Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

Экотоксикологическая оценка почв и донных отложений импактной зоны Новочеркасской ГРЭС с помощью бактериальных lux-биосенсоров Хмелевцова Людмила Евгеньевна

Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Хмелевцова Людмила Евгеньевна. Экотоксикологическая оценка почв и донных отложений импактной зоны Новочеркасской ГРЭС с помощью бактериальных lux-биосенсоров: диссертация ... кандидата Биологических наук: 03.02.08 / Хмелевцова Людмила Евгеньевна;[Место защиты: ФГАОУ ВО «Южный федеральный университет»], 2018.- 150 с.

Содержание к диссертации

Введение

1 Обзор литературы 13

1.1 Состояние окружающей среды в Ростовской области 13

1.2 Методы экологического мониторинга состояния окружающей среды 17

1.3 Использование биоремедиационных подходов для очистки загрязненных территорий 24

1.4 Ферментативная деградация углеводородов микроорганизмами 31

1.5 Неспецифические механизмы микробной деградации углеводородов с помощью генерации АФК 49

2 Объект, материалы и методы исследования 59

2.1 Объект исследования 59

2.2. Материалы исследования 59

2.2.1 Использованные реактивы 59

2.2.2 Бактериальные культуры 60

2.2.3 Питательные среды 61

2.3 Методы исследования 62

2.3.1 Отбор проб почв и донных отложений импактной зоны Новочеркасской ГРЭС 63

2.3.2 Определение интегральной токсичности, генотоксичности и прооксидантных свойств почв и донных отложений Новочеркасской ГРЭС с помощью бактериальных lux-биосенсоров 66

2.3.3 Выделение штаммов углеводород-деградирующих микроорганизмов 69

2.3.4 Идентификация выделенных штаммов микроорганизмов 69

2.3.5 Определение генерации супероксид-анион радикала штаммами углеводород-деградирующих микроорганизмов 71

2.3.6 Определение генерации перекиси водорода штаммами углеводород-деградирующих микроорганизмов 71

2.3.7 Статистическая обработка и достоверность результатов 72

3 Результаты и обсуждение 73

3.1 Определение интегральной токсичности проб почв и донных отложений импактной зоны Новочеркасской ГРЭС с помощью природного люминесцентного штамма Vibrio aquamarinus ВКПМ В-11245 73

3.2 Определение генотоксичности, прооксидантных и белок-повреждающих свойств экстрактов почв и донных отложений импактной зоны Новочеркасской ГРЭС 75

3.3 Корреляционный анализ токсичности проб почв и донных отложений, определенной с помощью бактериальных lux-биосенсоров, и содержания ПАУ 80

3.4 Идентификация культивируемых ПАУ-деградирующих микроорганизмов, выделенных из почв и донных отложений импактной зоны Новочеркасской ГРЭС 82

3.5 Генерация супероксид-анион радикала штаммами углеводород деградирующих микроорганизмов при инкубации с различными углеводородами в качестве единственного источника углерода и энергии 84

3.6 Генерация пероксида водорода штаммами углеводород деградирующих микроорганизмов при инкубации с различными углеводородами в качестве единственного источника углерода и энергии 96

Заключение 121

Выводы 123

Список использованной литературы 126

Введение к работе

Актуальность исследования

Развитие промышленного комплекса юга России, кроме очевидных экономических и социальных преимуществ, влечет за собой и неблагоприятные последствия для окружающей среды региона. Техногенные катастрофы, такие как аварии на предприятиях нефтяной промышленности, крушения танкеров и т.д., а также загрязнения в процессе штатного функционирования различных объектов топливно-энергетического комплекса, металлургической и нефтехимических отраслей, автомобильных дорог приводят к накоплению различных поллютантов в окружающей среде, оказывая негативное влияние на здоровье и качество жизни населения.

Методы оценки загрязнения окружающей среды, применяемые в настоящий
момент, весьма разнообразны. Среди них выделяются методы биотестирования с
применением цельноклеточных бактериальных биосенсоров. Данные методы
отличаются высокой чувствительностью, производительностью, экспрессностью и
биологической адекватностью в сочетании с экономической эффективностью. В
качестве биологической части таких биосенсоров используются как природные
штаммы люминесцентных микроорганизмов, так и генно-инженерные штаммы, в
которых гены-репортеры поставлены под контроль различных, как правило,
индуцируемых токсикантами, промоторов. Природные микроорганизмы

применяют для оценки интегральной токсичности загрязненных сред. Генно-
инженерные штаммы чаще применяют для оценки групп поллютантов,
повреждающих те или иные компоненты клетки, либо оказывающие
специфическое токсическое воздействие. Так, например, существуют

цельноклеточные бактериальные биосенсоры, реагирующие на повреждение ДНК, белков, клеточных мембран и т.д. С другой стороны, сконструированы биосенсорные штаммы, дающие ответ на вещества, вызывающие в клетке окислительный стресс – усиление генерации супероксид-анион радикала, оксида азота или повышенную концентрацию пероксида водорода. Использование цельноклеточных бактериальных биосенсоров для экотоксикологической оценки загрязненных территорий - весьма перспективное и активно развивающееся направление.

