Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Литературный обзор 14
1.1. Обзор состояния изученности клептопластии у морских заднежаберных моллюсков 14
1.1.1. История открытия явления «клептопластии» у моллюсков .14
1.1.2. Цитологические исследования «клептопластии» у морских
заднежаберных моллюсков 17
1.1.3. Выдвижение гипотезы горизонтального переноса генов (ГПГ) от
водорослей к моллюскам и её опровержение 23
1.1.3.1. Явление горизонтального переноса генов 23
1.1.3.2. Гипотеза горизонтального переноса генов от водорослей к моллюскам 28
1.2. Обзор состояния изученности формирования протопластов у морских ценоцитных зеленых водорослей 32
1.2.1. Особенности цитологической и морфологической организации ценоцитных зеленых водорослей 32
1.2.2. Цитологические и биохимические исследования процесса формирования протопластов in vitro из вытекшей протоплазмы 34
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследований 41
Глава 3. Общая характеристика объектов цитологических и молекулярных исследований – водоросли .62
3.1. Bryopsis plumosa (Hudson) Agardh, 1823 62
3.2. Chaetomorpha Ktzing, 1845 68
ГЛАВА 4. Общая характеристика объектов цитологических и молекулярных исследований – заднежаберные моллюски .77
4.1. Placida babai Markus, 1982 – Плацида Бабы .77
4.2. Elysia nigrocapitata Baba, 1957 – Элизия черноголовая 87
4.3. Elysia atroviridis Baba, 1955 – Элизия атровиридис 96
4.4. Особенности содержания и воспроизводства заднежаберных моллюсков в лабораторных условиях .100
ГЛАВА 5. Преобразование протоплазмы ценоцитных зеленых водорослей в протопласты в морской воде . 108
5.1. Молекулярная характеристика лектинов 109
5.1.1. Лектин бриохилин 109
5.1.2. Лектин BPL-3 115
5.2. Протеомный анализ протопластов и появившихся из них клеток .121
5.3. Гибридизация протоплазмы разных видов сифоновых и сифонокладовых водорослей и внедрение инородного материала в их протопласты 134
ГЛАВА 6. Цитологические исследования строения параподий изученных «фотосинтетических» моллюсков 144
6.1. Elysia nigrocapitata 144
6.2. Elysia atroviridis 157
ГЛАВА 7. Механизмы формирования симбиотических связей между изученными ценоцитными зелеными водорослями и заднежаберными моллюсками .165
7.1. Фотосинтетическая активность клептопластид и флуоресценция хлорофилла a
внутри тела Placida babai 166
7.2. Фотосинтетическая активность клептопластид и флуоресценция хлорофилла a внутри тела Elysia atroviridis .169
7.3. Фотосинтетическая активность клептопластид и флуоресценция хлорофилла a внутри тела Elysia nigrocapitata 171
7.4. Сравнительный транскриптомный анализ изученных видов заднежаберных моллюсков и Bryopsis plumosa 175 7.5. За счет чего выживают «фотосинтетические» моллюски? 178
Заключение .193
Выводы 198
Литература
- Обзор состояния изученности формирования протопластов у морских ценоцитных зеленых водорослей
- Chaetomorpha Ktzing, 1845
- Elysia atroviridis Baba, 1955 – Элизия атровиридис
- Гибридизация протоплазмы разных видов сифоновых и сифонокладовых водорослей и внедрение инородного материала в их протопласты
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Высочайшее видовое разнообразие морской биоты создает высокую конкуренцию видов за пространственно-временные, пищевые и другие ресурсы, способствует формированию сообществ с многообразными, порой самыми неожиданными консортивными связями и формами сожительства видов, обеспечивающими им успех воспроизводства и сохранения. Интересным примером теснейшего взаимовыгодного сожительства являются ценоцитные зеленые водоросли и питающиеся ими заднежаберные моллюски. Первые необычны тем, что образованы крупными многоядерными клетками или одной гигантской многоядерной клеткой-сифоном, вторые - тем, что, питаясь водорослевой протоплазмой, ассимилируют находящиеся в ней хлоропласты в свои пищеварительные клетки и способны сохранять их там в живом, функциональном состоянии.
Необычное строение ценоцитных водорослей, казалось бы, только увеличивает вероятность их травмирования при механическом или биотическом воздействии. Вытекание протоплазмы из крупных клеток и сифонов в окружающую среду должно было бы приводить к массовой гибели растений и вымиранию видов. Однако данная группа водорослей до сих пор процветает, особенно в теплых и теплоумеренных водах Мирового океана. Выяснение способов выживания ее представителей и механизмов их посттравматической регенерации интересно не только для понимания способов сохранения таких уникальных в цитологическом отношении видов, но и для решения практической задачи - выделения из них химических соединений, способствующих «ранозаживлению» плазматических мембран и клеточных стенок ценоцитных водорослей, и их последующего использования в медицине и фармацевтике. Выяснение механизмов «подселения» в клетки животных чужых им по природе органелл растительных клеток и формирование симбиотических взаимоотношений на внутриклеточном уровне не менее значимо для развития биологии, поскольку расширяет представления о сущности жизни, формировании взаимосвязи и взаимозависимости видов как основы единства и целостности живой материи.
