литературы 136
Приложение А. Свидетельство о государственной регистрации базы данных 169
Приложение Б. Результаты анализа нуклеотидной последовательности микроорганизмов 170
- Механизмы устойчивости микроорганизмов к тяжелым металлам
- Микробиологический анализ почв г. Медногорска в сочетании с оценкой ферментативных и магнитных показателей
- Регионально-типологические особенности микробоценозов почвы п.г.т. Степное
- Результаты анализа активности ферментов в почве над Степновским подземным хранилищем природного газа и корреляционных взаимосвязей
Механизмы устойчивости микроорганизмов к тяжелым металлам
Известно, что многие микроорганизмы адаптировались к присутствию в окружающей среде токсичных ТМ. Когда концентрации ТМ в бактериальной клетке превышают допустимые уровни, активируются механизмы резистентности, необходимые для выживания бактерий в неблагоприятной среде (Navarro et al., 2013). Показано, что микроорганизмы, обитающие в загрязненной ТМ окружающей среде, более устойчивы к металлам, чем микроорганизмы из незагрязненных областей (Witter et al., 2000; Bahig et al., 2008).
Известно несколько систем, обеспечивающих резистентность прокариот к действию ТМ и адаптацию к средам, содержащим эти металлы. Во-первых, это специфические системы для детоксикации Hg, оксианионов As и Си. Во-вторых, у ряда прокариот функционируют системы, ответственные за выведение ионов ТМ из цитоплазмы, которые состоят из белков субсемейств RND (от англ. Resistance-Nodulation-cell Division), CDF (от англ. Cation Diffusion Facilitation) или специфических Р1-АТФаз. Также, у некоторых цианобактерий выявлены металлотионины, связывающие избыток Zn (Guffanti et al., 2002; Barkay et al., 2003; Nies, 2003). При этом бактериальный штамм может одновременно обладать несколькими механизмами защиты (Pishchik et al., 2016).
Резистентность микроорганизмов к ТМ обеспечивается следующими механизмами: удалением ТМ барьером проницаемости; активным транспортом ТМ из клетки; внутриклеточным связыванием ТМ с белками; внеклеточной секвестрацией; ферментативной детоксикацией ТМ до менее токсичной формы; уменьшением чувствительности клеточных мишеней к ТМ. Существует несколько факторов, определяющих степень устойчивости микроорганизма к ТМ: тип и количество механизмов поглощения металлов; роль металла в нормальном метаболизме; наличие генов, контролирующих резистентность к ТМ, локализованных в хромосомах, плазмидах или транспозонах (Багаева и др., 2013; Joonu, Averal, 2016). Сообщалось, что присутствие R-плазмид в устойчивых к ТМ бактериях было выше, чем в обычных бактериях (Zolgharnein et al., 2007).
Препятствием к попаданию ионов ТМ внутрь клетки может являться клеточная стенка бактерий, мембрана или капсула. Бактерии могут связывать ионы ТМ поляризованными группами капсулы или клеточной стенки, такими как карбоксильные, гидроксильные, амино- и фосфатные группы (Dixit et al., 2015). У дрожжей участками связывания РЬ в клеточной стенке служат молекулы белков, U - фосфатные группы. У бактерий p. Bacillus участками связывания двухвалентных катионов ТМ служат карбоксильные группы пептидогликанов. У Citrobacter sp. РЬ адсорбируется на поверхности клеток в виде фосфата. К механизмам, благодаря которым ионы ТМ связываются с клеточной стенкой микроорганизмов, относятся: электростатическое взаимодействие, изменение редокс-потенциала, ковалентное связывание, силы Ван-дер-Ваальса, внеклеточное связывание или сочетание этих процессов (Pishchik et al., 2016). Для многих бактерий описана способность сорбировать на клеточной стенке или поглощать ионы ТМ внутриклеточно. К ним относятся представители родов Athrobacter, Bacillus, Klebsiella, Lactococcus, Pseudomonas, Rhodopseudomonas, Rhizobium, Serratia, а также цианобактерии, дрожжи и др. (Pishchik et al., 2016). У бактерий семейства Pseudomanadaceae, Enterobacteriaceae, Moraxelaceae описана способность связывать ионы ТМ внеклеточными биополимерами.
