Содержание к диссертации
Введение 6
Глава 1 Основные подходы к оценке безопасности биологически 12 активных веществ (Обзор литературы)
1.1 Холинэстеразы и ингибиторы холинэстераз 12
1.1.1 Основы избирательности действия ингибиторов холинэстераз 13
1.1.2 Общая характеристика и классификации ингибиторов 13
холинэстераз
1.1.3 Особенности нейротоксического действия 17
фосфорорганических и карбаматных ингибиторов холинэстераз
1.1.4 Молекулярные основы избирательности и безопасности 21
действия алкиламмониевых ингибиторов холинэстераз
1.2 Экотоксикологические аспекты применения ингибиторов 28
холинэстераз
1.2.1 Основные подходы к оценке экологической безопасности 30
химических веществ
1.2.2 Способность соединений к биодеградации в водной среде как 34
одно из условий безопасности
1.2.3 Биотестирование как метод оценки экологической 43
безопасности
1.2.4 Объекты альтернативной токсикологии и микробиотесты 44
Toxkit
Глава 2 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 50
2.1 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 50
2.1.1 Исследуемые соединения и лабораторные животные 50
2.1.2 Скрининговая оценка активности соединений на 51
млекопитающих
2.1.2.1 Оценка острой токсичности соединений 51
2.1.2.2 Оценка миорелаксантной активности в тесте «бег на 51
третбане»
2.1.2.3. Оценка миорелаксантной активности соединений в тесте 52
«вращающийся стержень»
2.1.2.4 Оценка коэффициента безопасности соединений 53
2.1.3 Биотестирование токсичности соединений на водных тест- 53
объектах
Биотестирование токсичности соединений на рачках Daphnia 54 magna
Биотестирование токсичности соединений на инфузориях 55 Paramecium caudatum
2.1.3.3 Биотестирование токсичности соединений на 56 микробиотестах Toxkit
Биотестирование токсичности соединений на водорослях 56 Algotoxkit
Биотестирование токсичности соединений на инфузориях 57 Protoxkit
2.1.3.3.3 Биотестирование токсичности соединений на 57
коловратках Rotoxkit
Биотестирование токсичности соединений на рачках 58 Thamnotoxkit
Биотестирование токсичности соединений на рачках 58 Ostracodtoxkit
Биотестирование хронической токсичности и эмбриотоксичности 59 соединения № 547 и прозерина на рачках Daphnia magna
Определение ингибирования поглощения кислорода активным 60 илом
Определение степени биодеградации соединений в водной среде 62
Определение антихолинэстеразной активности 63
2.8 Статистическая обработка полученных результатов 65
Глава 3. Токсикологическая характеристика алкиламмониевых и 66
фосфорилированных производных урацила
3.1 Алкиламмониевые ингибиторы холинэстераз на основе урацила: 66
миорелаксантная активность и безопасность
3.1.1 Влияние структурных факторов на биоактивность 69 соединений
Влияние длины и структуры ш-аммониоалкильной цепи 69 на активность 1,3-бис-(а>-аммониоалкил)-6-метилурацилдигалогенидов
Влияние природы заместителей в урациловом фрагменте 73 на активность 1,3-бис-(5-диэтил-о-нитробензиламмониопентил)-6-метилурацилдибромидов
3.1.1.3 Активность 1-[и-(замещенный 75
бензилдиалкиламмонио)алкил]-3)6-диметилурацилбромидов
3.1.1.4 Активность 3-(ю-бензилдиэтиламмониоал кил )-1,6- 77
диметилурацилбромидов
3.1.1.5 Активность алкиламмониевых производных, 79
содержащих замещенные пиримидиновые фрагменты
3.2 Фосфорилированные N-гетероциклы: миорелаксантная S6
активность и безопасность действия
3,2.1 Влияние структурных факторов на биоактивность 87 соединений
3.2.1.1 Влияние числа метиленовых групп в 87
фосфорилтиоалкильной цепи
