Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. ПРОБЛЕМА КОЛИЧЕСТВЕННОЙ И КАЧЕСТВЕННОЙ ОЦЕНКИ ВЛИЯНИЯ ОСНОВНЫХ АНТРОПОГЕННЫХ ФАКТОРОВ НА РЫБ 14
1.1. Современное состояние запасов осетровых Волго-Каспийского бассейна 14
1.2. Основные факторы антропогенной деятельности и последствия их влияния на ихтиофауну 16
1.3. Морфологические аспекты повреждающего действия токсикантовна рыб 29
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 37
2.1. Химические, биохимические, гистологические и гистохимические методы анализа в натурных наблюдениях 37
2.2. Методы экспериментальных исследований 41
ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ УГНЕТЕНИЯ ДВИГАТЕЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ РЫБ ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ КАРБАМАТНЫХ ГЕРБИЦИДОВ ЯЛАНА И «САТУРНА» 45
3.1. Изменение физиолого-биохимических показателей в организме карпа в условиях подострой интоксикации яланом 45
3.2. Бифазный характер количественной динамики гематологических показателей по мере усиления тяжести деструкции в двигательных центрах нервной системы молоди белуги под влиянием гербицида ялана 48
3.3 Изучение вероятности репарации патологических нарушений в. ЦНС после прекращения действия гербицида «сатурна» на карпов 65
ГЛАВА 4. СТЕПЕНЬ И ФОРМЫ ПРОЯВЛЕНИЯ МОРФОФУНКЦИО-НАЛЬНЫХ ИЗМЕНЕНИЙ В ОРГАНИЗМЕ ОСЕТРОВЫХ ПРИ КУМУЛЯТИВНОМ ТОКСИКОЗЕ 69
4.1. Морфофункциональные изменения в печени и в гонадах осетровых... 69
4.2. Биохимические показатели метаболизма в организме осетровых в зависимости от вида и пола 78
4.3. Корреляция морфофункциональных показателей с количественной динамикой накопления стабильных экзотоксикантов во внутренних органах рыб 83
4.4. Зависимость овариального цикла у самок севрюги от морфофункциональных нарушений и количественного содержания ХОП и металлов во внутренних органах : 96
ГЛАВА 5. ФЕНОМЕН РАССЛОЕНИЯ СКЕЛЕТНОЙ ДОРЗАЛЬНОИ МЫШЦЫ ОСЕТРОВЫХ НА ФОНЕ ПАТОГИСТОЛОГИЧЕСКИХ ИЗ МЕНЕНИЙ В ПЕЧЕНИ 99
5.1. Количественная динамика активных метаболитов на фоне структурных нарушений во внутренних органах рыб при дистрофии скелетной дорзальной мышцы .' 99
5.2. Экстенсивные показатели динамики патоморфологических нарушений в печени осетровых в различные периоды исследований 125
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 130
ВЫВОДЫ 162
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 165
ЛИТЕРАТУРА 167
- Современное состояние запасов осетровых Волго-Каспийского бассейна
- Химические, биохимические, гистологические и гистохимические методы анализа в натурных наблюдениях
- Бифазный характер количественной динамики гематологических показателей по мере усиления тяжести деструкции в двигательных центрах нервной системы молоди белуги под влиянием гербицида ялана
Введение к работе
Актуальность. Проблема загрязнения природных поверхностных вод химическими веществами приобрела наиболее острый характер примерно в 50-ые годы прошлого столетия, что в первую очередь было" связано с ростом промышленного производства, повлекшего за собой резкое увеличение объема сточных вод и их компонентов, включая ксенобиотики, поступающих в открытые водоемы. В странах с высоким уровнем развития производства это вскоре привело к потере рыбохозяйственного и санитарно-гигиенического значения многих рек, озер, а затем масштабы загрязнения распространились и на мировой океан.
В нормировании качественного состава и объема сброса промышленных и других сточных вод в естественные водоемы количественной мерой является предельно-допустимая концентрация (ПДК) вредного вещества, имеющая юридическое значение в системе защиты природных вод от загрязнения.
В действительности ПДК отражает реакцию тест-организма на воздействие одного конкретного вещества и поэтому не может служить для оценки сложнейших взаимосвязей биотических и абиотических факторов, которые играют определяющую роль в формировании качества природных водоемов и в процессах самоочищения их от загрязнения (Федоров, 1980). На этом основании некоторые исследователи считают необходимым поиск альтернативных критериев и подходов (Степанов, 1989). Но в области санитарной и общей гидробиологии такие критерии существуют с прошлого века (Зернов, 1934; Долгов с со-авт., 1927), которые в настоящее время представляют собой систему сапробно-сти и ее различные модификации (Жукинский с соавт., 1927).