Степень разработанности выбранной темы. Способность морских ценоцитных зеленых водорослей формировать протопласты из вытекшей в морскую воду протоплазмы была открыта еще в начале 70-х гг. прошлого века (Tatewaki, Nagata, 1970; La Claire II, 1982a,b; Kobayashi, Kanaizuka, 1985; Pak et al., 1991). Однако все ранние исследователи, не вникая в суть биохимических преобразований первичной оболочки, не дали должной оценки этому уникальному в живой природе явлению - сохранению и продолжению жизни в структурах, не имеющих плазмалеммы, т.е. жизни без клеточной мембраны. Мы впервые определили, что первичная оболочка протопластов состоит из полисахаридов и не является липопротеидной мем-
браной, а также изучили этапы и условия ее формирования (Kim et al., 2001, 2002; Kim, Klotchkova, 2004; Klotchkova et al., 2003). Мы также определили, что агглютинация клеточных компонентов в морской воде (т.е. первый этап формирования протопластов) осуществляется посредством комплементарной лектин-углеводной связи (Kim et al., 2002).
Изучение клептопластии у заднежаберных моллюсков было начато также в прошлом веке. До последних лет считалось, что некоторые их виды, называемые «фотосинтетические» моллюски (Trench, 1975) или «моллюски на солнечных батарейках» (Rumpho et al., 2000; Sea slug forum, 2017), могут длительное время жить за счет продуктов фотосинтеза клептопластид (Mujer et al, 1996; Pierce et al, 1996; Rumpho et al, 2001, 2008, 2011), регуляцию которого на генном уровне осуществляют ядра моллюсков, принявшие в свой геном водорослевые гены, кодирующие процессы фотосинтеза (Rumpho et al, 2000, 2001). Отказ от этой гипотезы (Bhattacharya et al, 2013) оставил открытым вопрос, каким образом на молекулярном уровне регулируется процесс фотосинтеза, происходящий в чужеродных для животных клеток растительных органеллах. Достаточные цитологические и молеку-лярно-генетические данные, подтверждающие или опровергающие эту гипотезу, отсутствовали. Биология развития видов, связанных столь необычными симбиотическими связями, оставалась неизученной.
Цель работы - выявить механизмы формирования симбиотических связей между ценоцитными зелеными водорослями и морскими заднежаберными моллюсками на внутриклеточном уровне при сосуществовании внутри клеток моллюсков органелл животного и растительного происхождения.
Для достижения цели было необходимо решить следующие задачи:
-
Подобрать для исследования виды ценоцитных зеленых водорослей и заднежаберных моллюсков, образующих трофические ассоциации, изучить биологию их развития, разработать методы культивирования и содержания в лабораторных условиях.
-
Охарактеризовать лектины, участвующие в агглютинации протоплазмы у водоросли Bryopsis plumosa в процессе ее преобразования от vitro в новые функциональные клетки; изучить экспрессию генов в протопластах и появившихся из них клетках; изучить способность протоплазмы разных видов ценоцитных зеленых водорослей к спонтанной гибридизации.
-
Определить таксономическое положение изученных видов заднежаберных моллюсков и таксономическую ценность признаков, используемых для их диагностики, и влияние питания на их изменчивость.
-
Изучить строение пищеварительных клеток заднежаберных моллюсков, включающих растительные органеллы, в разные периоды их голодания.
5. Определить функциональную активность клептопластид в разные
периоды голодания изучаемых моллюсков и их роль в их питании; про
вести транскриптомный анализ и поиск у моллюсков генов, кодирующих
фотосинтез.
Научная новизна. Впервые приводится молекулярная характеристика новых лектинов водорослей - бриохилина и BPL-3, участвующих в процессе «сборки» протопластов у Bryopsis plumosa. Их аминокислотный состав и молекулярная структура отличаются от всех известных лектинов наземных растений, животных и водорослей и являются новыми для науки. Это открытие было отмечено журналом «Journal of Phycology» в разделе «Algae - Highlights» (Grossman, 2006). Впервые выполнен протеомный анализ протопластов у В. plumosa и появившихся из них клеток и показано, что на каждом этапе их жизни значительно различается белковый профиль. Впервые изучены механизмы защиты от спонтанной гибридизации протоплазмы растений разных видов ценоцитных зеленых водорослей и разработан метод внедрения в протопласты чужеродных клеток и микрочастиц.
При изучении взаимоотношений ценоцитных зеленых водорослей и заднежаберных моллюсков обнаружено, что пищеварительные клетки моллюсков включают все компоненты водорослевой протоплазмы, в том числе и ядра, т.е. наряду с клептопластией имеет место клептокариоз. Впервые определено, что фотосинтетическая активность клептопластид во многом определяется составом водорослевого корма. Он, в свою очередь, влияет на морфометрические признаки и развитие моллюсков. Впервые установлено, что клептопластиды - это, прежде всего, поддерживаемые в живом состоянии резервные пищевые ресурсы, а не поставщики основного питания, достаточного для выживания голодающих моллюсков. Впервые созданы и проанализированы транскриптомные базы данных для моллюсков Elysia atroviridis, Elysia nigrocapitata и Placida babai и водоросли В. plumosa. В транскриптоме моллюска Е. atroviridis обнаружено несколько потенциальных кандидатов генов, кодируемых геномом хлоро-пластов. Их нахождение не исключает вероятности горизонтального переноса генов (ГПГ) от водорослей к моллюскам.
