Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 9
1.1. Роль популяционного уровня организации живой материи в эволюции живых организмов 9
1.2. Роль генетического полиморфизма в эволюции 12
1.3. Изменчивость в популяциях моллюсков 15
1.3.1. Морфологическая изменчивость 15
1.3.2 Биохимическая изменчивость (изоферменты) 22
1.3.3. Изменчивость ДНК 34
1.4. Особенности биологии Helix pomatia 36
1.5. Ареал Helix pomatia 41
1.6. Особенности охраны популяций Helix pomatia 44
Глава 2. Физико-географическое описание района исследования 50
Глава 3. Материал и методика исследований 67
3.1. Морфометрический анализ раковин Helix pomatia 67
3.2. Фенетический анализ раковин Helix pomatia 72
3.3. Электрофорез ферментов Helix pomatia в полиакриамидном геле (ПААГ) 74
3.4. Методика проведения полимеразной цепной реакции 77
3.4.1. Выделение ДНК 77
3.4.2. Межмикросателлитный анализ ДНК 79
3.5. Метод ДНК-комет 81
3.6. Методика статистической обработки полученных результатов 83
Глава 4. Анализ популяционной структуры Helix pomatia с использованием фенетических и морфометрических показателей 89
4.1 Фенетический анализ раковин Helix pomatia 89
4.2. Морфометрический анализ раковин Helix pomatia 93
4.3. Временные изменения морфологических показателей раковины моллюсков рода Helix 98
Глава 5. Анализ популяционной структуры и оценка жизнеспособности Helix pomatia на основе биохимических и цитогенетических методов 105
5.1. Результаты изучения популяционной структуры Helix pomatia с использованием аллозимных маркеров 105
5.2. Результаты изучения популяционной структуры Helix pomatia с помощью ISSR-маркеров ДНК 114
5.3. Оцененка степени устойчивости популяций Н. pomatia к действию генотоксичных компонентов среды 124
5.4. Оценка эффективной численности и уровня жизнеспособности популяций Helix pomatia 128
Выводы 132
Список литературы 135
- Биохимическая изменчивость (изоферменты)
- Особенности охраны популяций Helix pomatia
- Фенетический анализ раковин Helix pomatia
- Результаты изучения популяционной структуры Helix pomatia с помощью ISSR-маркеров ДНК
Биохимическая изменчивость (изоферменты)
Одним из обязательных аспектов адаптации является адаптация биохимическая. В этом случае главная роль в регулировании механизмов адаптации к изменяющимся условиям среды и поддержанию гомеостаза отводится ферментам, которые имеют различные варианты аминокислотных последовательностей белковой части. Такие ферменты называют изоферментами или аллозимами. Варианты одного и того же фермента могут отличаться по своим физико-химическим свойствам и выполняемым функциям. Часто являются видоспецифичными и подстраивают метаболизм клеток в процессе адаптации (Market, 1968). Локализация их в определенном органе подчас подчиняется выполняемой ферментом функции.
Обычно изоферменты одного локуса контролируются аллельными вариантами генов, наследование которых подчиняется закону Г. Менделя. Поэтому аллозимы часто используются в качестве генетических маркеров для анализа состояния популяционных генофондов и наблюдения за микроэволюционными преобразованиями.
Открытие в середине 60-х годов XX века белкового полиморфизма позволило получать новую, ранее недоступную информацию о свойствах генотипов на молекулярном уровне (Созинов, 1985). Оно значительно расширило возможности изучения генетической вариабельности популяций и регулирующих ее механизмов. В то же время было установлено, что состав белков генетически детерминирован и по большей части не зависит от условий существования. Тогда же выявили их значительную генетическую изменчивость, как в пределах вида, так и в пределах локальных популяций (Созинов, 1985). Большим прорывом в изучении генетической структуры популяций было изобретение метода электрофореза белков (Smithies, 1955; Raymond, 1964). Применение разнящихся в электрофоретических характеристиках, но сходных функционально белков в качестве генетических маркеров, наследование которых происходит кодоминантно по менделевским законам, позволило быстро и в больших объемах оценивать степень гетерозиготности особей и определять число полиморфных локусов в популяции (Созинов, 1985). Очевидно, если в первом поколении проявляются белки обоих родителей, это позволяет безошибочно определить гетерозиготы. Если же по локусу, кодирующему белок, присутствуют аллельные различия, то суммарный заряд кодируемого полипептида или белка, также отличается (Картавццев, 2008). Интерпретируя картину полиморфизма изоферментов, надо помнить, что один ген кодирует один полипептид, а также что имеет место быть явление колинеарности однозначного соответствия последовательности нуклеотидов в ДНК и последовательности аминокислот в белках (Картавцев, 2009). Электрофорез белков в геле позволяет обнаружить подобные аллельные различия. Таким образом, главное достоинство этого метода в том, что он позволяет оценить уровень изменчивости вида (группы, популяций).