Также разработаны оригинальные методы математического моделирования экосистем (Федоров В. Д. с соавт., 1980), методы биотестирования природных и сточных вод (Патин, 1981), система экологической модуляции, прогресса и регресса, происходящих на уровне биоценоза (Абакумов, 1991). Общим для всех систем биологической оценки степени загрязнения и водоемов является
определение видового разнообразия и численного состава планктонных и бен-тосных организмов, что и служит критерием уровня загрязнения и процессов самоочищения водоемов. При отмирании планктонные организмы удаляют из фотического слоя значительную часть загрязняющих веществ, которые в процессе биоседиментации депонируются в донных осадках. Скорость самоочищения существенно зависит от географического расположения водоемов и сезонных колебаний численности планктонных организмов. Например, в зимний период зона действия сульфат-целлюлоизных сточных вод больше, чем осенью (Hassel-brot, 1964). Качество природных вод обычно рассматриваются в отрыве от рыб, хотя видовая структура ихтиофауны, безусловно, зависит и от прямого влияния загрязнения и опосредованно связана с гидробиологическими процессами.
В условиях загрязнения наблюдали существенное изменение видового состава ихтиофауны и снижение продуктивности ценных видов рыб (Федий, 1964; 1984) . Автор пришел к выводу о необходимости регистрации видового разнообразия ихтиофауны с применением гистологических и физиолого-биохимических методов анализа. Данный вывод очень важен и не потерял своей актуальности в настоящее время, т.к. утрата рыбохозяйственного значения проявляется прежде всего в виде увеличения численности малоценных и снижения запасов ценных видов рыб. Аналогичный подход в оценке последствий загрязнения предложен и другими специалистами за рубежом (Bechtel Т, 1970) . В этой связи следует учитывать предложенную A.M. Бейм с соавт. (1984) классификацию видов-индикаторов и видов-мониторов. В перспективе исследований необходимы критерии, соответствующие всем уровням организации от молекулярного до популяционного, что согласуется с концепцией, выдвинутой Н.С.Строгановым (1978), сущность которой заключается в сохранении вида, что прямо связано с функциональными нарушениями на уровне тканей и клетки в организме гидробионтов, имеющих хозяйственное значение. Придерживаясь данной концепции, основным объектом изучения является репродуктивная
система в организме рыб как показателя благополучного состояния популяции. Кроме этого, необходимы средства ранней диагностики токсикоза в организме тех органов, которые играют первостепенную роль в детоксикации организма. Именно эта функция, как известно, принадлежит печени, в которой синтезируются белки, неоходимые для созревания гонад. В опубликованных материалах известны данные о гепатозависимости мейоза у рыб, в частности, образование в печени вителлогенина, необходимого в процессе созревания ооцитов (Шату-новский,1967; Кривобок с соавт., 1970; Айзенштадт, 1979). Впервые в экспериментальных водоемах (пруды) у карпа с патологическими структурными изменениями в печени были зарегистрированы случаи резорбции ооцитов под влиянием гербицидов (Попова, 1973). В естественных условиях предрезорбцинные признаки в ооцитах зарегистрированы у осетровых в р. Волге (Алтуфьев с соат., 1984) в связи с вводом в эксплуатацию Нижневолжского вододелителя. По данным Н.В. Акимовой (1991) у сибирского осетра отмечена массовая деструкция половых клеток, а у волжских осетровых предрезорбтивные признаки ооцитов. Опубликованные данные свидетельствуют о широком географическом распространении микроструктурных нарушений в половых клетках рыб, а у осетровых Волго-Каспия эти нарушения сопровождаются нарушениями в печени, в скелетной мускулатуре и в жабрах (Дубовская с соавт., 1987; Романов, 1990; Алтуфьев, 1990) . Проведенные в том же направлении систематические исследования в Обь-Иртышском бассейне, позволили установить нарастающие изменения в гонадах сиговых, карповых и окуневых рыб в виде цитолиза и атрезии пре-, и вителлогенных ооцитов, резорбции клонов сперматоцитов, микроструктурные нарушения спермиев на фоне деструкции гепатоцитов (Селюков, 1997). В зарубежной литературе материалы также посвящаются вопросам микроструктурных нарушений и нообразований в печени и гонадах (Mallins et. al.,1984; Mallins et al., 1984; Baumann, 1984; Krahn et. al.,1984; Podowcki et.al., 1991; Gronlund et al., 1991).