Важной стратегией, используемой всеми микроорганизмами для выживания при высоких концентрациях ТМ, является образование биопленок. В них происходит секвестрация металла, поскольку внеклеточные полимеры, клеточные мембраны и клеточные стенки микроорганизмов обеспечивают множество катионных и анионных участков для взаимодействия с ионами ТМ и их биосорбции (Navarro et al., 2013).
Микроорганизмы способны концентрировать ТМ внутри клеток или на их поверхности в высокой концентрации. Распределение аккумулированных ТМ зависит от самого металла и вида микроорганизма. Так Ag, Hg, Cd, U сорбируются грибами и бактериями на поверхности клеток, проникая внутрь частично. Ионы Ni, Со, Mn, Си, Zn чаще транспортируются внутрь клетки. Конечная концентрация металла внутри клетки может быть на несколько порядков выше его концентрации в окружающей среде. В одних случаях накопление соответствующих соединений оказывается летальным, а в других - нет. На поглощение ионов ТМ могут оказывать влияние физиологическое состояние клеток и условия окружающей среды. Скорость процесса аккумуляции ТМ в одних случаях исчисляется секундами с момента контакта микробных клеток с металлом, в других - составляет несколько часов. Для адсорбционных процессов свойственна быстрая аккумуляция, длительная аккумуляция зависит от активного транспорта внутрь бактериальных клеток.
Содержание в микробных клетках ТМ зависит от вида микроорганизма, условий окружающей среды и ряда других факторов. Известно о накоплении Cd у бактерий кишечной группы, которое составляет 0,7-89,0 мг/г сухой биомассы. РЬ накапливается микробными клетками в значительно больших концентрациях, так, у бактерий Azotobacter sp. и Micrococcus luteus его содержание достигало 3,1-4,9х102 мг/г сухой биомассы, у бактерий Citrobacter sp. - 1/3 от веса сухих клеток. Количество U у бактерий Saccharomyces cerevisiae и Pseudomonas aeruginosa может достигать 10-15 % от веса сухой биомассы. Содержание ТМ в микробной биомассе увеличивается почти линейно с увеличением его содержания в среде, но до определенной концентрации (Багаева и др., 2013).
Биохимические механизмы толерантности микроорганизмов к соединениям ТМ связывают с возможным механизмом снижения аккумуляции ТМ за счет конкуренции и обмена их с протонами на поверхности клеток и выходом К+ и Mg2+. Микробные клетки обладают также способностью осуществлять энергозависимый экспорт металла. Обезвреживание ТМ происходит в результате их связывания, метилирования, хелатирования, осаждения и трансформации в малотоксические формы, связанной с изменением валентности ТМ, диметилированием или образованием металлорганических соединений (Багаева и др., 2013). Например, у грамотрицательных бактерий происходит связывание катионов ТМ с белками, богатыми цистеином, которые локализованы в клеточной мембране.
Основная стратегия, используемая бактериями, в том числе, металлофилами, в системах защиты от повреждающего действия ТМ, заключается в синтезе и активации специальных систем, выводящих металлы из цитоплазмы. В зависимости от низких или высоких концентраций металла системы транспорта различаются. Описаны белки RND-семейства, участвующих в процессах резистентности к ТМ, формировании клубеньков и клеточном делении. Белки, обозначенные как HME-RND (от англ. Heavy Metal Resistance-Nodulation-cell Division), формирующие выводящие системы для ТМ, локализованы в плазматической мембране и образуют единый комплекс с двумя другими компонентами - с периплазматическим адаптерным белком MFP (от англ. Membrane Fusion Protein) и с белками внешней мембраны OMF (от англ. Outer Membrane Factors). В результате субстраты могут выводиться из цитоплазмы прямо в среду (Nies, 2003). Белки семейства CDF встречаются у организмов всех трех доменов жизни, основным субстратом для них является Zn2+, хотя они могут также принимать участие в экспорте Со2+, Ni2+, Cd2+ и Fe2+. Обычно бактерии содержат один или несколько генов, кодирующих белки этого семейства. Активность CDF-белков зависит от протондвижущей силы. Эти белки могут действовать как системы вторичной фильтрации для Ni2+ (Guffanti et al., 2002). АТФазы Р-типа объединены в большое суперсемейство транспортных белков, получающих энергию в результате гидролиза АТФ, субстратами для них являются неорганические катионы (Sharma et al., 2000).
