Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1. Общая характеристика процесса фотосинтеза .10
1.2. Характеристика флуоресценции хлорофилла растений 15
1.3. Природа быстрой флуоресценции хлорофилла растений .20
1.4. Природа замедленной флуоресценции хлорофилла растений .23
1.5. Методы измерения флуоресценции хлорофилла 27
1.5.1. Регистрация индукции флуоресценции хлорофилла .27
1.5.2. Модулированная флуоресценция хлорофилла 30
1.6. Роль гуминовых веществ в природе. 35
1.7. Токсическое воздействие соединений хрома 43
1.8. Токсическое воздействие наноалмазов детонационного синтеза .47
1.9. Токсическое воздействие наночастиц серебра 51
Глава 2. Материалы и методы исследования 54
2.1. Материалы исследования 54
2.2. Методы исследования 56
2.2.1. Регистрация световых кривых фотохимического и нефотохимического тушения на флуориметре Water-PAM 56
2.2.2. Регистрация флуоресценции хлорофилла на флуориметре Aquapen-C 100 .59
2.2.3. Регистрация индукционных кривых быстрой, замедленной флуоресценции и редокс превращения Р700 (пигмент ФС I) на М-РЕА-2 .62
2.2.4. Регистрация кинетики окисления и восстановления пигмента Р700 реакционного центра ФС I 65
2.2.5. Спектральный анализ 67
2.2.6. Определение размера наночастиц 69
2.2.7. Программное обеспечение .69
Глава 3. Результаты исследований и обсуждение .70
3.1. Оценка влияния гуминовых веществ на световые реакции фотосинтеза зеленых микроводорослей Scenedesmus quadricauda .70
3.2. Начальные нарушения фотоситетического аппарата у микроводоросли Phaeodactylum tricornutum в присутствии ионов хрома 77
3.3. Изменение устойчивости микроводоросли Scenedesmus quadricauda при добавлении гуминовых веществ в присутствии ионов хрома 94
3.4. Влияние наноалмазов детонационного синтеза на световые реакции фотосинтеза микроводоросли Scenedesmus quadricauda .100
3.5. Влияние наноалмазов детонационного синтеза на световые реакции фотосинтеза растений пшеницы Triticum aestivum L. в присутствии гуминовых веществ 104
3.6. Влияние наночастиц серебра на микроводоросли Scenedesmus quadricauda и изменение их устойчивости при разных режимах добавления гуминовых веществ 117
Заключение 122
Выводы 124
Список условных сокращений 126
Список литературы 127
- Природа замедленной флуоресценции хлорофилла растений
- Токсическое воздействие наноалмазов детонационного синтеза
- Оценка влияния гуминовых веществ на световые реакции фотосинтеза зеленых микроводорослей Scenedesmus quadricauda
- Влияние наночастиц серебра на микроводоросли Scenedesmus quadricauda и изменение их устойчивости при разных режимах добавления гуминовых веществ
Введение к работе
Актуальность исследования. В современных условиях значительный интерес
представляет исследование токсичности различных загрязняющих веществ, в том числе,
современных наноматериалов (Смуров А.В., 2003; Терехова В.А. с соавт., 2014;
Филенко О.Ф., 1988; Черных Н.А., Сидоренко С.Н., 2003). Наряду с такими известными
загрязнителями окружающей среды как тяжелые металлы и ионы хрома, широкое
распространение приобрели наночастицы (НЧ). Стремительное развитие
нанотехнологий приводит к увеличению выброса различных наночастиц в среду, где их судьба и поведение неизвестны (Голохваст К.С. с соавт., 2012). Уникальные свойства НЧ, такие как высокая удельная поверхность и подвижность, может привести к неожиданным для здоровья человека и окружающей среды последствиям (Шайтан К.В., 2011). Наночастицы серебра широко используются в медицине, текстиле, красках, в качестве пищевых добавок, упаковочной тары для продуктов питания. Из-за относительно дешевого производства наноалмазы (ДНА), производимые путем детонационного синтеза, используются в качестве горюче-смазочных материалов, в авиа- и автомобилестроение, медицине, химической промышленности. Данные вещества могут существенно влиять на фототрофные организмы, обеспечивающие энергией все экосистемы. Уменьшить токсическое воздействие этих веществ могут природные детоксиканты - гуминовые вещества. Гуминовые вещества (ГВ) присутствуют во всех природных средах и выполняют ряд экологических функций, как в естественных, так и в антропогенных экосистемах (Якименко О.С., 2016; Kulikova N.A., 2005). ГВ могут повышать доступность питательных веществ, положительно влиять на физико-химические и биологические свойства почвы, а также существенно изменять поведение токсикантов путем связывания их в нетоксичные комплексы или влияя на процессы окисления-восстановления токсикантов (Перминова И. В. с соавт., 2004).