В экспериментальной токсикологии рыб под влиянием пестицидов описаны структурные нарушения в паренхиматозных органах, в жабрах, в спинном и в головном мозге (Краснов, 1970; Мазманиди, 1973; Кокуричева, 1974; Лизина с соавт., 1975; Щербаков с соавт., 1975; Бурковский, 1977; Бур-ковский с соавт., 1977). Под влиянием гербицидов из группы эфиров феноксиуксусной кислоты в головном и в спинном мозге карпов были зарегистрированы и описаны структурные изменения (Щербаков 1983), а также изменения в сосудистой системе, что по оценке автора свидетельствует об истощении функции нейронов с последующей гибелью рыб. Во всех перечисленных работах структурные нарушения представлены без дифференциации ЦНС на отделы и описания внешних симптомов токсикоза. Между тем внешние проявления двигательных актов изучены в достаточной степени в области физиологии всех отделов ЦНС рыб (Кара-мян, 1970). Которые безусловно, не всегда могут быть связаны с нарушениями в ЦНС, но при этом нарушения микроструктуры различных отделов нервной системы отвечают на вопросы о вероятности физиологической регенерации. С другой стороны данные биохимического анализа, как правило, не подкрепляются анализом микроструктурных нарушений в органах и тканях рыб (Лукья-ненко, 1975; Косинова, 1978; Маляревская, 1979). Морфо-функциональным аспектам посвящена незначительная часть исследований на субклеточном (Сидоров, 1983) и на клеточном уровне (Попова, 1973) .
Таким образом, нарушения целостности структуры печени и других органов рыб в естественных условиях часто изучаются вне зависимости от материальной кумуляции токсикантов и функциональной характеристики. Недостаток сведений по этим вопросам существенно затрудняет прогноз дальнейшей судьбы особей с патологическими нарушениями во внутренних органах, что прямо связано с формированием численности рыб.
Мало изучены вопросы о суммационном воздействии на организм экзо-, и эндотоксикантов при нарушении метаболических процессов в организме. В па-томорфологии рыб пока отсутствует классификация структурных нарушений, в
свете новых достижений в теории общей патологии (Саркисов, 1997) . Отсутствие морфофункциональных оценок токсикоза на современном этапе затрудняет выявление приспособительных компенсаторных признаков и регенерации в организме рыб. Исходя из всего сказанного выше, в настоящей работе были поставлены следующие цели и задачи исследований.
Цель исследований. В экспериментальных условиях установить критерии толерантности рыб при токсикозе с помощью морфофункциональных методов анализа важнейших систем организма и внешних симптомов интоксикации на примере карпа и молоди белуги; в натурных наблюдениях выявить закономерности патологических морфофункциональных нарушений и определить критерии кумулятивного токсикоза в организме каспийских осетровых.
Задачи исследований:
-Экспериментальными методами исследований выявить функциональное значение биохимических показателей метаболизма в скелетной мускулатуре и микроструктурных нарушений в различных отделах ЦНС в процессе угасания двигательно-пищевых реакций у рыб под влиянием гербицида ялана.
-В направлении унификации и совершенствования принципов диагностики экзотоксикозов у рыб выявить характер кинетики показателей дыхательной функции крови в связи с патоморфологическими нарушениями в двигательных центрах нервной системы в процессе интоксикации. Классифицировать пато-морфологические нарушения в отделах ЦНС в связи с физиологической и репарационной регенерацией у рыб после прекращения интоксикации.
-На основе выборочных и типологических наблюдений установить пределы колебания экстенсивно-структурного показателя числа случаев патоморфо-логических нарушений во внутренних органах осетровых в различные годы исследований. Выявить характер и силу связи патоморфофункциональных показателей от уровня накопления ХОП и металлов во внутренних органах рыб.
-Систематизировать патоморфофункциональные критерии нарушения де-токсикационной функции печени и определить их значение в развитии половых
желез осетровых, включая овуляцию. Сопоставить характер кинетики активности оксидоредуктаз с тяжестью патоморфологических нарушений во внутренних органах осетровых.
-Теоретически обосновать данные кинетики патоморфологических изменений во внутренних органах как показателя толерантности и модификацион-ной изменчивости в популяции каспийских осетровых при современных экологических условиях Волго-Каспия.
Научная новизна. Впервые доказана необратимость и разработана классификация патоморфологических нарушений всех отделов ЦНС у рыб, адекватно возникающих в процессе угнетения двигательно-пищевых реакций под влиянием тиокарбаматных соединений. Нарушение стереотипа поведения рыб также вызвано накоплением в скелетной мышце гидроперекисей и экстрактивных веществ, аммиака, мочевины, что может служить критерием развития ауто-токсикоза.
Общеизвестное депонирование гидрофобных ХОП в жире и в тканях, богатых жиром у рыб, дополнено новыми фактами зависимости уровня кумуляции ДДТ с количеством отдельных липидов. По сравнению с самцами корреляция токсикантов с активными метаболитами чаще наблюдалась в органах самок, в организме которых, как известно, уровень энергетического и пластического обмена выше, чем у самцов.
Доказана функциональная связь гаметогенеза у осетровых с детоксикаци-онной ролью печени, сущность которой заключается в синтезе белков, вступающих во взаимодействие с токсикантами, что оценивается по количественному уровню ДНП и РНП.