Еще одним механизмом обезвреживания ТМ может служить образование нерастворимых сульфидов ТМ в результате их взаимодействия с сероводородом, образующимся в клетках. Сульфиды ТМ аккумулируются на поверхности клеток, не проникая в цитоплазму. Этот механизм описан для бактерий Desulfovibrio desulforicans, Klebsiella aerogenes, Clostridium cochlearium и некоторых других (Пухова, 2006). В некоторых случаях устойчивость к ТМ у микроорганизмов может быть связана с синтезом детоксицирующих ферментов. Например, адаптация Bacillus megaterium к высокому содержанию в среде Se связана с образованием в среде фермента селенредуктазы, с помощью которого растворимые соединения Se переводятся в нерастворимые и обезвреживаются (Пухова, 2006). ТМ не могут быть полностью разрушены, но в результате трансформации они становятся более гидрофильными и менее токсичными (Dixit et al., 2015).
Микробиологический анализ почв г. Медногорска в сочетании с оценкой ферментативных и магнитных показателей
В современном мире соединения ТМ являются повсеместными загрязнителями почвенного покрова (Robert, 2010; Zhang et al., 2012; Su et al., 2014). Интенсивная антропогенная деятельность в пределах крупных городов приводит к формированию урбоэкосистем с уничтоженным или сильно измененным почвенным покровом. ТМ влияют на биологические свойства почв, ингибируя активность почвенных ферментов (Tuomela et al., 2005), что связано как с подавлением биохимической активности микроорганизмов (Галиулин, Галиулина, 2006; Кудряшов, 2010), так и с уменьшением их количественного и качественного состава (Murata et al., 2005). В результате почвы утрачивают свои уникальные свойства: способность поддерживать гомеостаз и эффективно осуществлять биологический круговорот, почвенное плодородие. Почва не только накапливает все загрязнители, но и выступает в роли переносчика химических элементов в атмосферу, гидросферу и растения, через которые они передаются на самые высокие трофические уровни (Семенова, Рафикова, 2010; Liu et al., 2005; Motuzova et al., 2014).
Известно, что магнитная восприимчивость почвы отражает наличие в ней магнитных минералов, в первую очередь, минералов группы железа (Бабанин и др., 1995), которые могут сорбировать и агрегировать многие ТМ (Васильев, Чащин, 2011; Водяницкий, Шоба, 2015; Lu, Bai, 2006; Zhang et al., 2011). В ряде работ установлены высокие корреляционные связи между подвижными/валовыми формами ТМ и значением магнитной восприимчивости в различных типах городских почв. Получены достоверные корреляционные связи магнитной восприимчивости с содержанием таких металлов, как Fe, Си, Cd, Zn, Ni, Pb в почве г. Лондона и г. Манчестера (Англия), г. Лауди и г. Лоян (КНР), г. Исфагана (Ирак), г. Москвы, г. Чусовой, г. Саратова и др. (Гладышева, 2007; Чащин, 2010; Решетников, 2011; Строганова и др., 2012; Robertson et al., 2003; Zhang et al., 2012). На основании многочисленных измерений магнитной восприимчивости почв М.В. Решетников с соавт. (2011) предложил следующую шкалу значений коэффициента магнитности, которая отражает уровень содержания железа в почве: Kmag \ - допустимый уровень содержания магнитных минералов железа; \ Kmag \,5 - умеренный уровень; l,5 Kmag 3 -опасный уровень; Kmag 3 - чрезвычайно опасный уровень.
Исходя из вышесказанного, мы предположили, что в почве с чрезвычайно опасным уровнем содержания железа (Kmag 3) будут повышенные концентрации ТМ и, как следствие, возможны изменения в почвенных микробоценозах.
При исследовании почв г. Медногорска пробы отбирали с разных урболандшафтных зон, которые были выделены по результатам изучения комплекса природных и техногенных факторов на участках (оценка геоморфологической позиции участка, экзогенных процессов, типа почвы, учет водотоков, этажности и состояния селитебной застройки, типов производства, интенсивности движения на автотрассах, зон рекреации, свалок и т.д.). Был применен петромагнитный метод анализа почв для выявления зон, потенциально опасных по загрязнению ТМ, в первую очередь, железом и марганцом.