Одним из наиболее эффективных и экономически выгодных способов очистки загрязненных почв является биоремедиация с использованием микроорганизмов-деструкторов (Chan, 2011).

Для успешного проведения микробиологической ремедиации необходим
тщательный подбор штаммов, так как каждая почва со своими физическими,
химическими, микробиологическими параметрами представляет собой

индивидуальную, живую, меняющуюся систему. При этом актуальной задачей является исследование как самих загрязненных территорий, так и механизмов, лежащих в основе процессов микробной трансформации и утилизации загрязняющих веществ.

Целью данного исследования является изучение экотоксикологических параметров почв и донных отложений импактной зоны НчГРЭС с помощью бактериальных lux-биосенсоров.

Для достижения цели исследования были поставлены следующие задачи:

1. Оценить токсичность почв и донных отложений импактной зоны
Новочеркасской ГРЭС с помощью батареи цельноклеточных бактериальных lux-
биосенсоров Vibrio aquamarinus ВКПМ B-11245, E. coli MG1655 (pRecA-lux), E.
coli
MG1655 (pKatG-lux), E. coli MG1655 (pSoxS-lux) и E. coli MG1655 (pIbpA-lux).

2. Выявить точки отбора проб почв, обладающих наибольшим уровнем
токсичности.

3. Сопоставить показатели токсичности, полученные с помощью lux-
биосенсоров, и литературные данные результатов химического анализа ПАУ.

4. Выделить и идентифицировать микроорганизмы - потенциальные
деструкторы ПАУ из почв и донных отложений НчГРЭС.

Основные положения:

1. 66,7 % проб почв и 100 % проб донных отложений импактной зоны
Новочеркасской ГРЭС обладают высокой интегральной токсичностью,
определенной с помощью люминесцентного сенсорного штамма Vibrio
aquamarinus
ВКПМ В-11245, а также содержат генотоксиканты промутагенной
природы, прооксиданты и вещества, повреждающие клеточные белки.

2. Наиболее токсичными, по результатам трехлетнего исследования с
помощью биосенсорного анализа, являются почвы, отобранные в точках 1, 3, 7, 11,
находящиеся в непосредственной близости к Новочеркасской ГРЭС.

3. Выявлена положительная корреляционная зависимость между
интегральной токсичностью почв, определенной с помощью штамма Vibrio
aquamarinus
ВКПМ В-11245, и содержанием в них нафталина. Отрицательная
корреляция зарегистрирована между удаленностью точки от Новочеркасской
ГРЭС и показателями токсичности, определенными с помощью биосенсоров Vibrio
aquamarinus
ВКПМ В-11245 и E. coli MG1655 (pIbpA-lux).

4. Основными представителями культивируемых ПАУ-деградирующих
микроорганизмов загрязненных почв и донных отложений импактной зоны
Новочеркасской ГРЭС являются бактерии родов Rhodococcus, Arthrobacter,
Pseudomonas
.

Научная новизна

С помощью биосенсорного анализа исследованы такие

экотоксикологические показатели почв окрестностей Новочеркасской ГРЭС, как общая (интегральная) токсичность, генотоксичность, прооксидантные свойства, наличие повреждающих белки веществ.

Изучено изменение уровня токсичности и генотоксичности почв и донных отложений импактной зоны Новочеркасской ГРЭС с 2013 по 2015 год.

Выявлены корреляционные зависимости между показателями токсичности, определенными с помощью lux-биосенсоров, и результатами химического анализа содержания ПАУ в исследуемых почвах донных отложениях.

Показана корреляционная зависимость между показателями токсичности, определенными с помощью lux-биосенсоров, и расстоянием до Новочеркасской ГРЭС.

Выделены и идентифицированы культивируемые формы ПАУ-

деградирующих бактерий микробоценозов импактной зоны Новочеркасской ГРЭС. Показана генерация супероксид анион-радикала и пероксида водорода штаммами ПАУ-деградирующих микроорганизмов при инкубации с различными углеводородами.