3.2.1.2 Влияние расположения фосфорилтиоалкильной цепи в 88
урациловом фрагменте (N1- и ЫЗ-изомеры)
Влияние характера заместителей при фосфорном 89 фрагменте
Влияние характера заместителей в урациловом 89 фрагменте
3.3 Обсуждение 94
Глава 4. Эколого-токсикологическая характеристика Ю2
алкиламмониевых и фосфорилированных производных урацила
Острая токсичность соединения № 547 на водных тест-объектах 103
Хроническая токсичность и эмбриотоксичность соединения № 111 547 и прозерина на дафниях
Биодеградация алкиламмониевых производных урацила 118 в водной среде в тестах лабораторной симуляции
4.4 Отдаленные проявления антихолинэстеразной и 123
миорелаксантной активности соед. 547 в рамках теста лабораторной
симуляции условий окружающей среды
Заключение 126
Выводы 127
Список использованных библиографических источников 129
Приложение
Соед. № 547
Список сокращений
N~1СИ2)Ц-СИг~/ \ О QHs )=7
(СВДІЧ-СНг
соединение № 547 - 1,3-бис[5(диэтил-о-нитробензиламмонио)пентил]-6-метилурацилдибромид
ЛД50
,50
ЩЫЭДю
БуХЭ
Н(М)-ХР
ФОИ(С)
NOEC
биологически активное вещество
среднесмертельная доза вещества, вызывающая гибель
50% животных, взятых в выборку
среднесмертельная концентрация вещества, вызывающая
гибель 50% низших гидробионтов, взятых в выборку
(условно принята за показатель «экологической
безопасности» вещества)
среднеэффективная доза вещества, вызывающая
миорелаксантный эффект в тестах с функциональной
нагрузкой («бег на третбане», «вращающийся стержень»)
у 50% животных (мыши, крысы, собаки), взятых в
выборку
коэффициент безопасности (синонимы: широта
эффективного действия, терапевтический индекс;
условно принят за показатель «фармакологической
безопасности» вещества)
ацетилхолин
семейство холинэстераз
ацетилхолинэстераза (Н.Ф. 3.1.1.7)
бутирилхолинэстераза (Н.Ф. 3.1.1.8)
никотиновый (мускариновый) холинорецептор
периферический анионный пункт ацетилхолинэстеразы
фосфорорганические ингибиторы (соединения)
no observe effect concentration (наибольшая
недействующая концентрация)
Введение к работе
Актуальность работы. Поиск путей повышения экологической безопасности химических средств, разрабатываемых для использования в различных сферах потребления человека, принадлежит к числу важнейших проблем современности. Ингибиторы холинэстераз (ХЭ) составляют одну из самых обширных групп веществ, задействованных в медицине, сельском хозяйстве и др. (Голиков, Розенгарт, 1964; Бресткин и др., 1997; Pope et al., 2005). В частности, они широко применяются при ряде заболеваний (миастении, болезнь Альцгеймера и др.), требующих продления действия ацетилхолина (АХ) в синаптической щели, а также составляют ядро сельскохозяйственных пестицидов - ведущих экотоксикантов. Всем известным ингибиторам ХЭ присущ один общий и существенный недостаток - дозы (ЭДэо), в которых они оказывают практически полезный для человека эффект (терапевтический или иной) практически совпадают с дозами (ЛД50), вызывающими смертельно-опасное угнетение дыхания. В результате они и «лечат» и «убивают» практически в одних и тех же дозах - отношение ЛД50/ЭД50 не превышает 5,0. Эта весьма маленькая цифра отражает крайне низкий уровень избирательности и «фармакологической безопасности» традиционных ингибиторов ХЭ. Еще более низки уровни их «экологической безопасности» - в концентрациях (JIKso)) много меньших, чем 0,1 мкМ, большинство из них смертельно-опасны для представителей зоо- и фитопланктона, находящихся в основании трофических цепей водных биоценозов (дафнии и другие представители гидробионтов).