Теоретическая и практическая значимость работы. Данные изучения молекулярных и клеточных механизмов симбиотических связей ценоцитных зеленых водорослей и заднежаберных моллюсков могут дополнить учебные курсы альгологии и клеточной биологии. Часть из них уже вошла в зарубежные учебники по альгологии (Lee, 2008, раздел «Evolution of the chloroplast»; Hurd et al, 2014) и в справочник по эволюционному мышлению в науках ynthetic biology and Darwinism»). Разработанный автором метод выделения лектинов, участвующих в агглютинации протоплазмы, с незначительными модификациями может быть использован для их выявления у других водорослей. Выделены и охарактеризованы новые водорослевые лектины, принадлежащие к еще не описанному классу. Выделенные фитогемагглютинины бриохи-лин и BPL-3 перспективны для дальнейшего изучения с целью использования в медицине. Данные по морфологии, анатомии, лабораторному
культивированию и систематике заднежаберных моллюсков могут дополнить учебные курсы зоологии, использоваться для культивирования ценных с медицинской точки зрения видов.
Методология и методы диссертационного исследования. В основу методологии проведенных исследований положен системный подход, при котором живая система рассматривается как множество иерархически связанных между собой элементов, составляющих функциональное единство. В ходе исследования были использованы современные методы морфолого-анатомических, экологических, гидробиологических, цитологических, молекулярных и биохимических исследований. Для транскриптомного анализа заднежаберных моллюсков и Bryopsis plumosa использовали метод секвени-рования нового поколения (NGS, 454 pyrosequencmg & Illumma platform); поиск потенциальных генов осуществляли с помощью компьютерной программы GMAS (Genome Mining and Analysis System), имеющей автоматическое подключение к базе данныхNCBI (2017; http.
Положения, выносимые на защиту.
-
В процессе «сборки» протопласта у Bryopsis plumosa участвуют новые гликопротеины, принадлежащие к еще не описанному классу лекти-нов. Безмембранные протопласты осуществляют активный синтез белков.
-
«Фотосинтетические» моллюски захватывают в свои пищеварительные клетки сгустки водорослевой протоплазмы, включая ядра, при этом протоплазма не теряет способности к агглютинации и автономному существованию внутри клетки моллюска.
-
Скорость деградации клептопластид возрастает на свету, а при тусклом свете или в полной темноте они более стабильны.
-
Взаимовыгодное сожительство моллюсков и водорослей позволяет первым эффективно запасать внутри своих клеток живую водорослевую протоплазму и получать в процессе ее длительного «хранения» дополнительные пищевые ресурсы, а вторым - возможность эффективно размножаться путем формирования протопластов in vitro.
Степень достоверности результатов. Достоверность результатов исследования обеспечивает использование современных методов, многократная повторность экспериментов. Нуклеотидная и аминокислотная последовательности лектина бриохилин (Bryohealin) и BPL-3 зарегистрированы в базе данных NCBI с присвоением следующих порядковых номеров: EU769118 (бриохилин), КХ867966 (BPL-3). Созданные с участием автора диссертации транскриптомные базы данных для моллюсков Elysia atroviridis, Elysia nigrocapitata и Placida babai и водоросли Bryopsis plumosa загружены в генбанк «Phycogene» (). Новые сиквенсы для моллюсков были зарегистрированы в базе данных NCBI с присвоением следующих порядковых номеров: Е. atroviridis -KY061146 (16S рРНК), KY061147 (28S рРНК) и KY061148 (Cox1);
E. nigrocapitata - JX524802, KY061149 (16S pPHK), JX524803, KY061150 (28S pPHK) и JX524804, KY061151 (Cox1); P. babai - KY050762 (16S pPHK), KY050761 (28S pPHK), KY050760 (Coxl) и KY050759 (пістон Н3).
Личный вклад автора. Автор собрала основную часть изученных видов водорослей и все изученные виды моллюсков и культивировала их в лабораторных условиях, выполнила все микроскопические исследования и фотографирование объектов; подготовила материалы для ПЭМ, проте-омного анализа протопластов, провела все эксперименты по изучению формирования и гибридизации протопластов и внедрению в них чужеродного материала. Для выделения лектинов бриохилин (Bryohealm) и BPL-3 и создания рекомбинантной ДНК бриохилина автор подготовила материал для исследований, подобрала химические реактивы и буферные растворы, провела эксперименты для выявления гемагглютинативной активности водорослевого экстракта и выделенных лектинов, провела биоинформационный анализ полученных сиквенсов. При изучении систематики заднежаберных моллюсков автор готовила материал для исследования, провела полимеразную цепную реакцию (ТШР) и биоинформационный анализ полученных сиквенсов. В ходе поиска у заднежаберных моллюсков генов, кодирующих фотосинтез, автор подготовила пробы для PAM-флуорометрии и выделения мРНК, проанализировала транскрипты моллюсков и В. plumosa и интерпретировала полученные данные. Автор принимала непосредственное участие в подготовке всех опубликованных по материалам диссертации статей и тезисов докладов. Молекулярные исследования были проведены при финансовой поддержке Национального исследовательского фонда Республики Корея и гранта Др. Г.Х. Кима «Extreme Genomics Program», соисполнителем которого являлась автор диссертации.