Практическая значимость

Экотоксикологические исследования с использованием батареи

цельноклеточных бактериальных lux-биосенсоров, реагирующих на различные группы поллютантов, способствуют внедрению этой технологии в практику экотоксикологического мониторинга окружающей среды и биологически адекватной оценке механизмов токсического действия различных поллютантов и их смесей на биологические объекты.

Выделенные из почв и донных отложений импактной зоны Новочеркасской ГРЭС культивируемые штаммы ПАУ-деградирующих бактерий могут найти непосредственное применение в биоремедиации загрязненных углеводородами территорий.

Полученные знания об участии активных форм кислорода в процессе биотрансформации углеводородов можно использовать для отбора перспективных в биоремедиации штаммов микроорганизмов.

По результатам поведенных исследований зарегистрированы две электронных
базы данных, которые могут быть использованы при проведении

экотоксикологического мониторинга окружающей среды.

Данные по загрязнению исследованных почв и донных отложений могут быть востребованы санитарными и экологическими службами ЮФО.

Материалы работы используются при чтении лекций и проведении практических занятий по курсам «Микробиология с основами биотехнологии», «Микробные трансформации».

Личный вклад автора. Тема, цель, задачи, объекты и методика проведения диссертационного исследования определены автором совместно с научным руководителем. Все экспериментальные работы проведены лично автором. Анализ полученных результатов, формулировка выводов и основных защищаемых положений выполнены автором работы при корректирующем участии научного руководителя. По теме диссертационного исследования автором или научным коллективом с участием автора опубликовано 36 научных работ (8,787 п.л.). Личный вклад автора составил 3,6 п.л.

Апробация работы. Результаты диссертационного исследования были
доложены на научно-практической конференции на базе Южного федерального
университета «Миссия молодежи в науке» (г. Ростов-на-Дону, 2012), Второй
Всероссийской научной конференции (с международным участием) «Окружающая
среда и устойчивое развитие регионов» (г. Казань, 2013), V Международной
научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии,

нанотехнологий и медицины» (г. Ростов-на-Дону, 2013г.), VI Международной
научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии,

нанотехнологий и медицины» (г. Ростов-на-Дону, 2015 г.), Всероссийском

семинаре с международным участием «Радиационная и промышленная экология», (г. Ростов-на-Дону, 2016), VIII Международной научно-практической конференции «Экологические проблемы. Взгляд в будущее» (БП и СОТ «Витязь» - БП и СОТ «Лиманчик», 8-11 сентября 2017 г.).

Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 36 работ, из них 3 работы в изданиях из перечня ВАК; 5 - в изданиях, индексируемых в библиографических базах данных Scopus и Web of Science; 2 базы данных.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 3 глав, выводов, списка литературы. Работа изложена на 150 страницах машинописного

Методы экологического мониторинга состояния окружающей среды

Значительная антропогенная нагрузка на различные биотопы делает актуальной задачу мониторинга состояния окружающей среды региона. В экологическом мониторинге широко используются различные физические (измерение шума, радиоактивности, электромагнитного излучения), химические, физико-химические (оптические, электрохимические, хроматографические методы), биологические методы (биотестирование и биоиндикация) анализа (Сотникова, 2011).

Химические методы анализа. К наиболее используемым в экологическом мониторинге методам химического анализа относят гравиметрию и титриметрию. Гравиметрические методы являются относительно точными (чувствительность анализа - 10-5 моль/л), но достаточно трудоемкими и времязатратными. Титриметрические методы имеют более низкую чувствительность (10-4 моль/л) по сравнению с гравиметрическими методами.

Физико-химические методы являются более точными, быстрыми и легко автоматизируемыми. Наиболее используемыми из них являются хроматографические, электрохимические и оптические методы исследования (Кузнецов, 1999). Хроматографические методы основаны на многократно повторяющихся процессах сорбции и десорбции. В экологическом мониторинге этими методами определяют ПАУ, пестициды, полихлорированные бифенилы, нитрозамины и другие поллютанты. Из электрохимических методов наиболее часто в экологическом мониторинге применяют потенциометрию (измерение электродного потенциала системы, используют для определения рН воды), полярографию (измерение тока системы; используют для определения поллютантов в сточных водах и воздухе), кондуктометрию (измерение электропроводности системы; используют для определения минерализации воды и содержания примесей в ней, содержания водорастворимых солей в почве), кулонометрию (измерение количества электричества, затраченного на электрохимическое превращение вещества; применяют для определения сложных органических соединений), электрогравиметрию (осаждение определяемого элемента на взвешенном электроде с помощью электролиза).