Изучив магнитные, механические и физико-химические свойства 70 почвенных проб г. Медногорска, степень антропогенной трансформации почвенного покрова, для микробиологического и ферментативного анализа мы отобрали пробы, которые отличались максимально высокими значениями коэффициента магнитности (Kmag 3) и максимальной степенью антропогенной нагрузки (табл. 2).
В производственной зоне г. Медногорска расположены многочисленные цеха ОАО «Медногорский медно-серный комбинат». На территории находятся заводские трубы, производящие выбросы в атмосферу загрязняющих веществ. Рядом с цехом серной кислоты и брикетным цехом зафиксированы сливы технологических жидкостей, которые по прорытым канавам сливаются в пруды-накопители, расположенные к западу от территории завода. По периметру всего предприятия расположены отвалы шлака медно-серного производства, высота отвалов достигает в некоторых местах 50-80 м. Рядом с территорией комбината зафиксирован техногенно измененный участок (проба №2). На почву производится слив технологических жидкостей. Образовался временный водоток, глубина которого около 15-20 см. Вокруг водотока обнаружены измененные грунты. Растительность на техногенно измененной территории отсутствует. Степень антропогенной трансформации среды - сильная, общее геоэкологическое состояние - катастрофическое.
Пробы №1 и 4 были отобраны с селитебно-транспортной зоны, в районе железнодорожного вокзала, источники загрязнения - проходящие поезда и автомобили. Интенсивность движения автотранспорта в точке отбора №1 составляла 760 авт./час, в точке №4 - 132 авт./час.
В качестве условного контроля были проанализированы пробы почвы №11, 12 и 13 с низким коэффициентом магнитности (Kmag \) и слабым техногенным воздействием. Данные пробы были отобраны с селитебной зоны, в районах малоэтажных застроек, характеризующихся не заасфальтированными дорогами, редким движением автотранспорта.
Известен ряд методологических подходов к оценке экологического состояния почв, и среди них микробиологический метод, на наш взгляд, является наиболее чувствительным. Микробиота обладает полифункциональностью, участвуя в противоположных реакциях, микроорганизмы осуществляют стабилизирующую функцию метаболического равновесия в природе. Микроорганизмы очень чувствительны к изменяющимся условиям существования благодаря большой поверхности контакта клеточной стенки со средой, а высокая скорость их размножения позволяет быстро выявлять изменения, возникающие под влиянием экологических факторов (Martinez-Salgado et al., 2010; Sumampouw, Risjani, 2014).
Регионально-типологические особенности микробоценозов почвы п.г.т. Степное
В ходе работы в 30 почвенных пробах п.г.т. Степное (рис. 2, глава 2) исследовали экологическое состояние почвенных микробоценозов с помощью эколого-геохимического, петромагнитного, микробиологического и ферментативного анализа. По классификации В.А. Алексеенко (2013) исследованная территория относится к группе ландшафтов небольших поселков, станиц, деревень и хуторов. Они представляют собой переход от сельскохозяйственных, степных и лесных ландшафтов к городским ландшафтам населенных пунктов.