Общеизвестен факт о способности ингибиторов ХЭ в условиях функциональной нагрузки (бег и др.) неизменно вызывать у животных развитие миорелаксантного эффекта или мышечной слабости (Голиков, Розенгарт, 1964; Hobbiger, 1976; Matthew et al., 1988; Glavinovic, Narahashi, 1988; Baker, Sedgwick, 1996). Это свойство может быть использовано при направленной разработке новых ингибиторов ХЭ с более высокой
избирательностью действия в отношении ацетилхолинэстеразы (АХЭ; Н.Ф.3.1.1.7) локомоторных мышц, при котором достигается практически полезный эффект (фармакологическая коррекция функций синапсов локомоторных мышц) без смертельно-опасного поражения жизненно важных функций (дыхание и др.). Именно за счет более высокой избирательности действия в отношении локомоторных мышц новые ингибиторы ХЭ могут отвечать приемлемым нормам безопасности. Актуальной, в этой связи, является разработка более фармакологически и экологически безопасных ингибиторов АХЭ, избирательно влияющих на работу локомоторных мышц конечностей в дозах, далеко отстоящих от смертельных (парализующих дыхание) доз, т.е. имеющих отношение ЛД5(/ЭД5о>20Д и токсичность ЛК50(дафнии)>20,0 мкМ.
Целью исследования был анализ связи «структура-безопасность» в гомологических рядах Ы(ю-аммониоалкил)- и фосфорилированных N(co-оксиалкил)- урацилов, а также изучение биологической эффективности наиболее активных представителей ряда алкиламмониевых ингибиторов холинэстераз на основе урацила в тестах экологической токсикологии. Задачи исследования:
Определить и сопоставить токсикологические свойства алкиламмониевых урацилов со свойствами фосфорилированных урацилов на лабораторных мышах и дафниях.
Сопоставить особенности молекулярной структуры и характеристики безопасности представителей алкиламмониевых и фосфорилированных производных N-гетероциклов в отношении млекопитающих (мыши) и гидробионтов (дафнии, коловратки, простейшие, одноклеточные водоросли).
Классифицировать токсичность некоторых алкиламмониевых производных урацила в отношении лабораторных мышей и представителей гидробионтов. Выявить структурные факторы, ответственные за высокую токсичность данных соединений в отношении гидробионтов.
8 4. Определить безопасные для репродуктивной функции Daphnia magna концентрации (NOEC) 1,3-бис[5(диэтил-о-нитробензиламмонио)пентил]-6-метилурацилдибромида (далее соед. № 547) и прозерина в рядах 4-х последовательных поколений Daphnia magna (P-FrF2-F3). Определить способность соед. № 547 и его моно-производных к быстрой биодеградации и к сохранению антихолинэстеразной и миорелаксантной активности в естественных условиях среды.
Научная новизна. Впервые сопоставлены и выявлены особенности молекулярной структуры 18 алкиламмониевых урацилов (соединения типа № 547), обеспечивающие сочетание высоких значений их безопасности на лабораторных мышах (ЛД5о/ЭДзо~20,0-100,0) и гидробионтах (ЛК5о~20,0-500,0 мкМ). Определено, что концентрация 0,39 мкМ является безопасной для их репродуктивной функции (NOEC=1/60 от JIKso). Показано, что антихолинэстеразный и избирательный миорелаксантный потенциал соед. № 547 снижается в результате биодеградации на сроках более 1 месяца. Показана высокая токсичность и низкая безопасность фосфорилированных производных N-гетероциклов в отношении дафний и мышей.
Теоретическая значимость работы. Получены новые данные, представляющие фундаментальный научный и практический интерес с точки зрения разработки ингибиторов холинэстераз нового поколения, имеющих необычно высокие для ингибиторов холинэстераз показатели фармакологической (ЛД5о/ЭД505:20,0) и экологической (ЛК5о^20 мкМ) безопасности.