Также установлена зависимость морфофункционального состояния дор-зальной мышцы от детоксикационной способности печени. В природных условиях на примере осетровых впервые дана характеристика анаэробиоза в организме с помощью гистоэнзимохимических методов анализа.
Впервые получены результаты сопоставительного анализа, отражающие несоответствие развития во времени деструктивных и функциональных изменений. Гетерохрония также отмечена при изучении связи гистопатологических нарушений с уровнем накопления токсикантов.
Практическое значение работы прежде всего выражается в рекомендации более широкого применения патоморфологических методов анализа внутренних органов рыб, состояние которых отражает экологическую обстановку в природных водоемах, и значительно расширяет возможности биотестирования качества воды.
В анализе микроструктуры внутренних органов рыб для биотестирования качества природных и сточных вод существенное значение имеет целенаправленный анализ мотонейронов сегментарных отделов ЦНС, реакция которых прямо связана с двигательно-пищевыми реакциями.
В ихтиологии дополнительным критерием состояния популяции рыб рекомендуется применение сопоставительного анализа патоморфологических, реге-нерационных и метаболических показателей в печени,сопряженных с развитием гамет, что в итоге дает более полное представление о качестве репродуктивной системы при кумулятивном токсикозе.
Не оставляет сомнений применение методов патогистологии в рыбоводстве, технологические процессы которого прямо связаны с качеством природных вод, а также при экспертизе с целью определения возможности интродукции новых видов рыб в конкретных водоемах.
Исследования проводились в соответствии с комплексными программами КаспНИРХ и АГТУ по следующим темам:
«Изучение влияния пестицидов на экосистемы морей, водохранилищ и прудовых хозяйств» - № гос. регистрации 78030894.
«Содержание и влияние на биопродуктивность нефтепродуктов солей тяжелых металлов, пестицидов в Каспийском море и дельте р. Волги, возможная динамика их в перспективе. Процессы самоочищения в дельте реки Волги. Me-
роприятия по снижению загрязненности водоемов (без переброски стока северных рек) - № гос. регистрации 0182.8043271.
«Оценка влияния газоконденсатного комплекса на экосистемы рыбохозяй-ственных водоемов» № гос. регистрации 0188.0034762.
На защиту выдвигаются следующие положения:
Баланс тяжелых металлов и ХОП в отдельных органах осетровых в значительной степени зависит от функциональной активности всех систем организма, что подтверждается результатами корреляционного анализа. В исследованиях по изучению динамики уровня кумуляции ксенобиотиков и металлов в рыбе, рекомендуется правило функционального распределения экзотоксикан-тов, которое предусматривает анализ на их содержание всех органов, включая скелет и кровь. Выявленная корреляция накопления ХОП и тяжелых металлов с количеством фосфолипидов, холестерина и эфиров холестерина позволяет осуществлять целенаправленный анализ эндокринной системы и резистентности биомембран при кумулятивном токсикозе.
Деструктивные изменения в печени осетровых усугубляются снижением уровня РНП и ДНП, что является критерием кумулятивного токсикоза и предпосылкой дальнейшего изучения синтеза белков на уровне генома в ходе транскрипции и трансляции генетической информации. Значительную роль в регенерации выполняют макрофаги и лимфоциты, повышение активности которых в тканях, наряду с увеличением синтеза белков в печени, отражает сущность регрессии.
На фоне регрессивных процессов в печени осетровых в мышце и гонадах наблюдается снижение уровня активности энзимов аэробного дыхания. Инверсия окислительно-восстановительных реакций в печени также приводит к дефекту ее детоксикационной функции. Снижение аэробного дыхания в мышце и гонадах следует признать одним из показателей гипоксии в организме и рассматривается в качестве одного из важнейших критериев отдаленныыых последствий кумулятивного токсикоза.
4. На основе альтернативного анализа в популяции осетровых выявлено две группы рыб, различающихся по степени толерантности при кумулятивном токсикозе. Первая группа особей, численность ккоторых возрастает в последние 10 лет, сфформировалась в результате адаптивной модификации, возможно, в пределах новой нормы и под влиянием естественного отбора сохраняется в настоящее время как наиболее совершенная и устойчивая к негативному влиянию внешних факторов.
Во второй группе рыб патоморфологические и функциональные нарушения создают определенный риск в поддержании общего гомеостаза и репродуктивной системы организма.