Подвижные формы Сг обнаружены во всех пробах в концентрации от 1,33 до 4,22 мг/кг, со средним содержанием 1,98 мг/кг (табл. 6). Превышение над ПДК (6,0 мг/кг) (ГН 2.1.7.2041-06, 2006) не зафиксировано. Подвижные формы Zn зарегистрированы во всех пробах в концентрации от 4,38 до 15,74 мг/кг, со средним содержанием 7,08 мг/кг. Превышение над ПДК (23,0 мг/кг) (СанПиН 2.1.7.1287-03..., 2003) не отмечено. Cd в подвижной форме определен во всех пробах в концентрации от 0,08 до 0,11 мг/кг, со средним содержанием 0,09 мг/кг и при ПДК (1,0 мг/кг) (ГН 2.1.7.2041-06..., 2006). Его коэффициент опасности находится в диапазоне от 0,08 до 2,19 со средним значением 0,34. Превышение над ПДК не зафиксировано. Подвижные формы № обнаружены во всех пробах в концентрации от 7,66 до 14,20 мг/кг, со средним содержанием 9,70 мг/кг и при ПДК 4,0 мг/кг (ГН 2.1.7.2041-06..., 2006). Его коэффициент опасности варьирует в пределах от 1,92 до 3,55 со средним значением 2,42. Превышение над ПДК отмечено во всех пробах, максимальное превышение зарегистрировано в пробе № 3 (3,55 ПДК). РЬ в подвижной форме выявлен во всех пробах в концентрации от 3,64 до 7,62 мг/кг, со средним содержанием 4,99 мг/кг и при ПДК 6,0 мг/кг (ГН 2.1.7.2041-06..., 2006). Его коэффициент опасности изменяется в пределах от 0,61 до 1,27 со средним значением 0,83. Превышение над ПДК зарегистрировано в четырех пробах, максимальное превышение - в пробе № 3 (1,27 ПДК). Подвижные формы Си выявлены во всех пробах в концентрации от 3,05 до 7,82 мг/кг, со средним содержанием 4,56 мг/кг и при ПДК 3,0 мг/кг (Кузнецов и др., 1992).
Его коэффициент опасности варьирует в пределах от 1,02 до 2,61 со средним значением 1,52. Превышение над ПДК зарегистрировано во всех пробах, максимальное превышение - в пробе № 3 (2,61 ПДК).
Установлен геохимический ряд для подвижных форм ТМ на территории п.г.т. Степное: Ni Zn Pt»Cu Cr Cd (по средней концентрации) и Ni Cu Pt»Cr Zn Cd (по превышению над нормативными показателями). Анализ полученных данных позволил распределить элементы на две группы: первая - Ni, Pb, Си, в этой группе в пробах наблюдается превышение над ПДК; вторая - Zn, Сг и Cd, в этой группе не зарегистрировано превышений над ПДК. Расчет суммарного коэффициента загрязненности выявил следующее - на исследованной территории Zc изменяется в пределах от -0,8 до 3,92. К категории с допустимым уровнем загрязнения (Zc от 0 до 16 ед.) относятся все 30 проб (100 %) (Методические рекомендации..., 1990), что согласовалось с результатами определения магнитной восприимчивости почвы п.г.т. Степное (табл. 6). Значения Kmag, как видно из табл. 6, во всех пробах почвы находились в пределах 1 единицы, что указывало на допустимый уровень содержания магнитных минералов железа по шкале М.В. Решетникова (2011), значения термомагнитного эффекта (dk l) соответствовали уровню для незагрязненных У В почв.
Результаты проведенного корреляционного анализа для выявления возможных парагенетических ассоциаций элементов указывали на наличие сильных корреляционных связей (г составлял от ±0,7 до ±1,0) в большинстве случаев (табл. 7). Это было правомерно для таких ассоциаций, как: Cr-Pb, Cr-Ni, Cr-Cu, Cr-Zn, Ni-Zn, Ni-Pb, Ni-Cu, Ni-Cd, Pb-Cu, Pb-Zn и Zn-Cu. Умеренные корреляционные взаимосвязи (г составлял от ±0,3 до ±0,699) были характерны для пар: Pb-Cd, Cr-Cd, Zn-Cd и Cd-Cu.
На основании этих результатов с учетом незначительных превышений над ПДК можно предположить, что элементы имеют, вероятно, единое минералогическое происхождение, унаследованное от материнских пород.
Как известно, к числу широко распространенных и опасных загрязнителей почвы, наряду с ТМ, относятся УВ (Лапина и др., 2007; Murata et al., 2005; Guo et al., 2012; Gennadiev et al., 2015). Нередко почва подвергается воздействию смешанного загрязнения, так, ТМ обнаружены в нефти и ее производных (Иванов, 2015), они являются сопутствующими загрязнителями нефтешламов.
В то же время, способность трансформировать УВ в безопасные соединения естественным путем характерна для разнообразных представителей микробиоты, относящихся к физиологической группе УОМ (Wilkinson et al., 2002). При наличии в почве свежего углеводородного загрязнения содержание УОМ, как правило, увеличивается (Панов и др., 2013). В связи с вышесказанным, мы оценили в почве п.г.т. Степное не только ОЧГМ, но и численность УОМ. В большинстве исследованных микробоценозов слабомагнитной почвы п.г.т. Степное ОЧГМ находилась в пределах от 24,8 до 99,4x105 КОЕ/г почвы (рис. 18А); численность FeOM составляла от 4,6 до 34,7х105 КОЕ/г почвы (рис. 18В). Между ОЧГМ и численностью FeOM был выявлен достоверный коэффициент прямой корреляции г=0,63 (p 0,0\) (табл. 7) и умеренная прямая корреляция (R2=0,39, приp 0,01).
