Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 8
1.0. Микроэкология кишечника человека в норме и патологии 8
1.1. Микроэкология кишечника при лямблиозе 14
1.2. Влияние климатогеографических факторов на микроэкологию человека 23
Результаты собственных исследований 27
1.0. Методы клинических и лабораторных исследований
1.1. Методы оценки микроэкологии кишечника 3 8
1.2. Методы оценки факторов, способствующих персистенции бактерий 39
1.3. Методика изучения направленности химических процессов испражнений 41
1.4. Статистические исследования 44
2.0. Распространенность лямблиоза среди различных групп населения г. Волгограда 45
3.0. Клинико-статистическая характеристика больных лямблиозом 50
4.0. Оценка функционального состояния толстой кишки обследуемых групп по данным копрологических исследований 54
4.1. Результаты исследования муцина и белков испражнений 54
4.2. Направленность химических процессов в кишечнике у лиц обследуемых групп 58
4.3. Органические кислоты испражнений у лиц обследуемых групп 59
4.4. Аммиак испражнений у лиц обследуемых групп 64
4.5. Направленность химических процессов в толстой кишке при лямблиозе 69
5.0. Микробиоценоз кишечника лиц обследуемых групп
5.1. Микроэкология кишечника практически здоровых людей 73
5.2. Микрофлора кишечника лямблионосителей 79
5.3. Микрофлора больных лямблиозом 82
6.0. Факторы, способствующие персистенции микроорганизмов в биоценозе кишечника лиц обследуемых групп 95
7.0. Экспериментальное изучение взаимосвязи антилизоцимной активности и репродуктивной функции эшерихий при сокультивировании с лямблиями 104
8.0. Влияние лямблий на некоторые биологические свойства микроорганизмов в эксперименте in vitro 112
9.0. Диагностическая модель дифференциации степени тяжести дисбактериоза . кишечника 120
Обсуждение полученных результатов 124
Выводы 137
Указатель литературы
- Влияние климатогеографических факторов на микроэкологию человека
- Методы оценки факторов, способствующих персистенции бактерий
- Органические кислоты испражнений у лиц обследуемых групп
- Экспериментальное изучение взаимосвязи антилизоцимной активности и репродуктивной функции эшерихий при сокультивировании с лямблиями
Влияние климатогеографических факторов на микроэкологию человека
Практически все живущие на планете организмы существуют в тесной связи друг с другом, находясь в симбиотических отношениях. Заселение той или иной экологической ниши другим биообъектом, совместное освоение разными организмами территориального пространства для жизни или просто соседское сосуществование - все это разновидности ассоциаций, которые приобретают разный смысл в зависимости от позиций симбионта. Установлено, что выгодно одному партнеру в биоценозе, то совсем может не использовано другим, и наоборот (О. В. Бухарин, 1999).
Оценивая взаимосвязь микрофлоры с хозяином, В. Ю. Соколов, О.В.Бухарин, 1994, обращают внимание на отсутствие четкой грани в симбиотических отношениях организмов. Выявлено, что одна и та же экологическая ниша хозяина может быть предоставлена для паразита, мутуа-листа и комменсала, однако, один и тот же микроб может из комменсала или мутуалиста превратиться в паразита при соответствующем изменении условий существования. Смена таких взаимоотношений, вероятно, заложена в высоком адаптационном потенциале как хозяина, так и микроба и обусловлена длительной эволюцией жизни в организме, где диапазон взаимодействия постоянно совершенствуется. Вот почему все три категории симбиотических отношений тесно связаны между собой и разделяются лишь с известной долей условности (В. Г. Петровская, 1982).
Эволюция, не давая существенных селективных преимуществ взаимодействующим видам, направлена на достижение динамического противоречивого равновесия (А. А. Обгольц, 1992). Принцип саморегуляции с использованием обратных связей универсален для всех биологических систем (В. Д. Беляков, Д. Б. Голубев, Г.Д.Каминский и др., 1987). В естественных условиях микроорганизмы живут в экосистемах, состоящих из множества микробиоценозов, присущих конкретному биотопу. Относительное равнодействие противоположностей обусловливает существование систем. Микроэкология рассматривает кишечник как среду обитания, а ее микроорганизмы как открытую саморегулирующуюся систему с многообразием взаимодействий между особями и популяциями, входящими в ее состав (А. А. Ленцнер и др., 1987; Б. А. Шендеров, 1987, 1988, 1994).