Апробация результатов. Результаты, представленные в диссертационной работе, докладывались автором на следующих конференциях: «Морские прибрежные экосистемы. Водоросли, беспозвоночные и продукты их переработки» (Владивосток, 2008); на ежегодных конференциях корейского альгологического общества (Korean Society of Phycology (KSP), Республика Корея, 2005, 2007, 2009); XVIII международном водорослевом симпозиуме (International Seaweed Symposium (ISS), Берген, Норвегия, 2004); международном симпозиуме «Морские водоросли и глобальное потепление» (Сеул, Республика Корея, 2006); IV европейской аль-гологической конференции (European Phycological Conference, Овиедо, Испания, 2007); Тихоокеанско-азиатском альгологическом форуме (Asian Pacific Phycological Forum, Бангкок, Таиланд, 2005; Ёсу, Республика Корея, 2011). Их научная значимость отмечена оргкомитетом ISS (Берген, Норвегия, 2004) присуждением высшей награды (Sunmva and Egil Baardseth’s Legacy Award) и оргкомитетом KSP (Тэджон, Республика
Корея, 2005) присуждением высшей награды. Результаты также докладывались на заседании Камчатского отделения Русского ботанического общества (Петропавловск-Камчатский, 2005).
Публикации. Всего автором опубликовано 53 статьи в рецензируемых научных журналах, 1 коллективная монография, 1 глава в книге и 80 материалов и тезисов докладов научных конференций. По материалам диссертации опубликовано 10 тезисов докладов, представлявшихся автором в России и за рубежом, 1 коллективная монография и 15 статей: 12 - в международных рецензируемых научных журналах, входящих в базы данных Scopus (Elsevier) и Thomson Reuters (идентификационный номер автора в Scopus: 12792241800), 2 - в российском рецензируемом научном журнале из списка ВАК, 1 - в другом издании.
Структура и объем диссертационной работы. Диссертация изложена на 224 страницах, состоит из введения, 7 глав, заключения, выводов и списка литературы, включает 56 рисунков и 9 таблиц. Список литературы включает 245 публикаций, из них 209 иностранных и 15 ссылок на интернет-источники.
Благодарности. Выражаю глубокую благодарность идеологам моей работы: профессору Национального университета Конджу (Республика Корея), Др. Г.Х. Киму (Prof., Dr. Kim Gwang Hoon, Kongju National University), в лаборатории которого мне посчастливилось работать, и д.б.н. Н.Г. Клоч-ковой (ФГБОУ ВО «КамчатГТУ») за постоянную и неоценимую поддержку на всех этапах становления моего научного мировоззрения. Я также признательна профессору университета Хоккайдо (Саппоро, Япония), Др. Т. Мотомуре (Prof., Dr. Taizo Motomura) за возможность использовать научное оборудование его лаборатории, предоставление необходимых для трансмиссионной микроскопии реактивов и за ценные консультации в области ультраструктуры клеток изучаемых мною организмов. Благодарю также профессора Национального университета Чоннам (Республика Корея) Др. К.Е. Кима (Prof, Dr. Kim Kwang Young) за обеспечение оборудованием, необходимым для РАМ флуорометрии. Богатым опытом в области молекулярной систематики со мной делился профессор университета Веллингтона Др. Д.К.Г. Цуккарелло (Prof, Dr. Joe Zuccarello). Я искренне благодарю за многолетнее сотрудничество коллег-альгологов и сотрудников кафедры экологии и природопользования ФГБОУ ВО «КамчатГТУ».
Обзор состояния изученности формирования протопластов у морских ценоцитных зеленых водорослей
Открытие рассмотренного выше столь необычного цитологического явления породило новое научное направление, в рамках которого решался вопрос о том, как на молекулярном уровне регулируется процесс фотосинтеза в хлоропластах, находящихся в чужеродных животных клетках. В ходе его решения появлялось множество новых вопросов: 1) Попадают ли путем фагоцитоза ядра водорослевых клеток в клетки животных, или существует некий селективный механизм, отделяющий их от хлоропластов? 2) Остаются ли в клетках животных клеточные ядра растений функционирующими? 3) Включает ли наследственная информация ДНК моллюсков гены, способные регулировать фотосинтез? Последняя идея многим ученым казалась не безосновательной. Лабораторные эксперименты свидетельствовали об очень жесткой пищевой привязанности моллюсков к определенным видам водорослей (Floyd, O Kelly, 1990; Jensen, 1993). Аналогичные данные были получены и нами (Klochkova et al., 2010, 2013) после изучения пищевых привязанностей 7-и видов морских заднежаберных моллюсков, собранных на побережье Корейского полуострова. Наши исследования показали, что многие животные погибают от голода, когда их лишают свойственной им пищи, но не переходят на другой водорослевый корм. В случае перехода на другой корм они меняют свой габитус. Такая тесная связь между определенными видами водорослей и заднежаберными моллюсками естественным образом наводила на мысль о специфическом, генетически запрограммированном, биохимическом процессе переваривания последними растительной пищи.
