Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8
1.1 Экология города 8
1.1.1 Экологические функции газонов 9
1.1.2 Состояние газонов в городах 10
1.2. Действие тяжелых металлов на растения 11
1.2.1 Влияние тяжелых металлов на рост и развитие растений 11
1.2.2. Действие тяжелых металлов на клетки растений 18
1.2.3. Устойчивость растений к тяжёлым металлам (ТМ) 23
1.3. Влияние засоления на растения., 29
1.4. Клеточная селекция 36
1.4.1. Клеточная селекция на устойчивость к засолению 36
1.4.2. Клеточная селекция на устойчивость к тяжелым металлам 43
Глава 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 47
Глава 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 52
3.1. Экологическая экспертиза противогололёдных материалов (ПГМ) 52
3.1.1. Испытание фитотоксичности ПГМ в фазе вегетативного роста растений
при внесении водных растворов реагентов в почву 57
3.2. Разработка условий получения и культивирования каллуса и регенерации Ф растений 59
3.3. Получение газонных трав, толерантных к засолению 62
3.3.1. Определение чувствительности культивируемых тканей и растений к NaCl 62
3.3.2. Получение солеустойчивьгх клеточных клонов и растений 67
3.3.3. Характеристика растений-регенерантов 71
3.3.4. Проверка наследования признака солеустойчивости 74
3.3.5. Проверка устойчивости к бишофиту растений, толерантных к NaCl .80
3.4. Получение растений, толерантных к ионам меди 83
3.4.1. Определение чувствительности культивируемых тканей и растений к меди 83
3.4.2. Отбор и характеристика толерантных к меди растений 88
3.5. Эффективность клеточной селекции 93
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 95
ВЫВОДЫ 97
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 99
- Клеточная селекция на устойчивость к засолению
- Экологическая экспертиза противогололёдных материалов (ПГМ)
- Проверка устойчивости к бишофиту растений, толерантных к NaCl
Введение к работе
Один из важнейших элементов озеленения городов - создание газонов различного назначения. Их роль в условиях нарушенной экологии городов непрерывно растет. Газоны имеют не только декоративное значение, но и выполняют огромную экологическую, санитарно-гигиеническую роль, оздоравливают окружающую среду, защищают почву от водной и ветровой эрозии, а город от пылевых образований. Газоны оказьшают успокаивающее действие на человека, снимают усталость.
Газоны, расположенные в городе, постоянно испытывают действие техногенных и антропогенных факторов. Среди техногенных факторов наибольшую опасность представляют соли тяжелых металлов.
В последние годы из-за использования противогололедных смесей в почвы весной наряду с тяжелыми металлами в значительном количестве поступают соли. Это приводит к неблагоприятному для роста и развития растений изменению химических и физико-химических свойств почвы. Хпоридный ион, составляющий 50% используемых противогололедных смесей, один из самых агрессивных компонентов городских почв. Весной около многих автомагистралей и на улицах города засоление почв достигает среднего и сильного значения от 0,4 до 1% (Шевякова и др., 1997, 2000). Такое засоление является пределом для нормального роста и развития большинства видов древесно-кустарниковых растений и газонных трав. В Москве гибель более половины деревьев вызвана ненормированным применением противогололедных средств. Характерное действие
загрязняющих веществ на городские газоны - «краевой эффект», состоящий в образовании не покрытых растительностью участков придорожных газонов вдоль проезжей части.
Данные экологические проблемы решаются неэффективно, погибшие от засоления виды растений заменяются теми же видами, которые ждет та же участь. Решение данной проблемы - создание растений, устойчивых к неблагоприятным факторам мегаполиса и жесткий контроль за экологической обстановкой города.
Для получения растений, устойчивых к загрязнениям почвы, наряду с традиционными методами селекции перспективно использовать современные биотехнологические подходы, которые уже хорошо зарекомендовали себя при получении растений, толерантных к различным экологическим стрессовым факторам: засухе, засолению, низким и высоким температурам и др. В настоящее время получены клеточные линии, устойчивые к некоторым тяжелым металлам( Гончарук и др., 2001), однако регенерация из них фертильных растений остается серьезной проблемой. Получены клеточные линии перца и кукурузы, устойчивые к осмотическому стрессу (Diaz, 1994, Долгих и др., 1994) растения устойчивые к засолению( Ларина, 1995, Белянская и др., 1995). Информации о получении клеточных линий и растений, устойчивых к промораживанию, низким и высоким температурам мало, больших успехов добиться не удалось.