Пищеварительный тракт является открытой микроэкологической системой так как в нем происходит постоянная циркуляция микроорганизмов за счет поступления их из окружающей среды (В. С. Крамарь с со-авт., 1994; Л. В. Крамарь, 1993, 2002).
С современных позиций нормальная микрофлора рассматривается как совокупность множества микробиоценозов, характеризующихся определенным составом и занимающих тот или иной биотоп в организме человека.
Микросимбиоценоз человека состоит примерно из 10й микробных клеток, что на порядок выше числа клеток организма человека (О.В.Чахава, 1987).
Микрофлора тонкой кишки на всем протяжении различна. В верхних отделах, двенадцатиперстной кишке обнаруживаются лактобактерии, отличающиеся по адгезивным свойствам от тех, что находятся в других отделах желудочно-кишечного тракта, бифидумбактерии, фекальные стрептококки. Количество их 104-105 на 1 г содержимого. По ходу кишки количество перечисленных видов нарастает и появляются представители, характерные для толстой кишки. Известно, что толстая кишка человека в большей степени, чем любой другой биотоп, колонизирована микроорганизмами: здесь обнаруживают более 400 видов бактерий, составляющих просветную и мукозную микрофлору. Просветная - микрофлора химуса и слизи, находящихся свободно в просвете кишечника, в норме представляет собой единую хорошо сбалансированную систему, включающую в себя анаэробные и аэробные микроорганизмы: бифидобактерии, бактероиды, лактобациллы, эшерихии, энтерококки и т.д. Среди них преобладают облигатные анаэробы, количество которых достигает 5х1010—101 клеток в 1 г фекалий, при этом число анаэробных микроорганизмов более чем в 100 раз превышает таковое аэробов (А. А. Ленцнер с соавт., 1988; В. М. Бондаренко, 1997, 2000; С. Е. Nord et al., 1998; D. E. Katz et al., 2001). Среди облигатных анаэробов выделяют бифидобактерии, бактероиды, фузобактерии, пептострептококки (С. L. Wells et al., 1988; К. Orrhage et al., 1994). Среди аэробных представителей микрофлоры типичными являются энтеробактерии, энтерококки (В. М. Коршунов с соавт., 2001; Л. А. Леванова с соавт., 2001).
Исходя из количественной представленности микрофлора кишечника делится на главную (облигатно-анаэробные микроорганизмы - бифидобактерии, лактобактерии и бактероиды) и сопутствующую (факультативные анаэробы - эшерихии, энтерококки), составляющие соответственно 96-99 и 1-4 % кишечной флоры. Кроме того, обнаруживается остаточная микрофлора, которая представлена клебсиеллами, цитробактерами, энтеро-бактерами, протеем, дрожжевыми грибами, клостридиями и др., обнаруживающимися в 0,010-0,001 % (Н. Haenel et al., 1975; S. L. Gorbach et al., 1984; Y. H. Samaranayake et al., 1993).
Микроорганизмы, тесно ассоциированные со слизистой оболочкой кишечника, относятся к мукозной микрофлоре (М-микрофлора) (Д. Ван-дер-Ваай, 1992; А.А.Воробьев с соавт., 1997, 2001; S. L. Gorbach, 1988; M. Hill et al., 1988; P. Fredericq, M. Levine, 1994; A. R. Bird, Brown I. L. et al., 2000; L. Eckmann et al., 2001).
В составе мукозной микрофлоры выделяют три группы: первую составляют так называемые спиралевидные бактерии, обнаруживаемые в глубоких слоях слизистой оболочки. Вторая группа - бактерии, колонизирующие поверхность клеток эпителия. Третья, более многочисленная и разнообразная группа, присутствует в толще слоя муцина, покрывающего эпителий, и образует своеобразную биопленку (В. К. Ковальчук, 1982; D. Henteges, 1996). Микроорганизмы муцинового слоя находятся в тесном взаимодействии с поверхностью эпителиоцитов, компонентами муцина и друг с другом за счет адгезинов. Микрофлора пристеночного муцина участвует в поддержании колонизационной резистентности слизистых оболочек макроорганизма. Кроме того, способность к адгезии на определенных биологических субстратах является селективным фактором индигенной микрофлоры кишечника. Возможно, что микрофлора пристеночного муцина занимает главенствующее положение в микробиоценозе толстой кишки (И. М. Байбеков с соавт., 1992; R. Freter, 1989; Н. Kaur et al., 2001; D.J. O Sullivan, 2001).