Оптические. К оптическим методам относится спектроскопия, заключающаяся в определении качественного и количественного состава вещества путем изучения электромагнитного излучения, поглощенного, отраженного или испущенного этим веществом.

Методы химического и физико-химического анализа позволяют получить достаточно точную информацию о содержании даже малых количеств поллютанта в пробах окружающей среды, что обусловливает специфичность химанализа. Но с другой стороны, проведение анализов этими методами часто занимает много времени, требует наличия соответствующего оборудования. Кроме того, эта группа методов позволяет оценить содержание только какого-либо конкретного вещества и сравнить его с нормированными показателями для этого соединения (ПДК).

С развитием современной промышленности в окружающую среду ежегодно попадает все большее количество новых поллютантов, для которых нет ПДК и не разработаны методики определения. И даже в случае соответствия концентрации загрязняющих веществ нормативам нельзя говорить о том, что живые организмы не подвергаются их негативному влиянию. Таким образом, используя только химические и физико-химические методы для мониторинга состояния окружающей среды, невозможно оценить суммарное влияние поллютантов различной химической природы на живые организмы. Недостатки химических методов анализа возможно компенсировать их совместным применением с биологическими методами мониторинга.

Биологические методы. В экологическом мониторинге обычно используют биоиндикацию и биотестирование (Еремеева, 2015). Эти методы основаны на оценке качества среды по состоянию и реакции помещенных в нее тест-организмов (биотестирование) либо организмов, обитающих в ней (биоиндикация). В отличие от химических методов анализа, основанных на сравнении измеренных концентраций поллютантов с их предельно допустимыми концентрациями (ПДК), биологические методы позволяют определить характер и степень влияния загрязняющих веществ на биологические системы, оценить их интегральное токсическое действие, которое является одной из главных причин негативных последствий антропогенного загрязнения окружающей среды (Холоимова, 2013).

Одним из первых методов биотестирования, в частности, водной среды, было изучение выживаемости микроскопических рачков Daphnia magna в исследуемых образцах. Данный метод биотестирования основан на определении изменений выживаемости и плодовитости дафний при воздействии токсических веществ, содержащихся в тестируемой воде по сравнению с контролем (Tothill, 1996). В нашей стране дафниевый тест рекомендован в качестве основного для контроля токсичности сточных вод и перспективного для оценки степени загрязнения природных вод. Кроме того, он обязателен при установлении ПДК отдельных веществ в воде рыбохозяйственных водоемов. Различные живые организмы по-разному реагируют на загрязняющие вещества, поэтому на сегодняшний день в мире используется большое разнообразие тест-объектов: от одноклеточных водорослей, мхов и лишайников, бактерий и простейших микроорганизмов до высших растений, рыб и теплокровных животных (Hassan, 2016).

Среди используемых для экологического мониторинга методов биотестирования в последнее время широко изучаются возможности биосенсорных систем (Salgado, 2011). Биосенсоры - это устройства, состоящие из чувствительной биологической части, связанной с преобразователем - физическим датчиком, регистрирующим реакцию сенсора на воздействие и переводящим этот сигнал в удобную для обработки форму. В качестве биологического чувствительного элемента могут быть использованы ферменты, нуклеиновые кислоты, клеточные мембраны, целые клетки, ткани и даже организмы (Тернер, 1992).

С помощью биосенсоров в пробах окружающей среды может быть определен широкий спектр загрязняющих веществ - фенол и его производные, токсичные ароматические амины, пестициды, гербициды, тяжелые металлы и др.(Gu, 2004). Преимуществами биосенсорного анализа проб окружающей среды являются простота применения, невысокая стоимость, чувствительность, специфичность и экспрессность. Большое значение для мониторинга состояния окружающей среды имеют биосенсоры на основе микроорганизмов, отличающиеся простотой, надежностью, дешевизной биологического материала (Belkin, 2003). Детекция сигнала происходит сразу от большого количества отдельных организмов, что повышает достоверность анализа.