Утверждение, что все поступившие в клетки моллюсков водорослевые ядра погибают и живыми в них остаются только хлоропласты, было принято de facto. Об этом свидетельствуют работы исследователей, изучавших явление клептопластии у E. chlorotica (Mujer et al., 1996; Pierce et al., 1996; Rumpho et al., 2000, 2001; Schwartz et al., 2010). Они писали о том, что из высосанной водорослевой цитоплазмы в клетку животного встраиваются только хлоропласты, а ядра и другие клеточные органеллы используются как питательный материал и погибают. Так, в обзорной статье М.Е. Рамфо (Rumpho et al., 2001, с. 309) дается следующее категорическое высказывание: «Мы опровергли нахождение водорослевых ядер/ядерных геномов в слизнях, основываясь на данных электронной и флуоресцентной микроскопии и по отрицательным результатам пробирования ITS (intertranscribed spacer) (Mujer et al., 1996; Rumpho et al., 2000; Green et al., 2000)». Однако, стоит отметить, что в указанных статьях (Mujer et al., 1996; Rumpho et al., 2000) флуоресцентные микрофотографии не даны, а приведенные в этих работах трансмиссионные микрофотографии очень мало информативные и не подтверждают приведенное выше утверждение.
В статье Дж. Шварц с соавторами по E. chlorotica (Schwartz et al., 2010) имеется не менее категорическое высказывание о том, что многочисленные трансмиссионные электронные исследования, проведенные в течение многих лет, показывают, что водорослевых ядер в клетках моллюсков нет (с. 32–33). Однако в этой работе нет ни ПЭ микрофотографий, ни указания литературных источников, содержащих информацию об их публикации.
Трансмиссионные микрофотографии, опубликованные в ранних работах (Trench, 1969; Mujer et al., 1996; Rumpho et al., 2000; Mondy, Pierce, 2002), были достаточно низкого качества. При этом на них часто была показана не целая клетка, а только её увеличенный фрагмент, иллюстрирующий отдельные клептопластиды и их окружение. Судить по этим немногочисленным микрофотографиям и одиночным срезам клеток о наличии ядер, их морфологии и количестве невозможно. Отметим, что, судя по анализу публикаций, касающихся изучения клептопластии, ни одним исследователем никогда не были сделаны серийные срезы клеток, содержащих клептопластиды, от одного полюса к другому. Поэтому ни у одного из них не было основания утверждать, что водорослевые ядра в них отсутствуют. Из собственного опыта работы на трансмиссионном электронном микроскопе нам хорошо известно, что на ультратонких срезах различить между собой только на основе морфологических различий ядра элизий и зеленых водорослей невозможно из-за их сходства.
В статье Н. Кертиса с соавторами (Curtis et al., 2007) показан срез клетки пищеварительной трубки (digestive tubule) моллюска Elysia clarki. На нем отчетливо видны многочисленные хлоропласты и, по меньшей мере, 5 ядер, природа которых неизвестна. Однако авторы, придерживаясь гипотезы ГПГ от водорослей к моллюскам, никак не комментируют это. На упомянутой микрофотографии показан только один ультратонкий срез. Понятно, что во всем объеме клетки ядер должно быть намного больше. Аналогичные результаты нахождения многочисленных ядер в клетках, содержащих клептопластиды, были представлены и в нашей недавно опубликованной статье по Elysia nigrocapitata (Klochkova et al., 2013). Такие находки закономерно порождают вопросы: почему в клетке животного находится так много ядер и все ли они животного происхождения?
Существующие в настоящее время молекулярные, цитохимические и биохимические методы пока не позволяют абсолютно точно дифференцировать ядра морских слизней и водорослей. В конце 1990-х гг., когда началось активное изучение клептопластии у E. сhlorotica, они были еще менее совершенными.
В статье Дж. Шварц с соавторами по E. chlorotica (Schwartz et al., 2010) приводится описание эксперимента с использованием ПЦР-анализа, направленного на проверку присутствия в клетках моллюсков водорослевых ядер. В ней, на странице 31, сказано «… были протестированы праймеры для ITS V. litorea, для чего были использованы многочисленные пробы ДНК моллюсков, приготовленные в течение нескольких лет несколькими исследователями в двух разных зданиях, и все они дали отрицательный результат (Pierce et al., 2007, this study), как и результаты метода Southern blots (Green et al., 2000)».
Целью авторов было убедительно доказать, что если бы в исследуемом ДНК был фрагмент ITS V. litorea, то он бы копировался в ходе ПЦР-анализа, однако этого не происходило. Мы полагаем, что описанная ими тщательность выполнения эксперимента все же не обеспечивает его достоверность. Специалистам в области молекулярной биологии хорошо известно, что любая мельчайшая погрешность в ходе проведения молекулярных работ может привести к отрицательному результату
Chaetomorpha Ktzing, 1845
Анализ аминокислотного состава N-терминального конца. Очищенный белок подвергали электрофорезу в 12% SDS-полиакриламидном геле и электроблоттингу на мембраны из поливинилиденфторида (ПВДФ/PVDF) в течение 12 ч. Для определения первых пятнадцати аминокислот N-терминального конца использовали автоматический секвенатор (Applied Biosystems Precise Sequencer, Applied Biosystems, USA).