Количество УОМ в 18 микробоценозах находилось в диапазоне от 29,5 до 86,0х105 КОЕ/г почвы (рис. 18Б). Эти показатели численности бактерий соответствовали нормальным показателям для темно-каштановых почв. В микробоценозах трех проб (№1, 2иЗ), которые были отобраны в северозападной части п.г.т. Степное, ОЧГМ и численность УОМ была ниже, составляя 4,3-12,4х105и2,7-15,8хЮ5КОЕ/г почвы, соответственно.
В микробоценозах проб №1 и 2 низким было также количество FeOM (0,04 и 0,01x105 КОЕ/г почвы). Данные микробоценозы характеризовались максимально высокими значениями суммарного коэффициента загрязненности (Zc= 1,56-3,92 ед.) (табл. 6). Отклонения от средних значений изученных микробиологических показателей обнаружены еще в нескольких микробоценозах (рис. 18). Наиболее заметные вариации наблюдались в численности углеводородокисляющих микроорганизмов, которые были приурочены к определенным районам поселка, что, возможно, связано с локальным углеводородным загрязнением (Панов и др., 2013).
Между количеством бактерий исследованных эколого-физиологических групп и концентрацией ТМ в почве п.г.т. Степное не обнаружено сильных корреляционных связей (табл. 7). Можно отметить невысокий коэффициент прямой корреляции (г=0,37, p 0,01) между численностью У ОМ и концентрацией Cd (табл. 7). Известно, что Cd нередко содержится в нефтепродуктах (Mansfied et al., 1999; Vhoja, 2006), поэтому, даже если из загрязненной почвы с течением времени удаляются летучие УВ или УВ подвергаются биодеградации, то Cd, аккумулируясь в почве, может продолжать оказывать воздействие на почвенный биоценоз.
В условиях слабомагнитной почвы малопромышленного города п.г.т. Степное со слабым техногенным воздействием был отмечен низкий и очень низкий уровень активности дегидрогеназ и инвертаз. АД составляла от 1,01 до 2,36 мг ТФФ/10 г почвы за сутки (табл. 8; рис. 19А). В трех пробах (№18, 25 и 30) активность была очень низкой: 1,0 мг ТФФ/10 г почвы за сутки. АИ в ряде проб почвы п.г.т. Степное была 5,0 мг глюкозы/г почвы за сутки (№10-20, 25, 26, 28 и 30), в остальных пробах находилась в диапазоне от 5,0 до 11,0 мг глюкозы/г почвы за сутки (табл. 8; рис. 19Б).
АД достоверно коррелировала с концентрацией ряда ТМ в почве: положительный коэффициент корреляции обнаружен между АД и концентрацией Ni (r=0,67, pх0,01), Cr (r=0,66, pх0,01), Zn (г=0,64, pх0,01) и суммарным коэффициентом загрязненности Zc (г=0,62, pх0,01) (табл. 7). Достоверная положительная корреляция выявлена между АИ и концентрацией № (г=0,57, pх0,01). Известно, что ТМ в невысоких концентрациях могут оказывать стимулирующее действие на активность почвенных ферментов (Гузев, Левин, 2001). Это позволило нам предположить, что данные ТМ в соответствующих концентрациях не оказывали негативного действия на почвенные дегидрогеназы и инвертазы.
Нами был выявлен средний и высокий уровень активности каталаз и пероксидаз в почве п.г.т. Степное (табл. 8; рис. 19В), свидетельствующий об отсутствии патологических изменений в почве. В пяти пробах почвы п.г.т. Степное (№ 15, 16, 19, 20, 28) наблюдался средний уровень АК (3,90-8,55 мл 0,1 н КМпСУч), остальные 25 изученных проб характеризовались высокой активностью (10,65-23,05 мл 0,1 н КМпСУч). Таким образом, в отличие от дегидрогеназ, которые, как известно, могут ингибироваться, например, УВ и продуктами их деградации, находящимися в почве в течение длительного времени (Margesin et al., 2000; Sumampouw, Risjani, 2014; Utobo, Tewari, 2015), каталазы в почве п.г.т. Степное не подвергались токсическому воздействию загрязнителей почвы.