Активно изучаются и используются биосенсоры на основе биолюминесцирующих бактерий (lux-биосенсоры), с помощью которых в различных объектах окружающей среды может быть обнаружен широкий спектр токсикантов, в том числе вызывающих повреждения ДНК, белков и мембран, индуцирующих окислительный стресс и др. (Vollmer,2004; Woutersen et al., 2011). Несмотря на то, что предел обнаружения отдельных соединений этим методом не настолько высок, как при использовании химических методов, lux-биосенсоры способны генерировать ответ на сумму веществ, таким образом позволяя спрогнозировать интегральное действие поллютантов, содержащихся в пробе, на живой организм.

Неспецифические механизмы микробной деградации углеводородов с помощью генерации АФК

Образование АФК в живых системах

Активные формы кислорода, такие как супероксид-анион радикал (O2-), пероксид водорода (H2O2), гидроксильный радикал (OH), синглетный кислород (1O2) - это частично восстановленные или возбужденные формы атмосферного кислорода (Mittler, 2016). Они могут функционировать в качестве сигнальных молекул, но при этом также рассматриваются как неизбежные токсичные побочные продукты аэробного метаболизма, способные генерироваться в любом клеточном компартменте, содержащем белки или молекулы с достаточно высоким окислительно-восстановительным потенциалом для возбуждения или передачи электрона атмосферному кислороду. Супероксид-анион радикал возникает при одноэлектронном восстановлении молекулярного кислорода, а затем способен превращаться в Н2О2 под действием фермента супероксиддисмутазы (рис. 1). В свою очередь, Н2О2 неферментативно генерирует ОН в присутствии ионов Fe2+ или Сu+, (реакция Фентона) (Владимиров, 2000).

Механизм реакции Фентона заключается в том, что в смеси перекиси водорода и соли железа (II) (реактив Фентона), Fe(II), окисляется до Fe(III), в то время как H202 восстанавливается до ОН", что сопровождается генерацией HO :

Fe2+ + Н202 Fe3+ + НО + ОН"

Так как железо (II) можно регенерировать при рН около 2,8-3,0, процесс становится каталитическим:

Fe3+ + H202 [Feni(H02)]2+ + Н+

[Feni(H02)]2+ Fe2+ + H02

или

Fe3+ + H02 Fe + О2+Н

Несмотря на то, Н2О2 является сильным двухэлектронным окислителем (стандартный восстановительный потенциал EрН=7 составляет 1.32V при рН 7.0), он обладает плохой или вообще отсутствующей реактивностью по отношению к большинству загрязняющих веществ или биологических молекул. Это является следствием высокого барьера энергии активации, указывая на то, что реакция окисления является кинетически контролируемым процессом.

Одноэлектронное восстановление делает H202 довольно слабым окислителем (EрН=7 составляет 0.38 V), но образующийся в результате гидроксильный радикал (HO) является одним из самых сильных известных окислителей (EрН=7 2,31 V). Реакции с участием HO имеют очень низкий барьер энергии активации и протекают очень быстро, при скоростях, близких к диффузионной.

Таким образом, активация H202 путем одноэлектронного восстановления играет решающую роль в функционировании этой молекулы в качестве эффективного окислителя (Oszajca et al, 2016). Пероксид водорода является биологически важной активной формой кислорода; он образуется в качестве побочного продукта митохондриального транспорта электронов в ходе аэробного дыхания, или в качестве конечного продукта различных метаболических реакций, и предполагают, что он принимает участие в клеточной сигнализации. Хорошо известно, что перепроизводство H2O2 приводит к окислительному повреждению макромолекул и может быть причиной различных заболеваний и старения.

Несмотря на это, Н2О2 менее реакционноспособен, чем супероксид, О2-, контроль уровня H2O2 имеет большое значение, учитывая, что пероксид может легко диффундировать через клеточные мембраны, а также возможен активный трансмембранный транспорт с помощью аквапоринов (Winterbourn, 2013). Так как одноэлектронное восстановление О2 термодинамически невыгодно в отличие от одноэлектронного восстановления О2-, дисмутация O2-, приводящая к образованию О2 и Н2О2, протекает спонтанно или значительно ускоряется супероксиддисмутазой (СОД).

Генерация АФК у прокариот и их возможная роль в деградации углеводородов.

В клетках прокариот АФК могут генерироваться в процессе биодеградации различных углеводородных субстратов при участии моно-или диоксигеназ, особенно с нестрогой субстратной специфичностью. Так, Prez-Pantoja и соавт (2013) показали генерацию АФК штаммом Burkholderia sp. DNT в ходе деградации 2,4-динитротолуола (ДНТ) и нафталина многокомпонентной диоксигеназой, кодируемой кластером генов dntA.