Одним из общепринятых индикаторов устойчивости состояния растительного компонента экосистем является оценка эффективности процессов фотосинтеза в ответ на воздействия окружающей среды (Заворуева Е.Н., Заворуев В.В., 2011). Фотосинтез лежит в основе почти всех экологических систем на земле и представляет сложную систему преобразования энергии света, состоящую из двух фотосистем (ФС II и ФС I), осуществляющих нециклический электронный транспорт с разложением воды и выделением кислорода, образованием НАДФН2 и АТФ. Нарушения в первичных процессах фотосинтеза отражаются в изменениях флуоресценции хлорофилла а. В настоящее время развиваются методы анализа световых и индукционных кривых флуоресценции, позволяющих на интактных объектах следить за основными стадиями фотосинтетической электрон-транспортной цепи. (Гольцев В.Н. c соавт., 2014; Маторин Д.Н., Рубин А.Б., 2012; Strasser R.J. et. al., 2010). В настоящее время измерения кинетики индукции флуоресценции все шире используются при проведении экологического мониторинга.
Однако исследований по воздействию ионов хрома и современных
наноматериалов на световые реакции фотосинтеза микроводорослей и высших растений в присутствии ГВ практически не проводились.
Целью настоящей работы являлось изучение особенностей действия ионов хрома, НЧ алмаза и серебра на световые реакции фотосинтеза микроводорослей и высших растений и выявление изменений их устойчивости в присутствии ГВ различного происхождения с использованием современных флуоресцентных методов.
Для достижения поставленной цели решали следующие задачи:
-
Оценить влияние ГВ черноземных почв на световые реакции фотосинтеза микроводоросли Scenedesmus quadricauda.
-
Выявить начальные нарушения фотосинтетического аппарата у микроводорослей Phaeodactylum tricornutum и Scenedesmus quadricauda в присутствии ионов хрома и изменение их устойчивости при добавлении ГВ с использованием параметров флуоресценции.
-
Изучить влияние ДНА на световые реакции фотосинтеза микроводоросли Scenedesmus quadricauda и проростков растений пшеницы Triticum aestivum L в присутствии различных ГВ.
-
Исследовать токсическое действия НЧ серебра на микроводоросли Scenedesmus quadricauda и изменение их устойчивости при разных режимах добавления ГВ.
-
Определить наиболее чувствительные параметры индукции флуоресценции хлорофилла для использования в экологическом мониторинге загрязнений в окружающей среде.
Научная новизна. Впервые, с использованием параметров индукции флуоресценции установлено, что ГВ обладают стимулирующим воздействием на световые реакции фотосинтеза микроводоросли S. quadricauda. ГВ ускоряли электронный транспорт (Eo), стимулировали максимальную фотохимическую эффективность ФС II (Fv/Fm), эффективность кислородвыделяющего комплекса (Fv/Fo) и индекс производительности (PIabs). Установлено влияние ГВ на фотосинтетические мембраны клеток. Гуминовые кислоты (ГК) обладают более выраженным стимулирующим воздействием по сравнению с фульвокислотами (ФК), что, по-видимому, связано с относительной обогащенностью структуры ГК ароматическими фрагментами.
Впервые при одновременной регистрации индукционных кривых быстрой и замедленной флуоресценции, а также редокс-состояния Р700 у морской водоросли P. tricornutum и пресноводной S. quadricauda в присутствии ионов хрома было показано, что одно из первых мест воздействия соединений шестивалентного хрома локализовано на акцепторной части ФС II между переносчиками Qа и Qв. Отмечено влияние на донорную часть ФС II при высоких концентрациях ионов хрома. В присутствии ионов хрома обнаружена активация циклического транспорта электронов. Показано, что токсикологический эффект ионов хрома снижался в присутствии ГВ.
При исследовании влияния НЧ серебра и алмаза на микроводоросли S. quadricauda было обнаружено, что они могут ингибировать эффективность фотосинтеза микроводорослей на акцепторной части ФС II. Это отражено в снижении таких параметров флуоресценции как максимальная фотохимическая эффективность ФС II (Fv/Fm), электронный транспорт (Eo), индекс производительности (PIabs). При исследовании воздействия НЧ серебра, синтезированных с ГВ, наблюдали возрастание токсического эффекта на микроводоросли S. quadricauda. Впервые, выявлено, что ДНА проникают в растения пшеницы Triticum aestivum L. и проявляют токсичность в условиях повышенного освещения, что ведет к уменьшению переноса электрона между акцепторами Qa и Qb и нарушению формирования трансмембранного потенциала. В присутствии ГК наблюдался детоксифицирующий эффект, который в первую очередь определялся изменениями дзета-потенциала ДНА.