Поиск в базе данных NCBI осуществляли с помощью программ из пакета BLASTp (protein-protein BLAST, NCBI, 2017). Функциональный анализ лектинов осуществляли с помощью следующих баз данных лектинов и белков, находящихся в открытом доступе в интернете [Centre de Recherches sur les Macromolcules Vgtales, http://www.cermav.cnrs.fr/lectines и Protein Data Bank, http://www.rcsb.org].
Гибридизация протоплазмы разных видов водорослей и внедрение инородного материала в их протопласты. Для того, чтобы определить естественную способность протопластов включать в себя инертные частицы, протоплазма выдавливалась в морскую среду (IMR medium), содержащую суспензию частиц нетоксичного флуоресцентного пластика размером 0,02–2 мкм (желто-зеленые флуоресцентные карбоксилированные микросферы; Molecular Probes). Эти инертные флуосферы используются для наблюдений за внутриклеточным перемещением веществ (http://www.probes.com).
Во втором случае протоплазма выдавливалась в искусственную морскую воду с рН 6 для того, чтобы ослабить её спонтанную агглютинацию (Kim et al., 2002). Подготовленную таким образом протоплазму центрифугировали на скорости 2,000g в течение 2 мин, с последующим удалением её жидкой фракции. Осевшие на дно пробирки клеточные органеллы перемешивали с искусственной морской водой с рН 6, содержащей микросферы. Затем пробирку на несколько минут помещали в автоматический шейкер для того, чтобы внедрить микросферы в протоплазматические сгустки. После этого содержимое пробирки снова центрифугировали на скорости 2,000g в течение 2 мин, искусственную морскую воду удаляли, а осевшие на дно пробирки протоплазматические сгустки помещали в морскую среду (IMR medium). Сформировавшиеся протопласты исследовали под лазерным сканирующим микроскопом.
Для определения способности протопластов включать в себя одноклеточные микроводоросли использовали следующие виды: Chlamydomonas sp., Chlorococcum sp. и Porphyridium purpureum. Вид Chlorococcum sp. является пресноводным, однако мы использовали его в наших экспериментах, поскольку ранее нами была определена способность этого вида жить и размножаться в условиях высокой солености (Klochkova et al., 2006). Поскольку клетки P. purpureum покрыты слизистым чехлом, в начале эксперимента в течение 3–5 мин они были обработаны раствором детергента Triton X-100 (0,5%), растворенным в морской воде. Затем их центрифугировали на скорости 1,200g в течение 1 мин, после чего детергент из пробирки удаляли, а клетки перемешивали с морской средой (IMR medium). Внедрение живых клеток в протопласты проводили тем же способом, что и микросфер, и использовали при этом IMR medium или искусственную морскую воду с рН 6.
Для изучения спонтанной гибридизации протоплазмы растения разных видов ценоцитных зеленых водорослей помещали вместе на предметное стекло и разрушали в малом количестве морской воды. Выдавленную таким образом протоплазму переносили в чашку Петри 10 2 см с IMR medium, которую помещалась в инкубационный шкаф для культивирования образующихся в ней протопластов. Чашки Петри просматривали под инверсионным микроскопом через 5, 10, 20, 30, 40, 50 и 60 мин после выдавливания протоплазмы.
Для того, чтобы определить как взаимодействуют между собой отмытые от жидкого вещества протоплазмы органеллы разных видов водорослей, протоплазма каждого вида выдавливалась из сифона отдельно в искусственную морскую воду с рН 6 и центрифугировалась на скорости 2,000g в течение 2 мин. Процедуру центрифугирования проводили дважды, затем искусственную морскую воду удаляли, а органеллы разных видов соединяли в одной пробирке и помещали в морскую среду (IMR medium).
Для того, чтобы гибридизировать клеточные органеллы одного вида с жидким веществом протоплазмы другого вида проводили следующие эксперименты. Вначале получали жидкую фракцию протоплазмы Microdictyon umbilicatum без органелл, а затем её соединяли с отмытыми от жидкого вещества протоплазмы органеллами разных видов Bryopsis и Chaetomorpha moniligera. Соединенная таким образом протоплазма помещалась в чашки Петри, которые затем просматривали под инверсионным микроскопом через 5, 10, 20, 30, 40, 50 и 60 мин. Все опыты ставили в 10-20 кратной повторности для каждого описанного в работе случая.
Сбор моллюсков и их культивирование в лабораторных условиях. В ходе данного исследования был проведен подсчет особей исследуемых моллюсков в природе (о. Вандо, Южное море, Республика Корея) в разные месяцы 2009-2010 гг. Для проведения лабораторных исследований животных отбирали в периоды максимального пика численности генераций (с 10 по 30 октября для Elysia nigrocapitata; с 1 декабря по 10 марта Elysia atroviridis; круглогодично для Placida babai). Было исследовано 2 генерации Е. nigrocapitata и Е. atroviridis из одного местообитания. Для подсчета особей в поле была установлена рамка размером 10 10 м; количество особей определяли каждые 2 недели с июля 2009 г. по август 2011 г. В период с июля 2009 г. по август 2011 г. в изученном месте обитания моллюсков грунт состоял из мелких камней, мелкозернистого песка и толстого слоя ила, а доминантными видами водорослей во все сезоны года были В. plumosa, Codium fragile и Cladophora spp.