В отличие от дегидрогеназ и каталаз, почвенные пероксидазы имеют преимущественно растительное происхождение. Авторами (Квеситадзе и др., 2005; Gianfreda et al., 2006; Muratova et al., 2009) показано, что растения выделяют в почву вместе с корневыми экссудатами ферменты, способные окислять органические вещества почв (фенолы, амины, некоторые гетероциклические соединения) за счет кислорода Н202 и других органических перекисей, накапливающихся в почве при действии некоторых оксидаз и в результате жизнедеятельности микроорганизмов. Имеются сведения об ингибировании пероксидаз под действием ТМ (Ofoegbu et al., 2013) и нефтяных УВ (Margesin et al., 2000). Известно также, что пероксидазы - индуцибельные ферменты, и контакт корней растения с поллютантами типа ПАУ индуцирует пероксидазную активность, которая может иметь внутриклеточную функцию как часть защитного механизма и/или непосредственно влиять на деградацию ароматических соединений в окружающей среде (Kraus et al., 1999). Показано, что низкие концентрации нефти и нефтепродуктов стимулируют активность этих ферментов за счет фенольных соединений, а средние и высокие концентрации ингибируют активность пероксидаз.
Результаты анализа активности ферментов в почве над Степновским подземным хранилищем природного газа и корреляционных взаимосвязей
Как известно, загрязнение УВ приводит к ухудшению агрохимических, агрофизических и биохимических характеристик почв (Новоселова и др., 2016; Wyszkowska, Wyszkowski, 2010; Achuba, Okoh, 2014). При отборе проб с территории ПХГ мы постарались учесть, что данная территория неоднородна. На ней выделяются участки, которые находятся в пределах внутреннего или внешнего контура газоносности или за пределами контура газоносности (рис. 26). Эти зоны различаются потоком газа, поэтому мы исследовали пробы почвы, отобранные с различных зон, и не исключали обнаружение зависимости исследованных микробиологических и ферментативных показателей почвы от месторасположения почвенных проб.
Известно, что ни один биологический процесс в почве не совершается без участия дегидрогеназ, активность которых непосредственно указывает на интенсивность процессов разложения УВ в почве и зависит от экологических условий (Pascual et al., 2000; Makoi, Ndakidemi, 2008; Kumar et al., 2013). AK также является информативным показателем, отражающим биологическую активность почвы при углеводородном загрязнении (Maila, Cloete, 2005).
АД в почве ПХГ составляла от 0,449 до 1,835 мг ТФФ/10 г почвы за сутки, указывая на очень низкую и низкую активность почвенных дегидрогеназ (табл. 15).
Минимальные значения наблюдались в пробах №2 и 4 (0,449 и 0,549 мг ТФФ/10 г почвы за сутки), максимальные - в пробах №5, 7 и 9, составляя 1,515-1,835 мг ТФФ/10 г почвы за сутки.
Известно, что почвенные дегидрогеназы, как одни из самых чувствительных к углеводородному загрязнению ферментов, ингибируются нередко не самими УВ, а продуктами их трансформации, способными аккумулироваться в почве и оказывающими токсическое действие в течение длительного времени (Margesin et al., 2000; Sumampouw, Risjani, 2014; Utobo, Tewari, 2015).
В пробах с максимальными значениями АД была максимальной и АК, составляя от 7,8 до 10,2 мл 0,1 н КМпСУч (табл. 15). АК в других пробах была ниже: от 1,5 до 4,5 мл 0,1 н КМпО ч. Коэффициент прямой корреляции (г) между АД почвы и численностью МТМ составил 0,50 (п=10; p 0,05) (табл. 13). В почве с максимальными значениями АД и АК наблюдалось повышенное содержание облигатных МТМ. Учитывая, что микроорганизмы - основной источник продуцирования дегидрогеназ и каталаз в почву, повышенный уровень исследованных оксидоредуктаз в данных почвенных пробах, вероятно, связан с развитием специализированной микрофлоры в почвенных микробоценозах. Не исключено наличие в почве углеводородных субстратов, способствующих увеличению дегидрогеназной активности, а также различных перекисей (субстратов для каталаз), образующихся вследствие ответной реакции почвенного сообщества на поллютантный стресс. Уровень АИ был средний (11-46 мг глюкозы/г почвы за сутки) (табл. 15).
