Введение к работе
Актуальность работы. Оценка риска попадания трансгенных микроорганизмов (ТМ) в природные экосистемы является необходимым этапом протокола, предваряющим работу с трансгенными штаммами (Cartagena Protocol on Biosafety, 2001). Опасность нарушения естественного микробного биоразнообразия обусловлена использованием ТМ для решения экологических, сельскохозяйственных, промышленных и медицинских проблем, что предполагает возможность неконтролируемого распространения рекомбинантных ДНК. На современном этапе прогнозное изучение последствий интродукции ТМ в окружающую среду (распространения ТМ и их генетического материала) невозможно без предварительного проведения экспериментов в микрокосмах, поскольку эксперименты в открытых системах запрещены. Эксперименты подобного рода позволяют получать прогнозные оценки наиболее вероятного поведения интродуцируемых бактерий в сложных системах, в том числе в сообществе природных микроорганизмов.
Рекомбинантные штаммы на основе Escherichia coli широко используются в научных исследованиях и биотехнологии. Созданные на ее основе трансгенные штаммы являются традиционными объектами генной инженерии, которые используются для получения целевых продуктов (Kurokawa et al., 2001; Bechor et al., 2002; Schultz et.al., 2005). Наряду с распространенным мнением, что К coli не должны выживать в природных условиях с низким содержанием питательных веществ, имеются многочисленные данные об их присутствии в водных экосистемах (Espinosa-Urgel, 1998, Koch, 2001; Kussell et al., 2005). При этом практически отсутствует информация о возможном выживании и изменении свойств трансгенных штаммов, сконструированных на основе Е. coli, при их интродукции в природные экосистемы.
Общепринятой методологии проведения прогнозных исследований экологических характеристик ТМ до настоящего времени не существует. Такие исследования очень трудоемки из-за отсутствия возможности постоянного контроля экспрессии клонированных генов у интродуцируемьк штаммов. Поэтому для мониторинга ТМ в микрокосмах и пилотных установках все шире используют репор-терные генетические системы. Гены биолюминесценции, клонированные в плаз-мидах, во многих случаях являются удобной маркерной системой для мониторинга ТМ (VanElsas et al., 1998, Sayler, 2001; Bunker et al, 2004; Schultz et al., 2005).
Цель данной работы состояла в изучении выживаемости, динамики численности и гетерогенности популяции трансгенного штамма Escherichia coli Z905/pPHL7 с клонированными генами биолюминесцентной системы после интродукции в водные микрокосмы.
Основные задачи исследования:
-
Оценить способность к выживанию трансгенного штамма E.coli Z905/pPHL7 (/icCDABE,ampR) после интродукции в пресноводные микрокосмы.
-
Изучить гетерогенность популяции Е. coli Z905/pPHL7 после интродукции в водные микрокосмы с различной трофической структурой.
3. Провести анализ стабильности сохранения рекомбинантной плазмиды
pPHL7 и границ изменения экспрессии плазмидных генов биолюминесценции и
устойчивости к ампициллину. ___________
ТОС НАЦМвНАПЬНАи
БИБЛИОТЕКА !
! si$"J6$\
Личный вклад соискателя. Все экспериментальные данные, представленные в диссертации, получены лично Каргатовой Т.В. в лаборатории Управления биосинтезом гетеротрофов Института биофизики СО РАН. Лично автором проводились отбор и анализ проб, высевы микрофлоры, подсчет численности, анализ морфофизиологических свойств гетеротрофных бактерий, их идентификация, проведение самого процесса интродукции, выделение изолятов интродуцированного штамма и анализ их свойств. Анализ и обобщение полученных результатов проводились в ООО «ТОРИНС». Изучение характеристик рекомбинантной плазмиды изолятов из микрокосмов осуществлялось на базе ГНЦ «Вектор» (Новосибирск).
Благодарности. Автор выражает глубокую признательность научному руководителю к. б. н. Л.Ю. Поповой за поддержку, постоянное и внимательное отношение к работе, Д.6.Н., профессору Н.С. Печуркину за ценные замечания и помощь в осмыслении результатов исследований, д.б.н. Белявской В.А. за помощь в проведении анализов плазмидных ДНК выделенных изолятов, а также сотрудникам ИБФ д.б.н. Брилькову А.В., к.б.н. Ганусовой Е.Е., к.б.н. Бояндину А.Н., к.бл. Лобовой ТЛ, Крыловой Т.Ю., к.б.н. Могильной О.А. за многолетнюю дружескую поддержку и помощь в проведении исследований, а также сотрудникам ООО «Территориально Ориентированные Информационные Системы», проявивших интерес к моей работе, за всестороннюю поддержку.