В процессе приспособления к утилизации нового субстрата, ДНТ, эта диоксигеназа перестала быть оптимальной для своего изначального субстрата - нафталина, и еще не стала таковой для ДНТ. В результате чего деградация обоих соединений сопровождалась значительной генерацией АФК, вызванной, вероятно, «ошибочными» реакциями фермента при деградации неполностью подходящих субстратов.

Кроме того, способностью к генерации АФК известны и ферменты семейства цитохромов Р450. В работе Slessor и соавт. (2011) был исследован цитохром P450cin (CYP176A) Citrobacter braakii, катализирующий гидроксилирование 1,8-цинеола до (1R)-6 гидроксицинеола. Были изучены дикие и мутантные формы этого фермента, а также их взаимодействие с исходным (цинеол) и модифицированными субстратами. Показано, что при окислении ферментом дикого типа модифицированного субстрата камфана менее половины НАДФН используется для производства окисленного субстрата, при этом большинство уходит на непродуктивные пути с образованием пероксида водорода (15%) и воды (41%).

При исследовании цитохрома P450cam из Pseudomonas putida, обычно используемого в качестве модельной системы для поведения всех Р450,а также ряда других бактериальных (P450BM-3) (Truan, 1998) и эукариотических цитохромов Р450 (CYP1A2, 2В4, 2D6, 2Е1) (Vaz, 1998; Keizers, 2005), были получены сходные результаты. Замена консервативного остатка треонина в P450cam на аланин приводит к значительному увеличению производства пероксида водорода, с очень небольшим количеством (около 5%) восстановительных эквивалентов, используемых для получения гидроксилированного продукта.

Каталитический цикл цитохрома Р450 представляет собой сложную последовательность отдельных этапов, включающих использование двух восстанавливающих эквивалентов, наиболее часто в виде NAD(P)H, для восстановления атмосферного молекулярного кислорода с генерацией одной молекулы воды и окисленного продукта (рис. 2). Рисунок 2 - Каталитический цикл цитохрома Р450 (M. Oszajca et al., 2016).

Среди переходных промежуточных продуктов в каталитическом цикле P450 существуют три комплекса, которые рассматриваются предположительно как окисляющие соединения: железо (III) гидропероксо-комплекс (соединение 0); железо (IV) оксо порфирин катион радикал, являющийся продуктом гетеролитического расщепления O-O-связи предыдущего соединения (соединение I), и железо (IV) оксо порфирин, продукт одноэлектронного восстановления соединения I (соединение II) (Oszajca et al., 2016).

Несмотря на то, что большинство цитохромов Р450 используют атмосферный молекулярный кислород, часто вместо O2, 2H + и 2e-используется перекись водорода, и это явление известно как "пероксидный шунт". Здесь Н2О2 или органические пероксиды (алкилгидропероксиды, пероксикислоты) отдают атом кислорода окисляемому субстрату, при этом наличие О2 или NADPH в качестве донора электронов не требуется. В семействе цитохромов Р450 имеется лишь небольшое число изоформ, которые естественным образом используют Н2О2 в качестве источника кислорода для непосредственного получения соединения 0 через пероксидный шунт (путь А на рисунке 2). Соединение 0 далее протонируется и подвергается гетеролитическому расщеплению O-O-связи с образованием соединения I. Пероксидный шунт редко бывает эффективным средством катализа для Р450, так как пероксиды окисляют и гем, и сам белок в том числе. Тем не менее, небольшое количество цитохромов Р450, такие как CYP152A1 (P450BS) Bacillus subtilis и CYP152B1 (P450SP) Sphingomonas paucimobilis, используют пероксидный шунт для гидроксилирования жирных кислот с длинной цепью, выступая, таким образом, в роли пероксигеназ (Fujishiro et al., 2011). В 2014 году Belcher и соавт. (2014) описали цитохром P450 OleTJE (CYP152L1) из Jeotgalicoccus sp. 8456, катализирующий окислительное декарбоксилирование жирных кислот с образованием алкенов и также использующего перекись водорода в качестве донора кислорода.

Определение генотоксичности, прооксидантных и белок-повреждающих свойств экстрактов почв и донных отложений импактной зоны Новочеркасской ГРЭС

Исследование генотоксичности почв окрестностей Новочеркасской ГРЭС c помощью lux-биосенсорных штаммов E. coli MG1655 (pRecA-lux) и E. coli MG1655 (pColD-lux) показало отсутствие прямых мутагенов в большинстве проб.