Elysia atroviridis Baba, 1955 – Элизия атровиридис
Внешне виды Chaetomorpha представляют собой неразветвленные прямостоячие, поникающие, скрученные или распадающиеся на пряди нити, прикрепленные базальной клеткой, лишенной ризоидальных выростов. Некоторые виды способны отрываться от субстрата, продолжать свой рост и формировать спутанные свободно плавающие массы. Клетки у большинства видов крупные, реже менее 100 мкм в поперечнике (но не менее 40 мкм). Ширина и форма клеток, расположенных вдоль нити, подвержены изменениям. К вершине они раздуваются, приобретают округлую или боченкообразную форму и становятся в 2–3 раза крупнее, чем в нижней части нити. Терминальные клетки некоторых видов, например C. moniligera, могут достигать 1,5–2-х мм в поперечнике. У вида C. aerea они меньше, до 600 мкм в поперечнике. Ядра в клетках многочисленные, хлоропласты округлой или слегка овальной формы, около 5 мкм в поперечнике, пиреноид окружен крупными крахмальными зернами, с пронизанным ламеллами матриксом. Цитоплазма в клетках постоянных круговых движений не совершает и органеллы и ядра занимают относительно фиксированное положение.
Видам Chaetomorpha свойственны все виды размножения: вегетативное, происходящее путем фрагментации нитей, бесполое, осуществляемое зооспорами, и половое – гаметами. В жизненном цикле многих видов имеет место изоморфная смена поколений. Продукты полового и бесполого размножения выходят из материнской клетки через многочисленные поры в клеточной стенке. Установить, что представляют собой собранные в природе растения C. aerea и C. moniligera – спорофиты или гаметофиты, – удается не всегда, поскольку их гаметы и зооспоры практически не различаются размерами, имеют по одному ядру, по два жгутика и по одному крупному зеленому хлоропласту. Гаметофиты многих видов Chaetomorpha двудомные, гаметы способны развиваться партеногенетически и образовывать гаплоидные растения.
Chaetomorpha достаточно плохо переносит механическое повреждение талломов. Несмотря на простое морфологическое строение растений, культивировать представителей этого рода непросто, прежде всего, из-за крайней хрупкости клеток в нитях. При малейшем их сдавливании происходит разрушение большой центральной вакуоли и клетки деформируются или лопаются. После этого запускается некий «сигнал», и в течение нескольких дней практически все клетки в оставшейся неповрежденной части нити становятся репродуктивными и выпускают подвижные зооспоры или гаметы.
Одиночные клетки и фрагменты нитей менее 1 см в длину, отрезанные от талломов Chaetomorpha, в лабораторных условиях не способны вырасти во взрослые растения (рисунок 6.1). Выживаемость одиночных клеток составляет примерно 50% в течение первых 1–2-х дней после травмы. Затем они увеличиваются в размерах в 1,5–2 раза за счет увеличения центральной вакуоли (рисунок 6.2), и через несколько дней все их цитоплазматическое содержимое превращается в подвижные зооспоры или гаметы, покидающие материнскую клетку, оседающие на субстрат и прорастающие в новые растения.
Размножение посредством формирования протопластов in vitro Некоторым представителям рода Chaetomorpha свойственно уникальное размножение путем трехступенчатого процесса преобразования клеток, появившихся из выдавленной в морскую воду протоплазмы. При обширном повреждении клеточных стенок их гигантских клеток-сифонов в морской воде происходит почти мгновенная фрагментация их протоплазматического содержимого. Попадая в морскую воду, протоплазматические сгустки у видов Chaetomorpha остаются практически неподвижными, но затем они начинают медленно стягиваться, уплотняться и, в конце концов, формирует компактный сгусток округлой формы (рисунок 7).
Через несколько минут на его поверхности формируется первичная оболочка и формируется протопласт. Сразу после формирования протопласты не имеют плазматической мембраны, однако через 6 ч она полностью формируется. Через 24 ч после начала формирования протопластов у них формируется многослойная клеточная стенка (рисунок 8), т.е. они становятся клетками. Однако эти клетки полностью утрачивали способность развиться в нормальные растения. Образование множественных растений обычной морфологии происходило с помощью развития внутри них апланоспор или подвижных свормеров со жгутиками. Формирование апланоспор мы наблюдали у C. aerea, а подвижных свормеров – у C. moniligera.