Методы оценки факторов, способствующих персистенции бактерий
Культуры, выросшие на питательных средах при высеве из наибольших разведений, подвергали групповой, родовой (фекальные стрептококки, стафилококки, неферментирующие грамотрицательные энтеробак-терии) и видовой (стафилококки, энтеробактерии, лактобактерии, бифидо-бактерии) идентификации. Таксономическую принадлежность изолированных бактерий к вышеуказанным группам оценивали на основании изучения роста бактерий в аэробных и анаэробных условиях, отношения к окраске по Граму, характера роста на селективных и дифференциально-диагностических средах, биохимической и серологической идентификаций.
Количественное содержание микроорганизмов определяли в пересчете на 1 г фекалий по числу выросших колоний на соответствующей среде с учетом объема посевного материала и степени его разведения.
Выделение энтеробактерии проводили согласно общепринятым методам с последующим изучением культуральных, морфологических, биохимических и антигенных свойств. В основе их дифференциации положен детерминируемый хромосомными генами ферментативный профиль. Для идентификации энтеробактерии у микробных культур определяли такие свойства, как способность утилизировать углеводы, цитрат, образовывать ацетоин, каталазную активность, индол, сероводород, декарбоксилировать аминокислоты, подвижность.
Декарбоксилазная активность изучалась по методике Ю. В. Галаева (1983). Культуры микроорганизмов для определения декарбоксилазной активности выращивали на мясо-пептонном агаре с добавлением 2 %-ной глюкозы и 0,0005 %-ного витамина В6. Через 18-20 часов инкубации при оптимальной для данного вида температуре культуры микроорганизмов смывали стерильным физиологическим раствором, по стандарту мутности доводя до 2 млрд тел в 1 мл. Полученную микробную взвесь по 2 капли добавляли в каждую пробирку с испытуемыми аминокислотами и средой без аминокислот. Для приготовления жидкой питательной среды использовали физиологический раствор и мясо-пептонный бульон в соотношении 1:1. К 1л этой среды добавляли 2,0 мл смеси (1 мл 5 %-ного раствора витамина Вб + 20,0 мл 40 %-ного раствора глюкозы) и 1,0 мл 1,6 %-ного спиртового раствора бромкрезолпурпурного. Все пробирки, в том числе и контрольные, заливали стерильным вазелиновым маслом и инкубировали в термостате при оптимальной для данных микроорганизмов температуре в течение 2-4 суток. Учет результатов проводится на 1-2 сутки, а при отрицательной реакции в контрольных пробирках наблюдение продолжают до 4 суток. За счет ферментации глюкозы происходит снижение рН ниже 6,0, и среда принимает желтую окраску, особенно в контрольных пробирках. В пробирках, где происходит декарбоксилирование аминокислоты с образованием амина, наблюдается фиолетовая окраска среды. Наличие де-карбоксилазной активности было изучено по отношению к 6 аминокислотам: фенилаланину, аргинину, тиразину, гистидину, орнитину, глутамину.
Учитывая многочисленность видового состава сем. Enterobacteriaceae, "пестроту" и непостоянство их биохимических характеристик, точная фе-нотипическая идентификация на основе вероятного подхода была проведена с использованием специальной автоматизированной системы - "Эн-тероИД", "УДеЫТ".
Псевдомонады идентифицировали по биохимической активности: продукции цитохромоксидазы, пиоцианина, окисления глюкозы на среде Хью-Лейфсона, разжижения желатины, роста на ацетимидном и мясо-пептонном агарах при 42 С, подвижности. Для высева энтерококков использовали среду Калины с 40 % желчи (А. Г. Калина, 1971). Для определения общего количества гемолитических форм производили высев на 5 %-ный кровяной агар (стрептококки, стафилококки, гемолитические формы эшерихий) и выражали его в процентах к общему числу выросших колоний.