Среди первых работ на устойчивость к замораживанию была работа И.И.Туманова (1977) каллусную ткань Picea abies сначала закаливали
охлаждением, а затем замораживали. Были получены устойчивые клеточные линии, однако получить растения не удалось. Получены клеточные культуры картофеля, устойчивые к морозу, однако растения оказались стерильными (Swaaij, 1986). Получены каллусные культуры кукурузы , толерантные к низким температурам (устное сообщение, Долгих, 1996), единственное сообщение о получении с помощью культуры клеток жароустойчивых растений сделано на кукурузе (Дрлгихидр,, 1994).
Цель и задачи исследования
Целью нашей работы было получение с помощью методов биотехнологии газонных трав, толерантных к засолению и солям меди.
Для достижения поставленной цели были поставлены следующие задачи:
-на основании изучения литературы по загрязнению почв мегаполисов определить диапазоны концентраций хлорида натрия и ионов меди в почве;
-провести оценку фитотоксичности ряда противогололедных реагентов, предложенных для использования в городе Москве;
-на примере 2 практически важных видов газонных трав оптимизировать условия культивирования каллусных культур овсяницы и полевицы и регенерации растений;
- разработать условия клеточной селекции для отбора устойчивых к хлориду натрия и солям меди каллусных линий газонных трав;
- из отобранных каллусных линий, толерантных к хлориду натрия и солям меди, получить растения-регенеранты, устойчивые к этим токсикантам;
-проверить сохранение признаков солеустойчивости и толерантности к меди в следующих поколениях вьщеленных регенератов.
Клеточная селекция на устойчивость к засолению
Применение клеточной селекции базируется в основном на двух особенностях культивируемых клеток: высокой степени генетической изменчивости клеток in vitro (Шамина, 1987) и тотипотентности (Бутенко, 1967).
Традиционная селекция растений, направленная на повышение устойчивости к стрессам, основана на гибридизации высокоурожайных форм с растениями донорами устойчивости. Чаще всего используют дикорастущие родственные виды или местные расы и сорта. Урожайность гибридов, как правило, снижается. У декоративных растений при гибридизации с устойчивыми дикорастущими видами происходит снижение декоративных качеств. Для создания сорта сочетающего устойчивость с другими полезными признаками, требуется несколько лет возвратных скрещиваний на культурную форму с постоянным контролем сохранения устойчивости. Это довольно долго и трудно. При использовании культивируемых клеток за счет значительного повышения генетического разнообразия в условиях in vitro можно отобрать устойчивые формы без применения отдаленной гибридизации. Это позволяет значительно ускорить процесс создания нового сорта.
В культуре клеток in vitro в селективных системах можно моделировать стресс, которому подвергаются растения in vivo. Селективные агенты добавляют в питательную среду в дозах, подавляющих рост большинства клеток. Селективное преимущество получают клетки, адаптировавшиеся к данному стрессу. Затем из отобранных устойчивых клеток получают регенеранты. Растения проверяют на устойчивость к стрессовому фактору, т,к. часть изменений возникших в условиях in vitro реализуется только на клеточном уровне, но не на уровне растений. Поэтому, устойчивость клеточных культур и целых растений может не совпадать.
Работы по изучению влияния соли на культивируемые клетки проведены в большом количестве, например на кукурузе (Долгих и др., 1994), пшенице (Серазетдинова и др, 2000) и других видах. Во всех работах отмечалось ингибирование накопления сырой и сухой массы при росте на средах с высокими концентрациями солей (Ketchmn et al., 1991). У клеток пшеницы сильное ингибирование биомассы происходило, начиная с 0,5% NaCl (Серазетдинова и др, 2000).