Однако при изучении генотоксичности почв при помощи штамма E. coli MG1655 (pRecA-lux) с метаболической активацией в половине проб (из точек 1, 2, 3, 5, 7) были обнаружены вещества промутагенной природы (табл.4), которые при попадании в организм и метаболизме ферментами печени приобретают мутагенные свойства. В условно-чистой почве из ООПТ «Персиановская степь» не было обнаружено веществ мутагенной и промутагенной природы (фактор индукции составил 0,96 и 1,00, соответственно).

Изучение прооксидантных свойств почв окрестностей Новочеркасской ГРЭС, обусловленных наличием пероксида водорода и органических пероксидов, с помощью штамма E. coli MG1655 (pKatG-lux), показало низкий процент положительных проб. Они были отобраны в двух точках (8 и 11) в 2015 году. Фактор индукции составил, соответственно, 3,14 и 3,55 (табл. 5). В фоновой почве, отобранной в заповеднике «Персиановская степь», показано отсутствие пероксидов (фактор индукции - 0,95).

Гораздо больше проб проявляли прооксидантную активность, обусловленную наличием веществ, провоцирующих генерацию супероксид-анион радикала (табл. 6). Достоверный ответ биосенсора E. coli MG1655 (pSoxS-lux) был обнаружен в пробах 1-6 в 2013 году, в последующие годы в этих пробах не было детектировано значимого люминесцентного ответа.

В пробах 8, 11 и 12, напротив, присутствие супероксид-анион радикала было выявлено в 2015 году, с фактором индукции, соответственно, 2,56; 1,82 и 1,85. В фоновых пробах почвы показано отсутствие веществ-генераторов супероксид-анион радикала (фактор индукции - 0,99).

Биолюминесцентный анализ проб почв с помощью штамма Е. coli MG1655 (plbpA-lux) показал, что практически все образцы содержат вещества, повреждающие клеточные белки. К ним могут быть отнесены фенол или формальдегид, содержание которых в исследуемом районе превышают средний уровень по России (Экологический вестник, 2015). Наиболее значительный ответ биосенсора был зарегистрирован в 2013 году, с последующим снижением факторов индукции в 2014 и 2015 годах (табл.7). При этом в пробах условно-чистой почвы не было выявлено веществ, повреждающих белки (фактор индукции - 1,32).

Изучение проб донных отложений, отобранных в 2014 году, показало, что в пробах из точек 2, 8 и 8а зарегистрирован слабый генотоксический эффект, обусловленный присутствием непрямых мутагенов (табл. 8). В точках 2, 6 и 8 обнаружено незначительное присутствие веществ, повреждающих клеточные белки. Веществ, вызывающих окислительный стресс (генераторов пероксида водорода и супероксид-анион радикала), выявлено не было.

В 2015 году, напротив, генотоксичность образцов донных отложений снизилась, но значительно возросли их прооксидантные свойства (табл. 9). С помощью биолюминесцентного сенсора E. coli MG1655 (pKatG-lux), реагирующего на присутствие пероксида водорода в среде, показано, что все пробы донных отложений характеризовались средним уровнем прооксидантной активности.

Генерация пероксида водорода штаммами углеводород деградирующих микроорганизмов при инкубации с различными углеводородами в качестве единственного источника углерода и энергии

Также была исследована способность различных штаммов углеводород-деградирующих микроорганизмов продуцировать и накапливать в среде пероксид водорода в ответ на присутствие углеводородов. У всех изученных штаммов генерация пероксида в разной степени усиливалась при инкубации с дизельным топливом в качестве единственного источника углерода и энергии. При этом у штаммов, выделенных их почв и донных отложений НчГРЭС, максимальное накопление пероксида водорода регистрировалось на 26-й день культивирования.

Так, при инкубации штамма Rhodococcus erythropolis, выделенного из почвы в точке 1 НчГРЭС, с дизельным топливом, было показано накопление пероксида водорода, в 46,6 раз превышающее уровень контроля (рис. 19). У штамма Arthrobacter sulfonivorans максимальное превышение уровня генерации пероксида относительно контроля составило 48,4 раза (рис. 20).

У разных видов рода Pseudomonas, выделенных из донных отложений импактной зоны НчГРЭС, индукция образования пероксида водорода составила 34,14 раза у Pseudomonas koreensis (рис. 21), 25,78 раза у Pseudomonas chlororaphis (рис. 22), 37,47 раза у Pseudomonas brassicacearum (рис. 23), 27,9 раза у Pseudomonas stutzeri (рис. 24) и 39,8 раза у Pseudomonas putida (рис. 25).