Положения диссертации, выносимые на защиту:
- установлено положительное влияние ГВ на световые реакции фотосинтеза
микроводорослей;
определены области начальных нарушений фотосинтетического аппарата в присутствии ионов хрома, НЧ алмаза и серебра;
доказано повышение устойчивости реакции фотосинтеза микроводорослей в присутствии ГК к действию ионов хрома, НЧ алмаза и серебра;
определены параметры индукции флуоресценции хлорофилла, которые могут быть использованы в экологическом мониторинге загрязнений окружающей среды.
Теоретическая и практическая значимость работы. В данной диссертационной работе были изучены особенности действия ионов хрома и современных токсикантов: ДНА и НЧ серебра на световые реакции фотосинтеза фототрофных организмов и защитные свойства ГВ различного происхождения.
Предложен способ оценки влияния ГВ, сочетания ГВ и токсикантов на световые
реакции фотосинтеза микроводорослей и высших растений с использованием
параметров индукции флуоресценции хлорофилла. Установлены наиболее
чувствительные параметры флуоресценции (PIABS, Eo, FV/FO), которые могут быть использованы в экологическом биомониторинге для определения влияния различных токсикантов и ГВ на фотосинтезирующие организмы. Показатель флуоресценции (FО) с успехом может быть использован в биотестировании для оценки влияния токсикантов на ростовые процессы микроводорослей.
Материалы диссертации могут быть внедрены в учебный процесс по дисциплинам - «Экология» и «Охрана окружающей среды и рациональное использование ресурсов».
Полученные результаты использовали в учебном процессе при проведении практикума по экологической биофизике на Звенигородской станции МГУ и большого практикума кафедры биофизики МГУ.
Метод флуоресценции хлорофилла был внедрен в исследования по
биотестированию в лабораторию экотоксикологического анализа почв (ЛЭТАП) на факультете почвоведения МГУ.
Апробация работы. Результаты работы представлены в следующих научных
конференциях: 4-я международная конференция СНГ МГО по гуминовым
инновационным технологиям «От молекулярного анализа гуминовых веществ – к
природоподобным технологиям» (Москва, 2017); II всероссийская научная конференция
молодых ученых «Комплексные исследования Мирового океана» (Москва, 2017);
всероссийская научно-практическая конференция с международным участием
«Морские биологические исследования: достижения и перспективы», приуроченная к
145-летию Севастопольской биологической станции (Севастополь, 2016);
международный симпозиум «Биодиагностика и оценка качества природной среды: подходы, методы, критерии и эталоны сравнения в экотоксикологии» (Москва, 2016); 10-я международная конференция «Углерод: фундаментальные проблемы науки, материаловедение, технология» (Троицк, 2016); 3-й международный симпозиум «Nanomaterials and the Environment» (Moscow, 2016); конференция Математика Компьютер Образование 2016 (Москва, 2016); V съезд биофизиков России (Ростов-на-Дону, 2015).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 работ, в том числе 5 статей в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ и 3 в цитируемых в международных базах данных Scopus, Web of Science, RSCI, а одна из них опубликована в высокорейтинговом журнале.
Исследования выполнялись при поддержке грантов РФФИ: «Поиск границ нормы
для биоиндикационных показателей фитопланктона в многофакторных экспериментах с лабораторными альгоценозами» (№ 15-04-02601), «Метод поиска экологически обоснованных границ классов качества для объективной классификации природных экосистем» (№ 15-04-02129).
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследования и обсуждений, заключения, выводов, списка условных сокращений и обозначений, списка цитируемой литературы. Список литературы включает 275 источников. Работа изложена на 159 страницах машинного текста, содержит 42 рисунка и 11 таблиц.
Природа замедленной флуоресценции хлорофилла растений
Явление замедленной флуоресценции (ЗФ) состоит в том, что после светового возбуждения в фотосинтезирующих клетках наблюдается слабое длительно затухающее красное свечение, испускаемое хлорофиллом (Рубин, 2013). Это свечение возникает уже после прекращения флуоресценции (FО) за счет энергии, выделяемой в ходе темновых реакций первичных фотопродуктов фотосинтеза в реакционном центре. Различие между быстрой и замедленной флуоресценцией связано с природой возбуждения излучающей молекулы хлорофилла. Быстрая флуоресценция связана с процессами дезактивации возбуждения хлорофилла перед разделением зарядов в реакционном центре, тогда как ЗФ возникает после первичного акта фотосинтеза и энергия появляется в результате обратной рекомбинации разделенных зарядов. В процессе быстрой флуоресценции излучается 2–3 % поглощенной энергии, тогда как выход ЗФ составляет только 0,03 % и менее от испускаемой флуоресценции (Маторин, Рубин, 2012).