Для большинства клеток летальные концентрации соли колеблются от 1 до 2,5%.Для каллусных тканей табака летальная концентрация соли- 1%, риса- 2%, свеклы- 2,5% (Белянская и др., 1995; Губанова, 2000). При засолении у неадаптированных клеток наблюдаются нарушения накопления и использования запасных веществ. При микроскопическом изучении клеток, культивируемых в условиях засоления, наблюдается ранняя вакуолизация с образованием «пенящейся» цитоплазмы.
Возможность повышения солеустойчивости растительных тканей, с помощью метода клеточной селекции, показана для люцерны (Croughan, 1978), ячменя (Тонкий и др., 1992), кукурузы (Долгих, и др., 1994; Lupotto,1994), пшеницы (Zheg Qi-Chenyetal, 1993) и других видов растений. Для получения солеустойчивых клонов и растений используют разные схемы клеточной селекции. В большинстве случаев в качестве селективных агентов используют хлорид натрия. Помимо хлористого натрия в клеточной селекции на солеустойчивость применяют осмотически активные вещества и токсичные аналоги пролина.
Существует два варианта клеточной селекции: первый - когда клетки в течение длительного времени культивируют на сублетальных концентрациях стрессового фактора (Шамина, 1987), и второй -многоступенчатый: когда уровень стрессового фактора возрастает на каждом последующем этапе культивирования (Долгих и др. ,1994, Ларина 1995). Оба метода дают положительные результаты.
Путем прямой одноступенчатой селекции были получены каллусные линии манго: отбор на среде с NaCl велся в течение одного пассажа, затем 3 пассажа в неселективных условиях, и снова на соль (Kumar, Sharma,1989). Солеустойчивые клеточные культуры сахарной свеклы были получены при селекции на среде с 1,5% хлорида натрия в течение 3 пассажей. Для проверки стабильности признака клетки культивировали на протяжении трех циклов выращивания на среде без соли, а потом снова проверяли в селективных условиях (Губанова и др., 2000). Следует отметить, что при попеременном культивировании в селективных и неселективных условиях может наблюдаться гибель солеустойчивых клеток, перестроившихся на галофитный тип (Ларина, 1995), а при длительном культивировании - потеря регенерационой способности культивируемых солеустойчивых клеток. Вероятно, поэтому при получении солеустойчивого картофеля применяли только одно субкультивирование с хлоридом натрия, с последующим переводом на среду регенерации без соли (БургуганД99б). Аналогичную стратегию использовали при получении солеустойчивого риса, отбирая устойчивые каллусы на среде с 1,5%, а регенерацию растений проводя на 1% NaCl (Хадеева и др., 2000).
Ступенчатую селекцию применяют тогда, когда пересадка клеток сразу на сублетальную концентрацию селективного агента вызьшает гибель всех клеток. Это объясняется низким процентом устойчивых клеток, которые гибнут отравленные продуктами метаболизма чувствительных клеток. Ступенчатая селекция начинается с адаптивных концентраций стрессового фактора, и лишь после обогащения популяции резистентными клетками условия селекции ужесточают.
Путем ступенчатой селекции получены клеточные линии риса, устойчивые к NaCl (By Дык Куанг,1988), люцерны, устойчивые к аналогу пролина (Новожилов, Левенко ,1988) и к хлориду натрия (Мс Coy, 1987). Ступенчатая селекция проводилась сначала на 0,5%, а затем на 1% NaCl. Для получения солеустоичивых растений кукурузы использовали двухступенчатую схему селекции, повышая концентрацию хлорида натрия с 1% до 1,5% (Долгих и др., 1995), Устойчивые к соли каллусные культуры Pennisetum purpureum были получены путем как прямой (1.25% NaCl), так и ступенчатой селекции (до 2% NaCl). Клоны, отобранные путем одноступенчатой селекции, показали более высокую стабильность признака (Chander, VaziU984).