Легочные брюхоногие моллюски являются традиционными объектами для изучения полиморфизма белков (Wakan, Hakan, 1973; Anwell, Baker, 1968), а также для анализов генетической структуры их популяций, проводимых с помощью изоферментов (Bantock, 1972; Evans, 1960). Этот факт можно объяснить тем, что моллюски удобны как модельные объекты не только для исследований в клеточной нейробиологии и физиологии (Махновский, 2011; Коршунова и др., 2007; Kononenko, 1981), но и для экологических, в том числе популяционно-генетических, исследований, включающих изучение воздействия естественного отбора на популяции.
Исследования аллозимной изменчивости у наземных брюхоногих моллюсков позволяют решать ряд вопросов: например, каков характер микрогенетической подразделенности популяции; какая роль в ней принадлежит дрейфу генов и насколько он влияет на неоднородность частот аллелей; как изменяются генетически аборигенные виды и через какое время можно зафиксировать изменения в интродуцированной группе; как в целом организована основная модель и существуют ли частные модели, отражающие адаптивные ответы организмов на экологические факторы.
Кроме того, стоит отметить, что дифференциация популяций по морфометрическим признакам иногда согласуется с их генетической структурированностью. Например, подобный факт был зафиксирован в популяциях моллюска Nucella heyseana (Чичвархина, Картавцев, 2009; Картавцев, 2009; Ситников и др., 1998). Авторы полагают, что такую сопряженность генетической структуры популяций по ферментным генам с морфологической изменчивостью невозможно объяснить без привлечения концепции естественного отбора. Эстеразы, малатегидрогеназы и супероксиддисмутазы входят в число наиболее распространенных популяционно-генетических маркеров, в том числе для моллюсков (David, Woodruff, 1975; Матекин, Макеева, 1977; Stankiewicz, 1982; Guiller et al., 1994; Arnaud, 2003; Макеева, 2008; Макеева и др., 2005; Онегин, 2005, 20116; Артамонова и др., 2006; Ирейкина,2008; Гарбар, Чернышева, 2011; Онегин, Сычев, 2011). В некоторых работах данные ферменты были использованы для описания генетической структуры популяций Н. pomatia (Jarvinen et al., 1976; Снегин, 2006, 2010; Снегин, Артемчук, 2014а; 20146).
Так как в своих исследованиях мы использовали эти аллозимы, то сочли необходимым дать функциональную характеристику этих ферментов. Их преимущество как молекулярных маркеров обусловлено тем, что сами изоферменты выполняют определенную функцию (или же не одну) в процессах метаболизма организма и наравне с геномными локусами могут выступать в роли идентификаторов данных функций (Юдина,2010; Юдина и др., 2010).
Одним из анализируемых нами ферментов был супероксиддисмутаза (СОД), который относится к классу оксиредуктаз, в клетках организма выполняет антиоксидантную функцию и вместе с каталазой защищает от активных форм кислорода. Супероксиддисмутаза тормозит перекисное окисление липидов и белков, преобразует супероксид 02 в Н202. Каталаза же, в свою очередь, расщепляет Н202 до воды.
Поэтому по степени активности СОД, так же, как и по активности глутатионпероксидазы и каталазы, инактивирующих продукт реакции СОД-H202j можно делать выводы об антиоксидантном статусе ткани или органа.