До сих пор нет общепринятой номенклатуры для описания характеристических точек ЗФ во время индукционного перехода, а также нет и однозначной интерпретации механизмов формирования максимумов на ИК (Гольцев с соавт., 2014). В данной диссертационной работе мы будем придерживаться номенклатуры, предложенной Гольцевым и сотр. (Гольцев с соавт., 2014; Strasser et al., 2004). Максимумы (обозначаемые буквой I) и последующие минимумы (обозначаемые буквой D) пронумерованы (с помощью индекса) согласно времени их появления в индукционной кривой ЗФ (Рисунок 7).
Индукционная кинетика ЗФ представляет собой очень сложную многофазовую временную функцию, проходящую через несколько последовательных максимумов и минимумов и через 2–3 мин освещения светом ФАР достигает стационарного уровня (Гольцев с соавт., 2016). Индукционную кривую ЗФ можно разделить на две кинетические фазы – быструю и медленную. Быстрая фаза начинается подъемом свечения к максимуму I1 и заканчивается минимумом D2 через приблизительно 0,3–0,5 с освещения, после чего начинается медленная фаза изменений ЗФ, которая за несколько минут освещения заканчивается достижением интенсивности ЗФ светового стационарного уровня S. При использовании механического фосфороскопа детальную структуру быстрой фазы можно наблюдать только при использовании быстрых затворов, обеспечивающих быстрое включение возбуждающего света (скорость открывания – быстрее 1 мс), и высокой скорости дигитализации и регистрации сигнала. Быстрая фаза включает два пика I1 и I2 (иногда разделенные минимумом D1 между ними) и заканчивается минимумом D2. При регистрации ИК ЗФ более быстрыми аппаратами с электронным переключением периодов освещения и темноты (например, М-РЕА-2) на начальном фронте нарастания ЗФ можно заметить «плечо», которое, вероятно, отражает слитый с максимумом I1 ранний пик (его можно назвать максимумом I0). При некоторых условиях измерения после достижения минимума D2 интенсивность свечения медленно нарастает, образуя небольшое плечо, которое идентифицируют как максимум I3. С этого момента стартует нарастание ЗФ к максимуму I4, принадлежащему к медленной фазе ИК и последующим промежуточным максимумам I5 и I6, после которых интенсивность ЗФ достигает стационарного уровня S (Strasser et al., 2010).
Типичная индукционная кинетика микросекундной ЗФ листьев фасоли, регистрированная с помощью аппарата М-РЕА-2 при интенсивности возбуждающего света 1000 мкмоль квантов м–2 с–1. Буквами около кривой отмечены характеристические точки - локальные максимумы (буквами Iї … I б) или минимумы (Di, D2) и стационарное состояние световой адаптации (S). В выносках описаны предполагаемые процессы, определяющие изменение интенсивности ЗФ в указанный момент (Гольцев с соавт., 2014). 1.5. Методы измерения флуоресценции хлорофилла
Поглощение энергии при освещении растений возбуждающим светом вызывает фотохимические реакции фотосинтеза и сопровождающую их флуоресценцию хлорофилла в фотосинтетическом аппарате, а непоглощенная часть света отражается от поверхности листа или рассеивается внутренними структурами. Измерение флуоресценции хлорофилла требует ее разделения от рассеянного объектом света. Для измерения флуоресценции хлорофилла используют спектрофлуориметры, у которых принцип измерения основан на эмиссионной спектроскопии. До настоящего времени разработаны ряд методов измерения флуоресценции и широкий спектр флуориметров. Наиболее практичными и часто используемыми методами измерения являются прямая регистрация флуоресценции и модулированная флуоресценция (Маторин, Алексеев, 2013).
Токсическое воздействие наноалмазов детонационного синтеза
В современных условиях значительный интерес представляет исследование токсичности наноматериалов (Голохваст с соавт., 2012; Мамырбаев, 2012; Chang et al., 2008). Одни наноматериалы, благодаря своей физической природе способны индуцировать активные формы кислорода (Kang et al., 2008; Long et al., 2007; Reeves et al., 2008). Другие способны проникать через тканевые барьеры внутрь клеток и взаимодействовать с внутриклеточными компонентами (Kaur et al., 2008). Некоторые типы наноматериалов могут нарушать мембранные структуры, повышая их проницаемость (Hong et al., 2004). В настоящее время большой интерес вызывают углеродные наноматериалы (Долматов, 2011). Благодаря своей низкой химической реактивности и уникальным физическим свойствам, нанодисперсные вещества могут быть полезны в различных биологических приложениях, таких как носители генов или белков; новые технологии визуализации; покрытия для имплантируемых материалов; биосенсоры и медико-биологические нанороботы (Голохваст с соавт., 2012; Шайтан, 2011; Schrand et al., 2007).