Апробация работы. Материалы доложены и обсуждены на: Научно-практической конференции (Волгоград, 1977), IV Всесоюзной конференции по экологической физиологии и биохимии рыб (Астрахань, 1979), IV Всесоюзной конференции по раннему онтогенезу рыб (Мурманск, 1988), Всесоюзном совещании «Поведение рыб» (Москва, 1989), Всесоюзном совещании «Осетровое хозяйство водоемов СССР» (Астрахань, 1989), Региональной конференции «Экологические проблемы Волги» (Саратов, 1989), Симпозиуме, посвященному 90-летию со дня рождения проф. Н.Л. Гербильского (Ленинград, 1990), Второй Всесоюзной конференции по рыбохозяйственной токсикологии (С.Петербург, 1991), Всероссийской конференции «Экосистемы морей России в условиях антропогенного пресса» (Астрахань, 1994), Совещании .«Многолетние гидробиологические наблюдения во внутренних водах: современная ситуация и перспективы» (С.-Петербург 1994), IV Всероссийской конференции «Нейроэн-докринология-95» (С.-Петербург, 1995), Международной конференции «Каспий - настоящее и будущее» (Астрахань, 1995), Первом Конгрессе ихтиологов России (Астрахань, 1997), 3-rd International symposium on sturgeon. (Piacenza. - Italy, 1997), Российской научной конференции «Эколого-биологические проблемы Волжского региона и Северного Прикаспия» (Астрахань, 1998), V Всероссийская конференция «Нейроэндокринология 2000» (С.-Петербург, 2000); 4th Inter-
national sumposium of sturgeon, Oshkosh, Wisconsin, USA, 2001; Общероссийская конференция «Проблемы морфологии» Сочи, 2002.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 56 научных работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 199 страницах текста, содержит введение, 5 глав, включающие 14 подглав, заключение, выводы, практические рекомендации, 56 рисунков, 20 таблиц и указатель литературы (327 источников, из них 89 работ иностранных авторов).
Современное состояние запасов осетровых Волго-Каспийского бассейна
Промышленный лов осетровых, как и других видов промысловой ихтиофауны, практически не имеет перспективы развития без учета причинно-следственных связей динамики численности промысловых видов рыб. До того как возникла острая проблема негативного влияния антропогенных факторов на водные экосистемы в промысловой ихтиологии главным образом уделяли внимание правилам режима рыболовства. Ежегодные лимиты промысла определялись на основе традиционных ихтиологических наблюдений за миграцией рыб, за условиями их нереста, нагула, общими запасами и т.д.
В связи с возрастающей ролью влияния на ихтиофауну антропогенных факторов возникла необходимость изучения физиолого-биохимического состояния рыб на различных уровнях организации, что широко используется на примере каспийских осетровых, многолетняя динамика численности которых испытывала значительные колебания. По данным Л.С. Бердичевского (1971) уловы осетровых в 1913 и 1930 годы составляли 283 и 133 тыс. ц., или 28,3 и 13,3 тыс. т., соответственно, в 1940 году по известным причинам уровень добычи снизился до 8,9 тыс. т. Затем уловы вновь увеличились и в 1968 году достигли 16,5 тыс. т., оставаясь ниже уровня 1913 года. Отсутствие дальнейшего увеличения уловов среди прочих причин автор называет и загрязнение водной среды, не подкрепляя фактическими данными.
Всесторонний анализ запасов осетровых с учетом различных факторов проводился Ю.Ю. Марти (1972). На основе биологических особенностей увеличение численности осетровых он рассматривал в связи с эффективностью естественного и искусственного воспроизводства, с условиями нагула взрослых особей и молоди, а также с загрязнением водоемов, но, как и в предыдущей работе автор не приводит сведений о существующей в то время токсикологической ситуации в Волго-Каспийском бассейне., которые до 1990 года в открытой печати не публиковались
В период с 1990 по 1995 годы общий улов осетровых на Каспийском бассейне сократился в четыре раза (Власенко, 1997; Иванов с соавт., 1997) заметно снизились и запасы осетровых. Тенденция к снижению наметилась уже в 1990 году. По данным наблюдений во время нагула в море с 1990 по 1992 годы количество осетра при стандартном тралении составило 0,76; 0,61 шт. соответственно, а численность белуги по тому же показателю сократилась в 3 раза (Паль-гуй с соавт., 1993). Последующие наблюдения 1993 г. вновь показали прогрессирующее снижение относительной численности запасов осетровых (Ходоревская с соавт., 1994). В тот же период общий вылов осетровых составил 6866 тонн (Ходоревская, с соавт., 1993). Существенное снижение в 1992 по сравнению с предшествующим 1991 годом отмечено и по эффективности нереста. Например, количество производителей озимого осетра и белуги сократилось в 2 раза, по количеству отложенной икры - в 40 раз, а по количеству покатной личинки - в 14 раз (Распопов с "соавт., 1993). В целом промысловые запасы ана-дромных мигрантов белуги, осетра и севрюги в период 1961-1965 составили 26,0; 860,3; 535,4, а в 1991-1994 гг. эти показатели резко сократились и достигли величин 7; 354; 289 тыс.шт. соответственно (Ходоревская, 1997) . В море общие запасы белуги и осетра сократились в 2 раза, а севрюги в 2,2 раза (Красиков, 1997). Столь существенное снижение запасов осетровых специалисты -ихтиологи объясняют неучтенным изъятием (браконьерством). Вместе с тем авторы не исключают отрицательного влияния загрязнения, но на современном этапе научных исследований в области экотоксикологии пока остаются нерешенными методические вопросы по определению прямой связи фактора загрязнения с негативными последствиями его влияния на рыб.