Изоферментные формы СОД - это внутриклеточные ферменты, разрушающиеся в межклеточной жидкости (Чеснокова и др., 2006). Жизненную важность СОД приобретает для аэробионтных видов. Так было выяснено, что у облигатных аэробов, содержащих систему цитохрома, присутствуют одновременно суперотксиддисмутазы и каталазы (McCord et al., 1971). У анаэробов, которые толерантно переносят пребывание в воздушной среде и метаболизируют кислород в ограниченном объеме, не содержат систем цитохрома и лишены каталазной активности, как правило, проявляют активность супероксид дисмутазы. Это согласуется с представлением о том, что основная физиологическая функция супероксиддисмутазы - защита организмов от потенциально вредного воздействия свободных радикалов (супероксидов) (McCord, Fridovich, 1969; Fridovich, 1978; McCord et al., 1971; Афанасьев, 1979, 1984). Существуют сведения, согласно которым дефицит в организме Си2+ и Zn2+ сильно снижает активность СОД и резко повышает чувствительность к оксидантному повреждению (Чеснокова и др., 2006).
Известно также, что в условиях эксперимента у двустворчатых моллюсков Unio pictorum при возрастании токсического воздействия ртути и свинца в ответ возрастала активность SOD (Соловых и др., 2011). Как уже ранее упоминалось, супероксиддисмутазе принадлежит главенствующиая роль в процессах инактивации слишком высоких концентраций перекисного окисления липидов (Шульман, Солдатова, 2014). Поэтому активность данного фермента у различных групп организмов под влияние различных факторов, в том числе у гастропод, активно изучалась (Gooch and other, 1972). Также есть сведения, что данный фермент можно использовать как маркер стрессового воздействия на водных моллюсков гипоксии или аноксии (Истомина и др., 2011).
Есть данные, свидетельствующие о том, что на активность ключевых ферментов, купирующих воздействие активных форм кислорода, оказывает влияние анабиоз. Это явление, например, отмечено и у виноградной улитки. Так, по сравнению с периодом активной жизнедеятельности, у данного вида в несколько раз снижается активность глутатионтрансферазы, что объясняется общим снижением метаболизма и соответственно пониженным потреблением кислорода, вследствие чего отпадает необходимость в поддержании высокой активности данного фермента. В литературе приводятся данные о снижении активности глутатионтрасферазы гепатопанкреаса и мышцы ноги в 11 раз, а глутатиоредуктазы в гепатопанкреасе и мышце ноги виноградной улитки в 2,7 и 10 раз соответственно. При этом активность каталазы в гепатопанкреасе и мышце ноги у данного вида зимой и летом существенно не отличается (Мандрик и др., 2014а, 20146).
Особенности охраны популяций Helix pomatia
Н. pomatia - это довольно крупный наземный брюхоногий моллюск. Традиционно заметным животным уделяется больше внимания при разработке мер их охраны (или мест их обитания) в природе. Некоторые авторы отнесли данный вид к категории, вызывающей «особую обеспокоенность» (Wells, Chatfield, 1992). В настоящее время виноградная улитка указана в Приложении III Бернской конвенции в разделе «Виды животных, популяции которых разрешено эксплуатировать на устойчивой основе» (Convention on the conservation of European wildlife and natural habitats (Bern Convention), Annex III: protected fauna species, 19.09.1979), а также в Директиве EC в приложении 5 в числе растений и животных, природные популяции которых могут подвергаться регулируемой эксплуатации (Council Directive (EU Habitats Directive Annex Va) 92/43/EEC 01.01.2007).
Во многих европейских странах H. pomatia подлежит охране. Ранее виноградная улитка была включена в Красную книгу беспозвоночных Международного Союза Охраны Природы (Wells et al., 1983), Европейский Красный список (Leon, 1991). В Красный список МСОП по состоянию на 1990 год (IUCN red list, 1990) виноградная улитка (в частности, её европейские популяции) была внесена в категорию R, т.е. в категорию редких видов, популяции которых невелики, и на данный момент не относятся к категории «находящихся под угрозой исчезновения» или «уязвимых», хотя и находятся в зоне некоторого риска (Flesness, Foose, 1990).
Сбор Н. pomatia является предметом регионального и местного контроля в ряде европейских стран, включая Австрию, Бельгию, Болгарию, Чехию, Францию, Германию, Венгрию, Италию, Люксембург, Нидерланды, Польшу и Швейцарию (Fourth Quinquennial Review of Schedules 5 and 8 of the Wildlife and Countryside Act, 2002).