Наноалмазы (ДНА) детонационного синтеза являются уникальным наноматериалом, промышленное производство которого исчисляется уже десятками тысяч тонн в год, а практическое применение охватывает такие отрасли индустрии, как машиностроение, транспорт, полимерная и нефтехимия (Hui et al., 2009). Введение ДНА в промышленный оборот неизбежно приводит к выбросу этих синтетических наночастиц в окружающую среду вместе с производственными отходами и случайными потерями. ДНА получают методом химических превращений на фронте детонационной волны при взрыве мощных взрывчатых веществ (смесь тротила и гексогена). В газах, образующихся при детонации ряда взрывчатых веществ, содержится значительное количество свободного углерода, из которых в условиях высоких температур и давлений, достигаемых при взрыве, формируется алмазная фаза углерода. Наноалмаз является самой устойчивой термодинамической формы углерода (Маторин, Алексеев, 2013). ДНА обладают рядом необычных свойств. ДНА могут быть использованы для создания нанокомпозиционных материалов, элементов наноэлектроники, селективных адсорбентов и катализаторов, объектов медико биологического использования. Применение ДНА улучшает качество микроабразивных и полировальных составов, смазочных масел, абразивных инструментов, полимерных композиций, резин и каучуков, систем магнитной записи, позволяет выращивать алмазные пленки на различных подножках. Существует множество работ по исследованию физических свойств ДНА (Kato et al., 2011; Sakurai et al., 2006; Volkov et al., 2012, 2014; Voznyakovskii et al., 2012), химического состава ДНА (Schmidlin et al., 2012), спектральной реакции ДНА (Vul et al., 2011), морфологии детонации ДНА (Turner et al., 2009), модификации поверхности ДНА путем присоединения различных биомолекул (Perevedentseva et al., 2013), использование ДНА в качестве антибактериальных агентов (Wehling et al., 2014).
За счет своих нанометровых размеров, кристаллиты ДНА имеют колоссальную удельную площадь поверхности (отношение числа атом на поверхности вещества к числу атомов в его объеме). Поверхность кристаллов всегда дефектна за счет методики производства и очистки, ее структура отлична от алмазной, а поверхностные атомы имеют нескомпенсированные связи, что приводит к сверхвысокой поверхностной активности ДНА. Именно благодаря этому свойству ДНА обладают уникальной сорбционной способностью и могут с успехом быть использованы не только в технике и производстве, но и как эффективное средство по борьбе с раковыми клетками. Ученые экспериментально исследовали влияние ДНА на живые клетки и показали, что ДНА действительно могут служить поставщиками лекарственных препаратов к здоровым клеткам, или же ядовитых веществ, в случае с клетками раковых опухолей. Кроме того, имеются данные о биологической активности ДНА. Было показано, что ДНА относятся к противораковым препаратам. В последние годы возрос интерес к исследованиям по созданию новых технологий для решения прикладных задач в области биологии, белковой химии, биофизики, молекулярной биологии, экологии (Dworak et al., 2014). Например, представляется перспективным создание различных индикаторных систем регистрации, основанных на применении белковых молекул, обладающих маркерными свойствами. Имеется достаточно много работ по применению ДНА в биомедицине качестве клеточных биомаркеров (Fu et al., 2007; Liu et al., 2007; McGuinness et al., 2011; Perevedentseva et al., 2010; Zhang et al., 2012).
Важное свойство ДНА относится к их способности образовывать комплексы с биомолекулами, например, с биоконъюгатами (Hens et al., 2008). Высокая совместимость ДНА позволяет белкам (Hаrtl et al., 2004) и нуклеиновым кислотам (Hamers et al., 2005; Yang et al., 2009) ковалентно (Dahoumane et al., 2009) и нековалентно (Huang, Chang, 2004; Kong et al., 2005) связываться с пленками модифицированных ДНА, где их активность остается без изменений. Учитывая электрические свойства ДНА, это делает возможным использование наноалмазных пленок в создании биодатчиков (Rubio-Retama et al., 2006). Сейчас, прототипы биосенсоров ДНА создаются на основе ДНК (Smirnov et al., 2010; Yang et al., 2009); бактериальной люциферазы (Purtov et al., 2008). Свойство ДНА к физической абсорбции с биомолекулами позволяет использовать их в клинической протеомике как эффективные твердофазные экстрагенты (Kong et al., 2005). Еще одним перспективным направлением использования ДНА является их применение в качестве маркеров, на наличие дефектов кристаллической решетки ДНА (Barnard et al., 2009; Chang et al., 2010; Hui et al., 2010; Vaijayanthimala et al., 2009), или для их создания путем бомбардировки термической обработки в вакууме (Tisler et al., 2009; Wee et al., 2009). Эти дефекты ДНА обнаруживают при помощи флуоресценции (Smith et al., 2009). Наряду с физическими, химическими методами были разработаны люминесцентные ДНА путем модификации их поверхности с органическими веществами (Zhang et al., 2011). Без такой химической или физической модификации ДНА практически нефлуоресцируют, что повышает селективность (Volkov et al., 2012). Вещества, содержащие ДНА, попадают в окружающую среду и поэтому ДНА могут привести к различным последствиям (Klaine et al., 2008; Lead, Wilkinson, 2006). Поэтому важно определить возможные опасности ДНА для человека и других биологических систем (Schrand et al., 2007). Существуют работы по токсичному влиянию ДНА на человека, например, в работе на лимфоцитах (Dworak et al., 2014) было обнаружено, что ДНА были цитотоксичными, ингибировали пролиферацию клеток и индуцировали апоптотическую смерть клеток; ДНА вызывали воспалительные реакции в легких человека (Silbajoris et al., 2009) и оказывали токсическое воздействие на липосомы (Wang, Liu, 2013).