Гибридизация протоплазмы разных видов сифоновых и сифонокладовых водорослей и внедрение инородного материала в их протопласты
Повышенный интерес к изучению жизненного цикла заднежаберных моллюсков, в частности Elysia rufescens и разработке биотехники её культивирования обусловлен еще и тем, что в её тканях содержится вещество, получившее название кахалалид F (kahalalide F). Стоит особо отметить, что кахалалид F моллюск получает из водорослевой пищи из Bryopsis spp. Содержание этого вещества в тканях моллюска составляет 0,4–1% от массы его тела, в то время как у Bryopsis его не более 0,0005%, т.е. в 800–2000 раз меньше. Источником его получения могут быть и другие виды элизий и плацид, питающиеся Bryopsis. Кахалалид F представляет собой лизосомный яд, обладающий избирательностью in vitro в отношении гормононезависимых опухолей простаты, опухолевых клеток молочной железы neu+ и нейробластом (Faircloth et al., 2001; Hussain et al., 2012; Патентный поиск, 2012–2016), и его также предлагают использовать для лечения лейшманиоза (Cruz et al., 2009). Для массового производства высокоэффективных препаратов необходимо постоянное культивирование заднежаберных моллюсков и их пищи, водорослей Bryopsis spp., в промышленных масштабах, однако в настоящее время эта задача остается пока нерешенной.
Кроме того, некоторые виды моллюсков, в частности голожаберный Hermissenda crassicornis, заднежаберный Aplysia californica и брюхоногий Clione limacina (морской ангел), являются модельными организмами в нейробиологии и используются для изучения молекулярных механизмов памяти и обучения, перестройки цитоскелета и образования связей между нейронами (Gerdes, Fieber, 2006; Cullins, Chiel, 2010). Вид A. californica успешно разводят в лаборатории (Kriegstein et al., 1974; Kriegstein, 1977a,b; Switzer-Dunlap, Hadfield, 1977).
Из собственного опыта полевых исследований нам известно, что найти cаккоглос в природе трудно, поскольку многие из них являются редкими видами и, кроме того, предпочитают селиться поодиночке и на больших расстояниях друг от друга, за исключением видов Placida babai и Ercolania boodleae. В последние десятилетия происходит стремительное сокращение видового разнообразия морских водорослей-макрофитов, а вместе с определенными видами водорослей исчезают и питающиеся ими моллюски. Тот факт, что в течение нескольких лет нам удавалось собирать большое количество особей разных видов саккоглос в одном месте имеет свое объяснение. Местом регулярных сборов водорослей и животных был район сброса сточных вод фермы по разведению рыбы и галиотиса. Ежедневный спуск отработанной морской воды из бассейнов фермы в море обеспечивал там повышенный уровень мочевины и фосфора, а также повышенную турбулентность воды. Именно поэтому данный участок побережья изобиловал зелеными водорослями Bryopsis plumosa и Cladophora sakaii. Когда в 2011 г. после закрытия фермы сюда перестали поступать сточные воды, прослойка ила полностью смылась, грунт стал жестким и неприспособленным для жизни заднежаберных моллюсков. Менее чем за год из этого местообитания исчезли несколько видов красных, бурых и зеленых водорослей, включая B. plumosa и Cladophora spp., а вслед за ними исчезли все виды саккоглос, кормившиеся этими водорослями. Следом исчезли обитавшие здесь рапаны, устрицы, и другие раковинные моллюски. Еще через 1 год все побережье покрылось плотным ковром эфемерных ульвовых водорослей. Деструкция исходного альгоценоза, таким образом, привела к появлению так называемого «зеленого прилива» (Очеретяна и др., 2015). В настоящее время «зеленые приливы» вытеснили практически все виды водорослей и, скорее всего, былое биоразнообразие в этом районе побережья уже не восстановится.
Сведения о развитии заднежаберных моллюсков в искусственных условиях приводятся в немногих публикациях (West, 1979; West et al., 1984; Trowbridge, 1989, 2000; Curtis et al., 2007; Pelletreau et al., 2011, 2012; Rumpho et al., 2011; Dionsio et al., 2013; Fan et al., 2014), при этом стоит отметить, что условия их культивирования описаны недостаточно полно для воспроизведения полученных результатов другими авторами. Их анализ показывает, что никому из указанных выше авторов не удалось непрерывное культивирование особей от яйца до яйца, хотя, несомненно, они проследили развитие определенных стадий развития. Стоит отметить, что в указанных выше статьях микрофотографии личинок на разных стадиях развития не даны, и в большинстве случаев не описаны условия культивирования моллюсков, такие как температура, интенсивность освещения, фотопериод, рН и соленость морской среды/воды, использованной для культивирования, хотя эта информация необходима для воспроизведения полученных ими результатов другими исследователями. Вероятнее всего, из-за различий условий содержания моллюсков описания онтогенеза у представителей рода Elysia различны в работах разных авторов, а в ряде статей по-разному описан онтогенез одного и того же вида, E. chlorotica. Наиболее полное описание условий культивирования приведено в работе американского малаколога С. Троубридж (Trowbridge, 2000).
С. Троубридж (Trowbridge, 2000) смогла культивировать планктотрофных велигеров Elysia viridis в течение 30 дней, используя в качестве корма микроводоросль Rhodomonas baltica. Дальнейший метаморфоз личинок в юных слизней происходил только в присутствии ценоцитной зеленой водоросли Codium fragile, а первые хлоропласты ассимилировались в теле слизней на 2–3 день после их прикрепления к талломам макроводорослей (Trowbridge, 2000).