Культивирование стафилококков выявлялось при посеве исследуемого материала на желточно-солевой агар. Инкубация проводилась в течение 2-х суток при 37 С с последующим определением видовой принадлежности. Идентифицировали стафилококки с помощью тест-систем API-20 по следующим показателям: расщепление D-глюкозы, D-фруктозы, D-маннозы, D-трегалозы, мальтозы, лактозы, D-маннита, D-мелибиозы, ксилита, раффинозы, сахарозы, метил-Б-глюкозида и ацетилглюкозамина, редукции нитратов и нитритов, продукции ацетил-метил-карбинола, наличию аргининдигидралазы и уреазы.
Дрожжеподобные грибы высевали на среде Сабуро, идентификация проводилась по типу филаментации, а также по наличию хламидоспор, ферментативной активности. Тип филаментации изучали на рисовом агаре. Культуральные свойства выросших дрожжеподобных грибов определяли на агаровых и жидких сусловых средах. При этом учитывали морфологию колоний, форму поверхности (гладкая, морщинистая), цвет (белый, кремовый, коричневый), консистенцию (кожистая, бахромчатая, врастающая в сусло среды и др.), характер роста на жидком сусле - наличие пленки или пристеночного кольца на поверхности среды, помутнение, осадок, затем изучали морфологию элементов гриба (мицелий, бластоспоры). Далее определяли форму бластоспор, их размер, характер почкования и ветвления мицелия, наличие хламидоспор.
Органические кислоты испражнений у лиц обследуемых групп
В соответствии с классификацией Бахадастера все наблюдаемые по типу выделения цист были разделены на 4 группы.
Первую составили больные, у которых цисты выделялись ежедневно или с небольшими (длительностью 1-2 дня) паузами, при этом интенсивность инвазии была высокой - количество цист и вегетативных форм паразитов превышало 10 в поле зрения (121 человек).
Во второй группе были 84 наблюдаемых, у которых паразиты обнаруживались редко, при этом паузы равны 6-7 дням, а интенсивность инвазии не превышала 5 цист в поле зрения.
Третью группу составили 81 человек, у которых определялись интервалы отсутствия цист длительностью 1-2 недели, а интенсивность их выделения была минимальной (1-2 цисты в поле зрения).
В четвертую группу вошли больные (154 человека), у которых обнаружена слабая интенсивность инвазии (цисты выделялись в количестве 1-2 в поле зрения) и перемежающиеся интервалы выделения вегетативной и цистовой форм лямблий длительностью от 5 до 20 дней.
При исследовании сыворотки крови инвазированных лямблиями на наличие антител к аналогичному антигену установлено, что титр их колебался от 1:20 до 1:240. При этом у 20 из них антитела обнаруживались в разведении 1:20, 1:40-у 20 человек, 1:80-21, 1:120-280 инвазированных, 1:240 - 99 человек, в среднем составив 1:156±6,0.
Учитывая, что по мнению С. Vassalo et al., 2001, диагностическим титром лямблиозной инвазии является обнаружение антител в разведении сыворотки 1:100, то 379 человек, имеющих антитела, расценены нами больными лямблиозом (титр более 1:100), а в 1:100 - лямблионосителями.
Чаще всего у больных наблюдались внекишечные синдромы - асте-новегетативный и общей интоксикации. Так, подавляющее большинство обследуемых (96,3 %) жаловались на общую слабость и усталость, особенно выраженные в конце рабочего дня, апатию (7,9), снижение аппетита (12,0), потерю веса (5,2 %). Также часто регистрировались жалобы, характеризующие патологию пищеварительного тракта. Наиболее значимыми из них были вздутие (100) и урчание в животе (62) - метеоризм, наличие которого отмечали у 16,3 % больных. Диарея установлена у 29,3 % обследуемых, при этом у 28,2 % поносы чередовались с запорами. Боли в животе различной локализации и интенсивности беспокоили 45 наблюдаемых, наиболее часто они ощущались вокруг пупка (4,7 %), реже в правом подреберье и эпигастрии (2,1 и 0,3 %), иногда носили разлитой характер болей. Аллергические проявления на коже и слизистых оболочках имели 26,6 % обследуемых (табл. 4).