ДНА вызывали высокую токсичность на эмбрионы Xenopus (Marcon et al., 2010) и макрофагов (Thomas et al., 2012), ингибировали рост и развитие растений Parodia ayopayana (Basiuk et al., 2013) и морских светящихся бактерий P. phosphoreum (Mogilnaya et al., 2010). Эксперименты с Daphnia magna показали, что ДНА ведут к снижению размножения и нарушению пищеварительного тракта при малых концентрациях и при высоких – к обездвиживанию и смерти (Mendonc et al., 2011; Tao et al., 2009). В другой работе с Daphnia magna показано, что ДНА имеют низкую химическую реакционную способность и хорошую биосовместимость и нецитотоксичны в концентрациях до 100 мг/л (Zhu et al., 2010). Имеются некоторые работы, где токсичность ДНА не была доказана: в работе с червями Caenorhabditis elegans (Mohan et al., 2010) и с клетками человека (Schrand et al., 2007).
Оценка влияния гуминовых веществ на световые реакции фотосинтеза зеленых микроводорослей Scenedesmus quadricauda
Гуминовые вещества (ГВ) играют важную роль в экологическом равновесии природы. ГВ выполняют ряд важных экологических функций в биосфере: аккумулятивную, транспортную, регуляторную, физиологическую и защитную. В настоящее время опубликовано множество работ о проявлении ГВ адаптогенных свойств по отношению к растениям, находящимся в условиях разнообразных абиотических физико-химических стрессов: неблагоприятных значениях кислотности среды, повышенных и пониженных температурах, засухе, переувлажнении, избыточном или недостаточном минеральном питании и др. (Kulikova et al., 2005; Zhang et al., 2006). Существует гипотеза, что физиологическая активность ГВ повышается в присутствии стрессовых факторов, т.е. эффективнее проявляется в экстремальных условиях. Имеется достаточное количество работ подтверждающие данную гипотезу. Есть сведения, что ГВ могут положительно влиять на рост и развитие растений (всхожесть семян, длина корней проростков и т.д.). Существуют данные о прямых и косвенных положительных воздействиях ГВ на рост и развитие фотосинтезирующих организмов путем воздействия на клеточные мембраны, которые приводят к повышению транспорту минералов, повышению синтеза белка, активности гормонов растений, стимулированию фотосинтеза, модифицированию активности ферментов, растворению микроэлементов и макроэлементов, сокращение активных уровней токсичных минералов и увеличению микробных популяций (Seyedbagheri et al., 2010).
Однако исследования по влиянию ГВ на световые реакции фотосинтеза микроводорослей еще не проводились. Поэтому впервые была проведена оценка влияния ГВ на световые кривые флуоресценции микроводоросли Scenedesmus quadricauda с использованием параметров флуоресценции (формулы представлены в Материалах и методах). В данной работе были использованы несколько видов ГВ. Для изучения влияния ГВ на параметры световых кривых были выбраны ГК и ФК черноземных почв. Препараты гуминовых кислот (ГК) и фульвокислот (ФК), выделены из чернозема в Курской области. Все образцы ГВ были любезно предоставлены координатором российского отделения Международного Гуминового сообщества (IHSS, США), проф. И. В. Перминовой. Влияние ГВ на скорость роста микроводоросли S. quadricauda оценивали по изменению параметра флуоресценции (FO). Параметр FO связан с обилием клеток микроводорослей (Маторин, Рубин, 2012). Обнаружено, что ГВ черноземных почв в нормальных условиях обладали слабовыраженным стимулирующим воздействием на рост микроводоросли S. quadricauda (Рисунок 19). Данное утверждение отражено во многих литературных источниках (Куликова, 2008).