При изучении музейных штаммов нефтеокисляющих микроорганизмов было показано, что инкубация штамма Exiguobacterium undae № 1 с дизельным топливом приводит к индукции образования пероксида водорода, достигающей 30-кратного увеличения по сравнению с контрольными образцами (рис. 26). Максимум образования пероксида приходился на 22 день культивирования, то есть ближе к концу срока инкубации.

Так же на 22-й день культивирования достигла максимума продукция пероксида и у штамма Achromobacter xylosoxidans № 2. При инкубации с дизельным топливом интенсивность хемилюминесценции достоверно возрастала в 5,8 раз по сравнению с контролем (рис. 27).

Исследование генерации пероксида водорода штаммом Kocuria rosea № 3 показало, что при инкубации с дизельным топливом в качестве единственного источника углерода и энергии продукция пероксида достигала максимальных значений к последнему дню культивирования, при этом интенсивность хемилюминесценции была выше контрольной в 55 раз (рис.28).

Сходным образом реагировал на присутствие дизельного топлива в культуральной среде и штамм Achromobacter xylosoxidans № 4, у которого максимальный уровень хемилюминесценции и, соответственно, накопления пероксида водорода, достигал 10-кратного значения на 29-й день культивирования (рис. 29).

При этом нужно отметить, что для этого же штамма показана генерация супероксид-анион радикала в присутствии дизельного топлива, уровень которой был в 3,5 раза ниже, чем уровень генерации пероксида водорода.

Значительная индукция образования пероксида водорода наблюдалась при культивировании штамма Achromobacter xylosoxidans № 5 с дизельным топливом. К последнему дню культивирования интенсивность хемилюминесценции достигала 178-кратного уровня по сравнению с контролем (рис. 30). При этом в присутствии дизельного топлива не регистрировали генерацию супероксид-анион радикала у этого штамма.

Гораздо более низкий уровень пероксида водорода наблюдали у штамма Acinetobacter calcoaceticus № 6 при инкубации с дизельным топливом в качестве единственного источника углерода и энергии. На 29-й день культивирования накопление пероксида была в 13 раз выше, чем в контрольных образцах (рис. 31).

При культивировании штамма Achromobacter xylosoxidans № 7 в минимальной среде с дизельным топливом было показано, что продукция пероксида водорода этим штаммом наиболее высока в конце срока культивирования и достигает 29-кратного уровня относительно контроля (рис. 32).

В отличие от других штаммов, образование пероксида водорода штаммом Kocuria rosea № 8 индуцировалось не только дизельным топливом, но и деканом (рис. 33). В первой половине срока культивирования, на 10-й день, интенсивность хемилюминесценции образцов культуральной жидкости в присутствии декана была выше контрольной в 12 раз, а затем резко снизилась. При этом хемилюминесценция образцов, содержащих дизельное топливо, на 22 день культивирования значительно возросла по сравнению с контролем, достигая 674-кратного уровня индукции.

На 19-й день культивирования уровень генерации пероксида водорода был выше контрольного в 11 раз.

При изучении генерации пероксида водорода штаммом Shewanella putrefaciens № 10 было показано, что образование этих АФК в данном случае индуцируется при культивировании с циклогексаном и дизельным топливом (рис. 35).

При этом в первой половине срока инкубации, с 1 по 15-й день, уровень хемилюминесценции выше в присутствии циклогексана (максимум - в 2,3 раза), а во второй половине срока - в присутствии дизельного топлива, с максимумом индукции в 12,3 раза на 26-й день культивирования.

Невысокий уровень индукции образования пероксида водорода наблюдался при инкубации штамма Pseudomonas anguilliseptica № 11 с дизельным топливом.

При инкубации штамма Micrococcus luteus № 12 с дизельным топливом в качестве единственного источника углерода и энергии уровень хемилюминесценции контрольных образцов до 15-го дня культивирования был достоверно выше опыта, но во второй половине срока инкубации, после 15-го дня, хемилюминесценция образцов из колб с дизельным топливом достоверно увеличилась, достигнув своего максимума на 23 день культивирования (в 11 раз) (рис. 37).

При изучении продукции пероксида водорода штаммом Acinetobacter calcoaceticus № 13, показавшего в предыдущих опытах значительное образование супероксид-анион радикала в ответ на присутствие дизельного топлива, было обнаружено, что пероксид водорода у этого штамма также накапливается в присутствии дизельного топлива (рис. 38). При этом максимум индукции образования пероксида составляет 5,2 раза.