Анализируя полученные данные, мы обнаружили зависимость активности исследованных почвенных ферментов от месторасположения почвенных проб. В почвенных пробах, отобранных в пределах внутреннего или внешнего контура газоносности (рис. 27), где, предположительно, в почве наибольший поток газа, АД и АК была минимальной. Это может быть связано с ингибированием почвенных оксидоредуктаз УВ в результате их недавнего (свежего) поступления в почву. Также низкая активность данных ферментов в почве может быть обусловлена хроническим воздействием УВ или их окисленными продуктами. Напротив, в зоне 1 с наименьшим газовым потоком АД и АК в почве (пробы №5, 7 и 9) была выше, чем в других пробах, АИ, напротив, была сниженной.
Обнаружены высокие коэффициенты корреляции между показателями активности изученных ферментов, установлены их коррелятивные связи с магнитными свойствами почвы (табл. 13 и 14). Была выявлена значимая прямая корреляция между АД и АК (г=0,70; п=10; р 0,05) (табл. 13), (R2=0,49, при p 0,05) (табл. 14); значимая обратная корреляция между АД и АИ (г=-0,85; п=10; р 0,05) (табл. 13), (R2=-0,73, при p 0,05) (табл. 14); значимая обратная корреляция между АК и АИ (г =-0,83; п=10; р 0,05) (табл. 13), (R2=-0,68, при p 0,05) (табл. 14). Также обнаружена значимая прямая корреляция между АД и Kmag (г=0,68; п=10; р 0,05) (табл. 13), (R2=0,52, приp 0,05) (табл. 14) и обратная корреляция между Kmag и АИ (г=-0,65; п=10; р 0,05) (табл. 13). Установлена значимая прямая корреляция между АД и термомагнитным эффектом почвы (г=0,77; п=10; р 0,05) (табл. 13), (R2=0,60, при p 0,05) (табл. 14); АК и термомагнитным эффектом почвы (г=0,66; п=10; р 0,05), отрицательная корреляция между АИ и термомагнитным эффектом почвы (г=-0,64; п=10; р 0,05) (табл. 13). В результате проведенного корреляционного анализа был обнаружен очень высокий коэффициент прямой корреляции между рН и Eh почвы: r=R2=0,99; п=21; p 0,05 (табл. 13 и 14), выявлена значимая прямая корреляция между коэффициентом магнитности почвы и термомагнитным эффектом: г=0,69; п=21; p 0,05 (табл. 13), (R2=0,66, приp 0,05) (табл. 14).
Нам не удалось обнаружить сильных взаимосвязей между содержанием в почве микроорганизмов исследованных физиологических групп (гетеротрофных, метилотрофных, углеводород-, серо- и железоокисляющих) и значениями рН и Eh почвы. Невысокая значимая прямая корреляция наблюдалась между ОЧГМ и значениями рН почвы (г=0,40; п=21; p 0,05), обратная корреляция между ОЧГМ и значениями Eh (г=-0,40; п=21; p 0,05) (табл. 13). Коэффициент обратной корреляции между численностью SOM и коэффициентом магнитности составил -0,40 (п=12; p 0,05), достоверной корреляции между численностью SOM и термомагнитным эффектом почвы не обнаруживалось.
Значения ИПБС, рассчитанные по совокупности исследованных нами биологических параметров почвы, были низкими во всех пробах почвы над ПХГ, составляя от 12,7 до 18,2 %. В суммарной контрольной пробе (К) ИБПС был в несколько раз выше - 38,9 %.
Таким образом, результаты изучения микробиологических и ферментативных свойств почвы над Степновским ПХГ свидетельствовали о наличии загрязнителей (УВ и соединений серы). Выявленные взаимосвязи отражают реакции почвенных микроорганизмов на изменение экологических условий в почвенных ценозах.