Изменения в функционировании фотосинтетического аппарата при действии ГВ исследовали с помощью световых зависимостей параметров флуоресценции (Рисунок 20). При определении относительной скорости нециклического электронного транспорта (ETR), рассчитанной по параметрам флуоресценции, обнаружили, что внесение ГВ приводит к увеличению скорости фотосинтетического электронного транспорта (Рисунок 20). При этом ГК черноземных почв в большей степени стимулировали электронный транспорт по сравнению с ФК. Также установлено, что ГК влияют на состояние фотосинтетических мембран, что привело к увеличению нефотохимического тушения флуоресценции (NPQ), отражающего изменение электрохимического протонного градиента на мембране (Рисунок 20 Б). Параметр NPQ включает: самый быстрый компонент, который отражает энергизационное тушение (qE), которое связано с накоплением протонов внутри тилакоидов (закисление внутритилакоидной среды), сопряженным с фотосинтетическим транспортом электронов (Shreiber, 2004). Градиент концентрации протонов между внутренней и наружной средой тилакоидов используется протонной АТФ-синтетазой мембран хлоропластов для синтеза АТФ, используемой в реакциях восстановления углерода. Его амплитуда и кинетика релаксации служат важными показателями функционального состояния хлоропластов. Более медленный процесс релаксации тушения (qT) отражает переходы между состояниями мембран хлоропластов в результате миграции светособирающих хлорофилл-белковых комплексов между ФС I и ФС II, которые связаны с фосфорилированием светособирающих хлорофилл-белковых комплексов и регулируют баланс распределения энергии поглощенного света между ФС I и ФС II. Кроме того, высокие значения градиента Н+ на фотосинтетической мембране при действии света высокой интенсивности приводят к ферментативной перестройке каротиноидов ксантофиллового цикла, тушащих избыточное состояние хлорофилла антенного комплекса. Наконец, самый медленный процесс релаксации связан с восстановлением от тушения, обусловленного фотоингибированием реакционных центров ФС II (qI). В нашем эксперименте ФК практически не оказывали воздействие на состояние фотосинтетических мембран. Предположение о возможном влиянии ГК на мембраны клеток ранее высказывались в литературе (Garcia et al., 2016; Gholami et al., 2013; Olaetxea et al., 2016; Seyedbagheri et al., 2010).
Детальное исследование воздействия ГВ на световые реакции фотосинтеза было проведено при регистрации индукционных кривых флуоресценции в миллисекундном интервале времени. Индукционные кривые представляют собой увеличение интенсивности флуоресценции после включения действующего света, отражающее постепенное восстановление переносчиков электронов между двумя ФС. Измерение флуоресценции на разных фазах кривой позволяет судить о протекании различных стадий фотосинтеза (Strasser et al., 2004). В таблице 2 приведены параметры, рассчитанные из индукционных кривых флуоресценции хлорофилла клеток микроводоросли S. quadricauda в присутствии ГВ.
При действии ГК снизилось количество реакционных центров ФС II с низкой скоростью восстановления вторичного акцептора QB (участок, связывающий пластохинон). Это отражено в уменьшении коэффициента VJ. При изучении параметра VI, являющимся индикатором состояния редокс-состояния пула пластохинона в темноте, обнаружили, что ГВ не влияли на наличие окисленных молекул пластохинона сайта QB.
Обобщающий параметр PIABS в присутствии ГК увеличивался вдвое, что говорит о степени увеличения функциональной активности ФС II в 2 раза. Это происходит из-за повышения доли активных РЦ и снижение тушения возбужденных состояний в антенне. Повышение доли активных РЦ приводит к уменьшению размера антенны (ABS/RC). Увеличение активных РЦ и квантовой эффективности переноса электронов от QA- (Eo) приводит к снижению нефотохимических потерь (DIO/RC). Увеличение параметра FV/FO до 35 % в присутствии ГК и на 9 % в присутствии ФК, говорит о стимулирующем воздействии ГВ на эффективность расщепления воды в кислоровыделяющем комплексе. В литературных источниках имеются данные, что ГВ могут способствовать дыханию и процессам фотосинтеза путем модифицирования функционирования митохондрий и хлоропластов (Orlov et al., 2005). Исследование параметров индукционных кривых флуоресценции подтверждают тот факт, что ГВ могут оказывать стимулирующее влияние на функционирование фотосинтетического аппарата микроводоросли S. quadricauda.
Влияние наночастиц серебра на микроводоросли Scenedesmus quadricauda и изменение их устойчивости при разных режимах добавления гуминовых веществ
В последнее десятилетие из-за противомикробных и других уникальных физико-химических свойств (каталитическая активность, специфические электронные свойства) все шире используются наночастицы (НЧ) серебра (Batista et al., 2017). Они используются в производстве тканей, воздушных фильтров, косметических средств. Появилось большое количество серебросодержащих медицинских препаратов, которые обладают антимикробными свойствами благодаря наличию в них ионов серебра (Тодоренко, 2017; Doody et al., 2016). Рост производства НЧ серебра приводит к тому, что все больше НЧ попадает в пресные воды, где они могут быть токсичными для водной экосистемы и приводить к нарушению различных экологических процессов (Conine et al., 2016; Hong et al., 2016; Yang et al, 2014). Хотя НЧ серебра высокотоксичны для водных организмов, пока нет единого мнения о том, чем обусловлена данная токсичность: исключительно выделяемыми ионами серебра или же активными формами кислорода (Juganson et al., 2017).