Экологическая экспертиза противогололёдных материалов (ПГМ)
По степени опасности все испытанные реагенты можно отнести к двум группам: к 1-ой группе могут быть отнесены Бишофит, ХКМ твердый и жидкий как относительно безопасные при условии соблюдения принятых норм их расхода в течение зимнего периода В эту я группу относительно безопасных , по биотестам овсяница и полевица, может быть отнесен также Нордикс-П. В 2-ю группу реагентов с возможными отрицательными последствиями их действия на растения вошли Антиснег-1 и НКММ. Высокая фиготоксичность обоих реагентов проявилась при разведении нативных препаратов (0,5-1 г/ 10000 мл воды), что во много раз превышает степень токсичности NaCl для этой тест-системы.
Дій оценки влияния ПГМ на рост растений реагенты вносили в почву в концентрации 0,1-0,5 % и оценивали отрастание трав после скашивания. По сравнению с технической солью несколько меньшую токсичность показали все реагенты, кроме НКММ.
У полевицы не отмечалось значительного угнетения роста в присутствии бишофита и хлорида кальция при концентрации в почве 0,5% реагента, (рис. 1 ), реакция овсяницы была подобной. Особо следует обратить внимание на отсутствие выраженной фитотоксичности у Антиснег-1, что отмечали ранее при действии этого реагента на прорастание семян (табл.3 ирис.1).
Тем не менее, опыты с почвенной культурой подтвердили, что НКММ имеет повышенную фитотоксичность по отношению ко всем биотестам и не зависит от видовой специфики исследованных трав.
Результаты, полученные в опытах с внесением реагентов в почву, указывают, что почвенный поглощающий комплекс может резко изменить реакцию растений на остаточные количества ПГМ после применения их в течение зимы. Это относится к компонентам ПГМ, которые могут связываться в почве органикой и минералами, а также нейтрализоваться в случае кислой рН. Можно полагать, что отсутствие выраженной фитотоксичности у препаратов, содержащих аммоний, при внесении их в почву вызвано выше указанными свойствами почв.
Поскольку все испытанные ПГМ обладают определенной фитотоксичностью, актуальной является задача получения растений, толерантных к засолению. Все реагенты первой группы (бишофит, ХКМ) содержат токсичный для растений ион хлора. Кроме того, техническая соль до сих пор , широко применяется в борьбе с гололедом, хотя и обладает большей фитотоксичностью, чем выбранные ПГМ. Поэтому при разработке биотехнологии получения устойчивых к ПГМ газонных трав в качестве селективного агента был выбран хлорид натрия. Предполагалось, что толерантные к NaCl растения могут проявить перекрестную устойчивость к бишофиту и ХКМ.Эффективная система каллусогенеза и регенерации растений является обязательным условием успешного применения биотехнологических подходов. Так как описанные в литературе питательные среды не обеспечивали получения достаточного количества растений-регенерантов (Станис и др., 1985), были оптимизированы условия каллусогенеза, культивирования каллуса и индукции морфогенеза. Была использована универсальная среда МС с разным содержанием 2,4-Д.
При концентрации 2,4Д-1мг/л у полевицы и овсяницы наблюдали интенсивное прорастание семян, процент образования каллуса был невысок. При концентрации 2,4 Д 10мг/л частота каллусообразования была значительной, однако большая часть каллуса была неэмбриогенной, Эмбриогенный каллус формировался с высокой частотой на семенах обеих трав при концентрации 2,4-Д 3 и 5 мг/л (Табл. 4).
Культивирование каллуса на средах с высоким содержанием 2,4-Д вело к быстрой потере способности к морфогенезу. При снижении концентрации 2,4-Д до 1 мл удалось повысить частоту регенерирующих растения каллусов до 80% у овсяницы и до 95% у полевицы (Табл.4).
Для дальнейшей работы была выбрана среда МС, содержащая Змг/л 2,4-Д для образования каллуса, 1мг/л -для пассирования.
Рисунок 2. Регенерация растений полевицы В результате проведенной оптимизации условий культивирования тканей полевицы и овсяницы разработана эффективная система in vitro, характеризующаяся высокой частотой образования каллуса и регенерации растений.