В последние 50 лет на рыбные запасы Волго-Каспия существенно продолжает оказывать влияние зарегулирование стока р. Волги и загрязнение водоемов химическими веществами. Подсчитать полный ущерб рыбному хозяйству в результате негативного влияния фактора загрязнения - задача многосложная и ее решение осуществляется на основе системы мониторинга с использованием ихтиологических показателей плодовитости, промвозврата и т. д., которые затем сопоставляются с ПДК загрязняющих веществ. Такой подход оправдан при массовой гибели рыб, но и в этих случаях точно определить причину гибели не всегда возможно. При хронических токсикозах избирательную смертность рыб от загрязнения, как основного показателя ущерба, по существующим методикам возможно получить весьма приблизительно, что прежде всего-связано го стахостическим характером фактора загрязнения.
Химические, биохимические, гистологические и гистохимические методы анализа в натурных наблюдениях
Лов рыбы в период 1982-1986 г.г. проводили в средней зоне дельты р. Волги с судов КаспНИРХ плавными сетями ячей 75-80 мм. На анализ брали весь улов. После внешнего осмотра рыбу вскрывали и препарировали кусочки органов на соответствующий вид анализа. В 1988-2006 годы исследований биопробы на гистологический и гистохимический анализ брали выборочно из материала, собранного сотрудниками КаспНИРХа лаборатории физиологии и биохимии осетровых на промысловых тонях «Чкаловская» и «Мужичья»,а также из уловов с помощью траления в море. В первый период наблюдений обследованы осетр и севрюга, во внутренних органах которых (печень, мышца, гонады) определяли ХОП, металлы и параллельно проводили биохимические, гистологические, гистохимические и гистоэнзимохимические виды анализа. Во второй период, кроме осетра и севрюги, на исследование брали белугу.
Химические методы анализа использовали с целью определения тяжелых металлов и хлорорганических пестицидов (ДДТ, его метаболитов ДДЕ, ДДД, изомеры ГХЦГ) во внутренних органах обследованных рыб (осетр, севрюга). Для определения металлов в годы исследований (1982-1986) широко использовались спектральные (Кустанович, 1962) и спектрографические методы (Еременко, 1969; Воробьев, 1979) . В настоящей работе металлы определяли мето-% дом эмиссионного спектрального анализа на спектрографе PYS-2 с. решеткой 651 шт/мм (Еременко, 1969) . При этом применяли угольные электроды марки ОСЧ-1. Анализируемая проба, смешанная с графитовым порошком (1:1), содержащим внутренний стандарт 0,05% хлористого свинца, помещалась в капсулу электрода с диаметром канала 3 мм, глубина 4 мм. Верхние электроды заточены на конус. Линии почернения соответствующих определенному элементу, фиксировали на фотопластинке спектрального типа ЭС чувствительностью 10 ед ГОСТ/4, степень почернения линий определяемого элемента и внутреннего стандарта производили на микрофотометре МФ-2.
Качественный и количественный анализ ХОП определяли методом газовой хроматографии на приборе японской фирмы «Yanaco». Подготовку и анализ проб осуществляли по методике, разработанной коллективом авторов (Пивоваров с соавт., 1974). Предварительно биопробы экстрагировали трижды гексаном, экстракт обезвоживали над сульфатом натрия, а затем упаривали при комнатной температуре под вытяжкой. Упаренный таким образом экстракт в количестве 10 микрограмм с помощью микрошприца вносили в ячейку с датчиком электронного захвата. Результаты автоматически получали в виде графика на специальной бумаге. После этого рассчитывали количество пестицидов по площади пиков, которые сравнивали с площадью пиков стандартов. Хроматография стандартных растворов пестицидов осуществлялась в тех же условиях, что и проб. Разделение и идентификация пестицидов производилась автоматически в атмосфере инертного газа азота, соответствующей для этих целей чистоты. Обследовано 116 экз. рыб. Всего обработано 575 проб биоматериала, из них 295 проб на металлы и 279 проб на пестициды.
Биохимический анализ проводили в строгом соответствии с отбором проб на химический и другие виды анализа. Влагу определяли весовым способом. Для этого пробы органов взвешивали в сыром виде, затем высушивали до постоянно сухого веса. По разнице сырой и сухой навески получали влагу, которую выражали в процентах. Общее количество белка определяли общеизвестным методом (Филипович с соавт., 1982).