Нами были проведены исследования по влиянию НЧ серебра в четырех различных концентрациях на параметры быстрой флуоресценции зеленых микроводорослей Scenedesmus quadricauda. Для проведения количественного анализа характеристик первичных процессов фотосинтеза на основе параметров кинетической кривой OJIP использовали “JIP-тест” (Рисунок 41), параметры которого описаны в разделе “Материалы и методы”. Уже через 3 часа инкубации наблюдалось уменьшение активности фотосинтеза микроводоросли при концентрации НЧ серебра 10 мг/л. После суточной инкубации ингибирование проявлялось при концентрации 0,1 мг/л.
Было обнаружено, что НЧ серебра имеют несколько сайтов воздействия на процессы фотосинтеза микроводорослей S. quadricauda. Во – первых, НЧ серебра воздействует на акцепторную часть ФС II, о чем свидетельствует увеличение параметра VJ, при максимальной концентрации (10 мг/л) НЧ серебра. Накопление QB-невосстанавливающихся центров приводило к снижению эффективности (Eo) и вероятности (o) транспорта электронов ФС II.
Во – вторых, НЧ серебра воздействует на донорную часть ФС II. Это подтверждает снижение параметра FV/FO, отвечающего за эффективность кислород-выделяющего комплекса (Таблица 10). При воздействии НЧ серебра на микроводоросли S. quadricauda относительная переменная флуоресценция J-фазы (Рисунок 41) VJ увеличилась с 0,144 до 0,377 (Таблица 10), что указывает на увеличение доли QB-невосстанавливающихся РЦ от ФС II. Фаза JI (3-30 мс) соответствует редукции пула РQ, где VI является индикатором состояния редокс-состояния пула PQ в темноте (Stirbet et al., 2014). Было обнаружено, что НЧ серебра снижают данный параметр, при максимальной концентрации 10 мг/л, т.е. влияют на наличие окисленных молекул PQ сайта QB.
Наиболее чувствительным параметром оказался индекс производительности PIABS. Наблюдалось снижение значения данного параметра у микроводорослей Scenedesmus quadricauda, обработанные НЧ серебра. Низкие показатели параметра PIABS указывают на низкую функциональную активность ФС II (Таблица 10). Это происходит из-за снижения доли активных РЦ, что приводит к увеличению размера антенны (ABS/RC) и повышению тушения возбужденных состояний в антенне. Уменьшение эффективности передачи энергии возбуждения со светособирающего комплекса на РЦ сопровождается увеличением рассеивания неиспользуемой световой энергии (DIО/RC). Достоверное снижение эффективности фотосинтеза FV/FM (Таблица 10) наблюдалось при максимальной концентрации НЧ серебра 10 мг/л.
Таким образом, полученные данные показали, что НЧ серебра могут сильно ингибировать эффективность фотосинтеза FV/FM микроводорослей S. quadricauda при высоких концентрациях. Анализ индукционных кривых показал, что НЧ серебра воздействуют на акцепторную и донорную часть ФС II (FV/FO, Eo). Уменьшение квантового выхода электронного транспорта в ФС II приводило к ингибированию функциональной активности ФС II (PIABS) во всем диапазоне концентраций НЧ серебра.
В настоящее время ведется поиск новых агрохимикатов на основе синтеза ГВ с различными НЧ. Поэтому на химическом факультете МГУ, под руководством Перминовой И.В. впервые был реализован синтез НЧ серебра в среде ГВ. Нами был проведен сравнительный анализ параметров флуоресценции микроводорослей при добавлении НЧ серебра; НЧ серебра с добавлением ГВ и НЧ серебра, синтезированные с ГВ. Установлено, что НЧ серебра при суточном контакте с микроводорослями нарушают реакции фотосинтеза, что выражается в снижении параметра FV/FM (Таблица 11). При добавлении ГВ к НЧ серебра наблюдали детоксифицирующий эффект, параметр FV/FM, а также другие параметры приближались к значению контроля (Таблица 11). В тоже время у НЧ серебра, синтезированные с ГВ наблюдается резкое ингибирование реакции фотосинтеза. Максимальное ингибирующее воздействие функциональной активности ФС II наблюдалось у НЧ серебра, синтезированные с ГВ по параметру PIABS.
Возможно, высокий токсический эффект НЧ серебра, синтезированные с ГВ, связан с формирование поверхностного слоя ГВ на НЧ серебра. Это может способствовать улучшению сорбции НЧ на поверхности водорослевой клетки. Также причиной может послужить разрушение системы сконденсированных ароматических колец, в результате синтеза НЧ серебра, отвечающих за связывание токсикантов.