Научная новизна работы. Впервые проведены эксперименты по изучению последствий интродукции трансгенного штамма в водные микрокосмы разной сложности. Показано, что независимо от структуры микрокосма трансгенный штамм К coli Z905/pPHL7 (Ap'Lux4) длительно сохраняется в сообществе аборигенных микроорганизмов. В результате обобщения данных проведенных экспериментов установлено, что после интродукции в водные микрокосмы в популяции ТМ Е. coli Z905/pPHL7 (AprLux+) проявляется гетерогенность как морфофизиологических характеристик, так и экспрессии плазмидных генов. Визуальное отсутствие экспрессии биолюминесценции у выделенных изолятов не являлось свидетельством потери рекомбинантной плазмиды, что подтверждалось электрофорети-ческим анализом. При периодическом культивировании слабосветящихся клеток К coli Z905/pPHL7, выделенных из микрокосмов, на среде с повышенными концентрациями ампициллина (более 200 мкг/мл) люминесцентный сигнал увеличивался, что позволяло регистрировать его с помощью биолюминометра.
Практическое значение. Впервые исследована гетерогенность трансгенного штамма Е. coli Z905/pPHL7 (Ap'Lux*) после интродукции в модельные микрокосмы. Предложен метод эффективного скрининга клеток, содержащих плазмиду pPHL7, при их низкой численности в бактериальном сообществе и сниженном уровне экспрессии плазмидных генов. Показано, что в накопительной культуре плазмидсодержащих клеток с добавлением высоких концентраций ампициллина (более 200 мкг/мл) происходит увеличение люминесцентного сигнала и подавление роста аборигенной микрофлоры, не имеющей плазмидных детерминант устойчивости к антибиотику. Результаты работы являются частью макета экологического паспорта на ТМ Е. coli Z905/pPHL7, который включен в в достижения РАН в 2000 г (в раздел микробиология) в 2001 г (в раздел биотехнология). Описание экологических характеристик вариантов, трансгенного штамма Е. coli Z905/pPHL7,
выделенных из микрокосмов, включено в состав электронной коллекции природных и трансгенных светящихся микроорганизмов "Biolumbase".
Результаты работы включены в отчеты по грантам РФФИ №94-04-11189, №97-04-49988, №00-07-90111, №01-05-64615, №02-05-64096, №04-05-64188; КФН (гранты №1F0186, №5F0025, №4F0200, №8F0006, №10F195M; ФЦП «Интеграция» №162, проекта СО РАН «Интеграция» №25 и является частью исследований, проводимых по теме: «Биофизические основы функционирования природных экосистем (мониторинг, эксперименты, модели)» (индекс приоритетного направления 4.1.5,4.2.1, номер госрегистрации 01.960004916).
Положения, выносимые на защиту.
-
Трансгенный штамм Е. coli Z905/pPHL7 после интродукции в различные водные микрокосмы со сложной организацией не элиминируется из микробоцено-зов в течение длительного времени.
-
После интродукции ТМ Е. coli Z905/pPHL7 уровень экспрессии плазмид-ных генов значительно снижается. Во всех изученных микрокосмах отсутствует визуальное проявление люминесценции при сохранении рекомбинантяой плазми-ды.
-
Использование метода накопительных культур бактериальных клеток, несущих плазмиду pPHL7 в селективной среде с высокими концентрациями ампициллина (более 200 мкг/мл) облегчает мониторинг плазмидсодержащих клеток при их низкой численности в микробных сообществах.
Апробация работы. Результаты исследований были представлены на Всероссийской конференции '"Интродукция микроорганизмов в окружающую среду" (Москва, 1994), VT и VII Международной конференции "Новые направления в биотехнологии" (Москва, 1996, 1998), Ассамблеях COSPAR (31 - Бирмингем, 1996; 33 - Варшава, Польша, 2000; 34 - Хьюстон, 2002; 35 - Париж, 2004), Республиканской конференции "Региональное природопользование и экологический мониторинг" (Барнаул, 1996), Международной конференции "Микробное разнообразие" ICEP (Пермь, 1996, 1998, Волгоград-Пермь, 2001), Международной конференции "Современные концепции эволюционной генетики" (Новосибирск, 1997), Международной конференции "Проблемы загрязнения окружающей среды" (Москва, 1998), VII Экологическом Конгрессе INTECOL (Флоренция, Италия, 1998), Международной конференции по биоразнообразию BDENE (Новосибирск, Россия, 2000,2001), Международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2002), конференции молодых ученых «Современные проблемы микробиологии, экологии и иммунологии» (Пермь, 2002), Международном Байкальском симпозиуме по микробиологии IBSM-2003 (Иркутск, 2003), Международной конференции по измерениям, моделированию и информационным системам для изучения окружающей среды (Томск, 2004), Международной конференции по вычислительно-информационным технологиям для наук об окружающей среде (Новосибирск. 2005).
Публикации и личный вклад автора. По материалам диссертации опубликовано 47 научных работ, из них 16 статей в центральных и зарубежных журналах. Экспериментальные данные получены автором как самостоятельно, так и в совместных экспериментах. Основные результаты диссертации вошли в целый ряд
обзорных статей по изучаемой проблеме. Результаты, представленные в диссертации, защищаются впервые.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, пяти глав, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 144 страницах, содержит 32 рисунка, 19 таблиц. Список литературы включает 251 источник, в том числе 207 в иностранных журналах.