Общие липиды получали по методике Фолча (Folch, 1957). Для этого кусочки органов точной навески гомогенизировали, а потом экстрагировали смесью метанол-хлороформ. Полученный экстракт упаривали на ротационном вакуумном испарителе и после взвешивания общее количество липидов выражали в г на 100 г. сырой навески. После взвешивания липиды хроматографировали на отдельные фракции в тонком слое силикагеля на пластинках «Sylufol» по методу Кейтса (Кейтс 1979). Проявляли липиды в парах йода. Далее все участки с липидами соскабливали с пластинки и все соскобы взвешивали на аналитических весах. Полученные данные пересчитывали в соответствии с результатами стандартных проб липидов, которые хроматографировали в тех же условиях, что и опытные образцы. Количество липидов выражали в процентах. Всего иденцифицировано шесть фракций липидов: фосфолипиды, жирные кислоты, холестерин, эфиры холестерина, триглицириды, углеводороды. Фракцию углеводородов не учитывали.
Гистологические и гистохимические методы анализа. Для выявления возможных нарушений во внутренних органах препарировали кусочки печени, гонад и мышцы спины, фиксировали в 10-и процентном нейтральном формалине и доставляли в лабораторию. В лабораторных условиях после проводки в спиртах кусочки заливали в парафин и на санном горизонтальном микротоме готовили срезы толщиной 7-10 микрон. Окрашивали срезы гематоксилином и эозином (Ромейс,1953; Меркулов, 1969). Гистохимически выявляемые липиды окрашивались Суданом III-IV, фосфолипиды Суданом черным Б, рибонуклеопро-теиды (РНП) - по Браше, дезоксинуклеопротеиды (ДНП) - по Фёльгену (руководство Пирса, 1962) . Для гистоэнзимохимического анализа кусочки органов доставляли на холоду в лабораторию и далее срезы готовили в криостате. Всего выявляли три группы окислительно-восстановительных ферментов:
1-аэробного окисления - специфические дегидрогеназы (сукцинат-, малат-, изоцитрат-, глутаматдегидрогеназы).
2-анаэробного окисления, гликолиза и пентозного цикла (лактат-, альфа-глицерофосфат-, и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы).
3-конечного звена дыхательной цепи - цитохромоксидазы.
Активность ферментов определяли по методикам Э. Пирса (1962), Муг и Р. Берстона (1953), Р. Лилли, (1969). Все препараты микроскопировали и фотографировали на микроскопе фирмы «Olimpus».
Всего обследовано 1686 экземпляров осетровых видов рыб, приготовлено и исследовано 19832 гистопрепарата, из них на морфологический анализ 4028, на гистохимический 6927 и на гистоэнзимохимический 8877. Для выборочных типовых исследований использован альтернативный анализ, (Сепетлиев, 1968), с помощью которого определяется интервал процента случаев морфологических нарушений по формуле:
Коэффициент t находят по табличным данным при Р(,)=0,95 или Р(1)=0,99. Методом парной корреляции определяли связь физиолого-биохимических показателей с уровнем накопления ХОП и металлов (Сепетлиев, 1968; Плохин-ский, 1970).
Бифазный характер количественной динамики гематологических показателей по мере усиления тяжести деструкции в двигательных центрах нервной системы молоди белуги под влиянием гербицида ялана
Опыт проводили в два периода, в первый период экспозиция опыта составляла 15 дней, а во второй 21 день. Через 15 дней при концентрациях гербицида 0,1;0,45 мг/л стереотип поведения рыб не отличался от контроля, при максимальных концентрациях ялана 2,2;4,5 мг/л некоторые рыбы теряли плавательную способность и погибали. Анализ крови молоди белуги выявил заметные изменения. Величина гемоглобина по мере увеличения концентраций гербицида снижалась и составляла 6,3; 3,8; 2,5; 2,8; , в контроле 3,3 процента. Число эритроцитов уменьшалось в том же направлении, у подопытных рыб оно составляло 690; 630; 600; 610, а в контроле 723 - тыс/мл. Соответственно изменялся и цветной показатель (ЦП)-5,2; 3,5; 2,8; 2,7; против контроля 2.7 (Табл.3.2.1).
Во второй период (экспозиция 36 дней) при концентрации гербицида 0,1 мг/л у подопытных рыб нарушение плавательной способности выражалось в виде периодической остановки и погружения на дно аквариума. При концентрациях гербицида 0,45 и 2,2 мг/л плавательная активность почти полностью была утрачена, оборонительная реакция была слабой или вовсе отсутствовала. На фоне внешних проявлений интоксикации часть рыб погибла и при соответствующих концентрациях выживаемость их на последний день опыта составляла 84 и 54 процента, считая от исходного количества. При максимальной концентрации гербицида 4,5 мг/л гибель рыб происходила более интенсивно, и на 25-ый день она составила 100 процентов.
Несмотря на прогрессивное угнетение плавательной активности рыб, при всех концентрациях гербицида, величина гематологических показателей изменялась во времени в зависимости от степени токсичности ялана.