Практическая значимость работы. Необычно высокие для ингибиторов холинэстераз характеристики безопасности позволяют рассматривать соединения типа № 547 в качестве потенциальных средств диагностики или лечения миастений, а также средств, предназначенных для временной иммобилизации диких (в заповедниках, зоопарках и др.) и домашних животных. Низкая токсичность (ЛК5о^20,0 мкМ) соединений типа № 547 в отношении гидробионтов, находящихся в основании трофических
9 цепей водных биоценозов (дафнии и др.), может обеспечить повышенный уровень их экологической безопасности. Результаты проведенных исследований составляют теоретическую базу для направленной оптимизации молекулярной структуры соединений типа № 547 в сторону еще большего повышения показателей их избирательности и безопасности действия.
Отдельные разделы диссертационной работы используются при чтении специальных курсов «Экологическая фармакология» и «Экологическая токсикология» для студентов факультета географии и экологии Казанского государственного университета им. В.И. Ульянова-Ленина.
Основные положения, выносимые на защиту. Соединение № 547 и 5 его близких аналогов из числа изученных алкиламмониевых производных урацила проявляют необычно высокие для ингибиторов холинэстераз характеристики фармакологической безопасности (ЛД5о/ЭД5(50,0) в отношении представителей теплокровных, находящихся на вершине трофических цепей наземных биоценозов (мыши).
Низкая токсичность (ЛК50^20,0 мкМ) некоторых алкиламмониевых производных урацила (соединения типа № 547) в отношении представителей зоопланктона и фитопланктона, находящихся в основании трофических цепей водных биоценозов (дафнии, коловратки, простейшие, одноклеточные водоросли), обеспечивает повышенный уровень их экологической безопасности.
Личный вклад автора. Научные положения и выводы диссертации базируются на результатах собственных исследований автора. Анализ литературных данных, проведение лабораторных экспериментов по оценке острой и хронической токсичности соединений в отношении гидробионтов и млекопитающих, выбор метода исследования биодеградации и оценка степени биодеградации соединений, статистическая обработка полученных результатов также проведены лично автором. Соавторами статей являются научный руководитель к.б.н., доцент В.В. Зобов, а также сотрудники
10 лаборатории химико-биологических исследований ИОФХ, принявшие участие в обсуждении результатов работы (д.х.н., профессор B.C. Резник, к,х.н. В.Д. Акамсин, к.х.н. И.В. Галяметдинова) и учавствовавшие в выполнении ряда экспериментов (к.б.н. Л.А. Березинский, А.В. Ланцова); эксперименты по оценке остаточной антихолинэстеразной активности проведены сотрудниками кафедры аналитической химии КГУ д.х.н. Г.А. Евтюгиным, к.х.н. Е.А. Стойковой, которым автор приносит свою благодарность.
Апробация работы. Основные экспериментальные результаты работы доложены на II Съезде токсикологов России (Москва, 2003), II Congress of Ukrainian Toxicologysts (Kyiv, 2004), XIX Всероссийском съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Екатеринбург, 2004), V Всероссийском научном семинаре и молодежной научной школе «Химия и медицина. Новые лекарственные средства: успехи и перспективы» (Уфа, 2005), Итоговой научной конференции Казанского научного центра РАН (Казань, 2006).
Основные результаты работы изложены в 9 научных статьях и в 6 докладах на Всероссийских и Международных конференциях и съездах.
Структура и объем работы. Диссертация объемом 142 страницы текста состоит из введения, обзора литературы, главы материалы и методы исследований, глав собственных исследований, заключения, выводов, списка использованных библиографических источников, включающего 139 ссылок на отечественные (73) и зарубежные (66) работы, содержит 17 таблиц, 11 рисунков.
Диссертация выполнена при поддержке грантов Президента РФ «Ведущая научная школа» НШ-1063.2003.4, Федерального агенства по науке и инновациям «Научные школы» РИ-112/001/432, МНТЦ 2245р, РФФИ (регион) № 03-04-96215-а, РФФИ № 05-03-32497-а, НИОКР Академии наук Республики Татарстан № 03-3.8-209, № 09-9.3-278 на базе лаборатории химико-биологических исследований Института органической и физической
химии (ИОФХ) им. А.Е. Арбузова Казанского научного центра Российской академии наук и лаборатории экологического контроля Казанского Государственного университета.