Проверка устойчивости к бишофиту растений, толерантных к NaCl
Другим важным неблагоприятным техногенным фактором являются соли тяжелых металлов, среди которых медь наиболее токсична. Для селекции устойчивых к ионам меди газонных трав была исследована чувствительность растений и каллусных культур овсяницы и полевицы к CuS04. В почвах г. Москвы зарегистрировано содержание ионов меди до 1200 мг/л {Ладонин, Ладонина 1997). Чувствительность растений к меди варьирует, как между таксономическими группами, так и в пределах одного вида. Полевица оказалась менее чувствительной к ионам меди ,чем овсяница. Диапазон перехода от физиологически допустимых концентраций меди к токсическим узок: при концентрации 75мг/л у полевицы происходило стимулирование роста, а у овсяницы данная концентрация являлась ингибирующей. На основании данных результатов овсяницу можно отнести к сильночувствительным видам, а полевицу к среднечувствительным. Между тем было показано, что добавление в сосуды с экспериментальными растениями 150 мг/л Си вызьгеает значительное уменьшение всхожести семян и двукратное замедление роста у обеих трав (Рис.8). При повышении дозы меди до 300 мг/л у растений начинался хлороз, а при длительном выращивании в загрязненной почве они погибали. Вероятно происходило интенсивное поглощение меди , что проявлялось в виде пожелтений листьев и хлороза. ф
По интенсивности поглощения у томатов , медь уступала кадмию , свинцу и цинку(Пронина Родригес,2001). Несмотря на то, что медь относиться к элементам, которые имеют среднюю скорость поглощения (Кабата-Пендиас, Пендиас,1989; Гуральчук, 1994) злаковые наиболее склонны к накоплению меди. У овса и пшеницы наблюдалось интенсивное поглощение меди .Медь поглощалась значительно лучше, чем свинец и цинк.(Пронина, Родригес, 2001).
Добавление соли меди в питательную среду ингибировало рост каллуса (Табл.10). Как и целые растения, культивируемые ткани овсяницы были более чувствительны к меди, чем клетки полевицы. Одна и та же степень подавления роста отмечена у овсяницы при дозе Си 100 мг/л. а у полевицы при дозе 150мг/л. При содержании меди 200 мг/л большая часть каллусных тканей овсяницы и полевицы погибала в течение 1-2 недель, лишь у незначительной части каллуса наблюдался небольшой прирост биомассы. Следовательно каллусные клетки газонных трав оказались более чувствительными к меди ,чем растения. Вероятно это связано не только с различными механизмами устойчивости на клеточном и организменном уровне, но и с переводом меди почвенным поглощающим комплексом в неподвижное состояние.
При концентрации 300 мг/л и выше каллус газонных трав приобретал голубую окраску, вероятно, вследствие интенсивного накопления меди в клетках Большая часть каллусных инокулюмов теряла способность к регенерации растений после культивирования на среде с медью. При концентрации ионов меди выше 150 мг/л весь каллус становился неморфогенным.
На основании исследовании исследования действия меди на каллусные ткани и растения овсяницы и полевицы доза 150 мг/л была выбрана в качестве селективной для отбора устойчивых клеток и растений.
Работ по клеточной селекции на устойчивость к меди практически нет.
При концентрации 5 мг/л меди в культуре клеток картофель не образовывал корней, концентрация 50 мг/л являлась летальной (Леонова, 1999).
Клетки Nicotian plumbaginifolia устойчивые к меди и цинку были отобраны на сублетальных концентрациях. Устойчивость сохранялась в неселективных условиях. Си - устойчивые клетки были слабо резистентны к А1С13 HZnS04. (Kishinami, 1988).
Получена клеточная линия табака устойчивая к высоким концентрациям меди. Ингибирующее влияние меди проявлялось при концентрации 50 мМ в культуре клеток, культивирание проводили при концентрации меди 100 мМ/л в течении 6 месяцев.Были получены растения, однако семян получено не было. (Cori Р., 1998). В большинстве случаев получить растения из линий устойчивых к высоким концентрациям тяжелых металлов не удавалось, отсутствуют работы по получению однодольных растений , толерантных к меди. Вероятно, длительное культивирование значительно уменьшало регенерационную способность клеток, поэтому для отбора толерантных к меди растении была использована такая же схема селекции, как и в случае с NaCl.
Селективный фактор присутствовал в среде на всех этапах отбора, включая укоренение регенерантов.