По мере угнетения плавательной способности у подопытных рыб в концентрации гербицида 0,1 мг/л после 15-и дней интоксикации количество гемоглобина в крови почти в 2 раза выше, чем в контроле, а 36 дней спустя уровень гемоглобина не отличался от контроля. При концентрации ялана 0,45 мг/л количество гемоглобина возрастало в зависимости от экспозиции и совершенно не изменялось при концентрации гербицида 2,2 мг/л. Иная, динамика наблюдалась по количеству эритроцитов. В первый период (15 дней) в крови подопытных рыб количество эритроцитов меньше, чем в контроле. Во второй период количество клеток красной крови увеличилось относительно контроля только при концентрации гербицида 0,1 мг/л, а при остальных концентрациях ялана уровень эритроцитов понизился и относительно контроля и по отношению к данным первого периода экспозиции.
В соответствии с этим изменялся и цветной показатель, величина которого при концентрациях гербицида 0,1;0,45 мг/л достоверно выше, чем в контроле, а при максимальных концентрациях различий не отмечено. Через 36 дней при -концентрации гербицида 0,45 мг/л ЦП был почти в два раза выше, чем в контроле и заметно понизился при концентрации ялана 2,2 мг/л (таблица 3.2.1.).
Таким образом, динамика гематологических показателей носит фазный характер и зависит от концентрации ялана и от экспозиции интоксикации. Полученные данные имеют большое значение при изучении токсичности веществ, в диагностике экзотоксикозов, при биотестировании сточных и природных вод. Разовый отбор проб, как видно из результатов анализа, не позволяет предвидеть дальнейшее развитие дыхательной функции,гипоксии. Видимо, устойчивая гипоксия имеет место в случаях нарушения синтеза гемоглобина и эритропоэза. По данным настоящей работы ялан, вероятно, влияет на регуляцию кровотока, обеспечивающего потребности органов и тканей кислородом. В связи с таким объяснением, многие физиолого-биохимические показатели периферической крови необходимо сопоставлять с данными анализа тех органов, с которыми функционально связаны эти показатели. В этом отношении первостепенное значение приобретают исследования патоморфологии органов и их систем с учетом регистрации внешних поведенческих реакций рыб в процессе интоксикации.
Изменение уровня ЦП, как следует из результатов анализа, происходило за счет количества гемоглобина в первый период (15 дней), а во второй (36 дней) существенно изменялось не только количество гемоглобина, но и эритроцитов. Следоательно, механизмы внутреннего дыхания заключаются в изменении степени насыщения гемоглобином клеток красной крови и, возможно, в результате изменения гемодинамики, что и отразилось на количестве эритроцитов в пере-ферической крови. Обратная зависимость уровня ЦП от концентрации ялана согласуется с известным в токсикологии явлением неспецифическим привыканием, возникающим в организме животных даже в условиях повышенияя доз при многократном введении яда. Таким образом, в экспериментальной токсикологии рыб разовый анализ недостаточный для диагноза происшедших в организме изменений. Первостепенное значение в изучении двигательной активности рыб при интоксикации имеют те органы и их системы, которые являются морфофункциональной основой плавательной способности рыб. Кроме скелетной мускулатуры, к таким системам относится центральная нервная система, обеспечивающая регуляцию различных функций, в том числе, и сократительной функции скелетных мышц. В продолжении этих исследований получены данные о существенных нарушениях мотонейронов и реакции сателлитарных клеток в различных отделах ЦНС молоди белуги. Спустя 36 дней, считая от начала опыта, при концентрации ялана 0,1 мг/л на фоне описанных выше внешних симптомов интоксикации в различных отделах ЦНС наблюдали следующие изменения.
Спинной мозг. Цитоплазма большинства мотонейронов передних рогов мозга гипохромна, тигроид пылевидный, отростки далеко и сильно прокрашены (Рис.3.2.1.). Часто наблюдали аксональную реакцию. В отдельных случаях пик-ноз ядрышка и различные контуры ядра. Отдельные нейроны сморщенные, са-теллитарная реакция слабо выраженная.
Продолговатый мозг. В клетках двигательных ядер блуждающего нерва и вентрамедиальной группы отмечено набухание цитоплазмы, хромофобия, утолщение отростков. Ядра нейронов вытянуты, окраска перинуклеолярной зоны усилена. У других нейронов отростки резко базофильны, размеры ядер уменьшены, а ядрышек увеличены, глыбки тигроида различались с трудом. В каудальных отделах продоговатого мозга отмечались набухание и базофилия цитоплазмы, сморщивание ядра и набухание ядрышка. В области моторного ядра тела нейронов сильно вытянуты, отростки резко утолщены и прокрашены на большом расстоянии. Аналогичная картина характерна для нейронов ядра блуждающего нерва (Рис. 3.2.2) .