Аллергические проявления 101 26,6 Изучение анамнеза позволило выявить у больных лямблиозом разнообразную сопутствующую патологию со стороны других органов и систем. Так, у одного ребенка был диагностирован гипертензионно-гидроцефальный синдром с задержкой психомоторного развития, у 3 -аденоиды, 30 человек (7,9 %) имели в анамнезе рецидивирующие отиты и тонзиллиты, 11 (2,9 %)-хронический пиелонефрит, 5 детей (1,3 %) страдали энурезом. Сопутствующая патология у лиц старше 16 лет была более многочисленной и разнообразной. Так, 83 (21,9%) наблюдаемых этой группы указывали на ранее выявленные у них заболевания желудочно-кишечного тракта (гастриты, гастродуодениты, холециститы, панкреатиты), у 9,3 % регистрировались рецидивирующие инфекции верхних дыхательных путей, у 15,9 %- неврозы и неврозоподобные синдромы, 6 человек (1,4 %) страдали хроническим пиелонефритом.
Таким образом, при клинических проявлениях лямблиоза обращено внимание на преобладание жалоб, связанных с нарушением пищеварения, которые могут быть обусловлены как травматическим влиянием паразитов, так и ускоренным пассажем пищевых масс по тонкой кишке и изменением направленности химических процессов в толстой кишке. Учитывая сказанное, дальнейшие разделы работы посвящены изучению микробной экологии и особенностям функционального состояния кишечника при протозойной инвазии.
Экспериментальное изучение взаимосвязи антилизоцимной активности и репродуктивной функции эшерихий при сокультивировании с лямблиями
Для изучения микроэкологии кишечника больных лямблиозом нами обследовано 379 больных, группой сравнения были 85 практически здоровых людей.
Анализ полученных данных показал, что доминирующее положение в микрофлоре больных лямблиозом занимают анаэробные микроорганизмы, качественный и количественный состав которых был разнообразен.
Исследования микрофлоры кишечника больных выявили ряд изменений в составе анаэробного и аэробного ее компонентов (табл. 23). Таблица 23 Анаэробная микрофлора кишечника больных лямблиозом Семейства Роды Частота встречаемости Количествобактерий в 1 гиспражнений,lg КОЕ/г % абс. Bacteroidaceae Bacteroides 100,0 379 12,0+0,5 Fusobacterium 69,9 265 10,0+0,5 Porphyromonas 10,5 40 5,0+0,3 Lactobacillaceae Lactobacillus 92,3 350 6,5+0,3 Actinomycetaceae Actinomyces 40,9 155 11,0+0,3 Bifidobacterium 86,5 328 6,5±0,3 Propionibacteriaceae Propionibacterium 44,8 170 5,0±0,3 Eubacterium 40,1 152 6,0±0,3 Peptococcaceae Peptococcus 15,0 57 3,0±0,1 Peptostreptococcus 20,0 76 5,0±0,2 Bacillaceae Clostridium 15,0 57 8,0+0,3 Ключевое положение среди анаэробов занимали бактероиды, определяющиеся у всех обследуемых (100 %) со средней величиной колониза 83 ции равной lg 12,0±0,5 КОЕ/г, что значительно превышало обсеменен-ность таковыми кишечника здоровых людей (70,6 %, lg 10,4±0,3 КОЕ/г). Регистрация фузобактерий в микрофлоре больных существенно не изменялась (69,9 %), тогда как плотность колонизации увеличилась до lgl0,0±0,5 КОЕ/г (р 0,05).
Выявлено, что частота встречаемости лактобацилл и бифидобакте-рий у больных снизилась (92,3 и 86,5 %), также было зарегистрировано значительное (на 2 и более порядка логарифма) уменьшение их плотности обсеменения (lg 6,5±0,3 КОЕ/г равнозначно). При этом уменьшение бифи-добактерий ниже 107 КОЕ/г выявлено у 11,1% (42), в то время как лакто-бактерий менее 106 — у 22,4% (85) обследуемых. У 26,4% (100) больных изменения носили менее выраженный характер, при этом уровень бифи-дофлоры снижался до 107, а лактофлоры - до 106 КОЕ/г. В 13,5 % случаев определялось полное отсутствие бифидобактерий, а в 7,7 % - лактобакте-рий. Число обследуемых, в кишечнике которых не было обнаружено анаэробных симбионтов, составило 7,9 % (30 человек).
У больных лямблиозом установлено достоверное увеличение плотности колонизации кишечника эшерихиями (lg8,5±0,l КОЕ/г). Количественные изменения в популяции Е. coli сопровождались качественными сдвигами, что проявлялось обнаружением значительного числа эшерихий с атипичными свойствами.
Из данных табл. 24 следует, что у больных количество неполноценных лактозонегативных штаммов практически не менялось (18,7 и 18,5 %), однако удельный вес их в составе микробиоценоза значительно возрастал (с lg 5,7+0,6 КОЕ/г у здоровых до lg 8,2+0,2 КОЕ/г у больных) (р 0,05). Обращало на себя внимание увеличение частоты выделения гемолитических штаммов Е. coli (23,2 %), при этом была установлена высокая плотность обсеменения ими кишечника - lg 8,3±0,2 КОЕ/г. Таблица 24 Качественный и количественный состав эшерихии, колонизирующих кишечник лиц обследуемых групп Эшерихии Частота выделения,% Плотность колонизации, lg M±m, КОЕ/г Р здоровые больные здоровые больные Общее количество 100 100 7,8+0,3 8,5+0,1 0,05 Лактозонегативные 18,7 18,5 5,7±0,6 8,2±0,2 0,05 Гемолитические 3,3 23,2 7,0+0,2 8,3±0,2 0,05
Полученные данные позволили считать, что у больных лямблиозом обнаруживались как качественные, так и количественные изменения в составе эшерихии. У 44,8% (170) больных количество кишечных палочек снижалось ниже 200 млн КОЕ/г, вместе с тем у 44,6% (169) установлено резкое нарастание числа вегетирующих в кишечнике эшерихии - свыше 1 млрд КОЕ/г испражнений, т.е. отмечался широкий диапазон вариации порога колонизации кишечника данными микроорганизмами. Среднее содержание Е. coli в кишечнике больных составило lg 8,5±0,1 КОЕ/г, что было достоверно выше, чем у лиц контрольной группы (lg 7,8±0,3 КОЕ/г) (Р 0,05).
При изучении видового состава условно-патогенных микроорганизмов прежде всего обращала на себя внимание широкая представленность энтеробактерий. Так, у 86,0 % обследуемых лиц данные бактерии были выделены в количестве 105 КОЕ/г, чаще всего среди УПЭБ (32,6 %) обнаруживались протеи, на втором месте по частоте регистрировались микробы рода Enterobacter spp. (28,6 %), Citrobacter spp. и Klebsiella spp. высевались несколько реже (15,1 и 6,6 %), Edwarsielia spp. и Cerratia spp. - в 5,1 и 0,9 % случаев.
Среди бактерий рода Enterobacter наиболее часто встречались представители вида Е. aerogenes (18,1%), реже - Е. cloaceae и Е. liquefaciens (8,1 и 1,1 % соответственно). У 5,1 % обследованных выделялись эдварси-еллы, а у 0,9 % - серрации, не обнаруживаемые в биоценозе здоровых людей.
Наибольшие различия были установлены в количественном содержании условно-патогенных энтеробактерий в испражнениях больных по сравнению с контрольной группой здоровых людей (табл. 26). Учитывая значительную репрезентативность выборки, с целью уменьшения нивелирования результатов в таблице приведены средние данные, рассчитанные на количество положительных проб испражнений, а не на всю величину статистического ряда. Все условно-патогенные микроорганизмы при лямблиозе имели высокое микробное число - от lg 6,2 до lg 8 КОЕ/г испражнений.
Кроме увеличения в микробиоценозе УПЭБ, обращало на себя внимание повышение значимости стафилококков. Так, стафилококки регистрировались в кишечнике больных в 2,2 раза чаще, чем у здоровых людей, при этом плотность колонизации этих микроорганизмов в кишечнике больных составляла lg 7,9±0,2 КОЕ/г. Особенно следует подчеркнуть появление в микрофлоре больных значительного количества S. aureus (38,8 %), не характерного для кишечного биоценоза здоровых людей, при этом у 22,4 % больных выделение золотистого стафилококка наблюдалось в количестве lg 7,4±0,3 КОЕ/г, у 16,4 % - lg 4,5±0,1 КОЕ/г.