Предполагается, что в фауну Великобритании вид был интродуцирован около 2000 лет назад римлянами. Сейчас, по состоянию на 2002 год, на территории Англии, виноградная улитка подлежит охране ввиду островного положения государства и, как следствие, изоляции местных популяций Н. pomatia от прочих континентальных популяций, так что в случае чрезмерного антропогенного давления на эти группы или неконтролируемого сбора особей, такие популяции могут исчезнуть (Fourth Quinquennial Review of Schedules 5 and 8 of the Wildlife and Countryside Act, 2002). В ходе проведенных исследований, например, было установлено, что колонии в г. Бристоль вымерли по причине чрезмерного сбора. Причем этому способствовала их склонность к агрегации и низкая скоростью миграции. Также было отмечено снижение численности виноградной улитки в Глостерширском лесничестве и в графстве Суррей (Alexander, 1994). Автор отмечают, что в южной Англии вид предпочитает селиться в не нарушенных густых травяных зарослях, а не в садах, и имеет низкий уровень воспроизводства.
Современное состояние мировой макропопуляции Н. pomatia по состоянию на 2015 год на сайте МСОП (http://www.iucn.org) обозначается охранным статусом LC, как вид с минимальными угрозами для существования (Neubert, 2013).
Тем не менее, как и оговаривается Международным Союзом Охраны Природы, не смотря на то, что в целом виду не угрожает опасность, состояние отдельных популяций могут вызывать опасения, поскольку при неконтролируемом сборе взрослых особей восстановление популяции будет очень медленным. Потому на определенных локальных территориях вид подпадает под действие охранных законодательств мероприятий. Так, он включен в Красную книгу Сумской области (Парникоза и др., 2005). В рамках работ по созданию трансграничного сектора экологической сети вдоль северной границы республики Молдова виноградная улитка охраняется как вид, включенный в Европейский Красный Список (Череватов, 2011). В Германии Н. pomatia включен в список особо охраняемых видов в Приложение 1 Федерального постановления об охране видов (Bundesartenschutzverordnung, 21.01.2013), который регламентирует в виде исключения сбор животных с диаметром раковины только свыше 30 мм. В республике Беларусь также не рекомендованы к сбору раковины размером менее 25 миллиметров, а также существует ограничение по времени добычи: в период размножения животных, с 15 июля по 1 сентября сбор запрещён (Хандогий, Прищепчик, 2014). В Красную книгу Воронежской области вид внесён как неопределенный по статусу, за неимением полных сведений о состоянии популяций в регионе (Негробов, 2011). Виноградная улитка внесена также в Красную книгу Белгородской области (Красная..., 2004) и рекомендована для занесения в Красную книгу Самарской области (Сачкова, 2006). Вид занесен в охранные списки Дании и Великобритании. В Латвии статус Н. pomatia обозначен как IAS - т.е. это особо охраняемый вид согласно Приложению 1 правил Кабинета министров «О списке особо охраняемых видов и видов ограниченного использования», вид характеризуют как чужеземный, но не инвазивный (Latvijas-Lietuvas-Baltkrievijas parrobezu sadarbibas programmas 2007-2013). В Болгарии вид находится под охраной ЮНЕСКО в заповеднике „Luda Kamchiya". В Эстонии на территории острова Хийумаа охраняется в соответствии с Европейской Директивой по охране природы (Council Directive (EU Habitats Directive) 92/43/EEC 01.01.2007), хотя на материковой части страны виноградная улитка больше не находится под охраной, хотя все еще внесена в Приложение V к Директиве по охране природы (Leenurm, 2012). В Польше, где объект имеет экономическую значимость, проводятся работы по исследованию пассивной защиты, включающие мониторинг природных популяций и интродукцию виноградной улитки на свободные территории и т.д. (Ligaszewski, 2014).
В заключении хотелось бы отметить, что, несмотря на большую изученность Н. pomatia, существует потребность в проведении тщательных и всесторонних исследований популяций данного вида, особенно в восточной части ареала. Эта необходимость вытекает из того, что периферийные популяции, населяющие, например, территорию Среднерусской возвышенности, генетически разобщены и, как следствие, более уязвимы, т.к. на них действуют иные векторы отбора, чем в ядре ареала. Можно предположить, что в Центральной Европе расположена зона оптимума и как следствие центр внутривидового разнообразия Н. pomatia. Как известно, для таких зон характерны большие по размерности популяции с относительно стабильной численностью населяющих их особей и проявлением всех фенотипических вариантов.
Известно также, что чем ближе к периферийным участкам ареала, тем менее подходящими становятся условия окружающей среды и тем менее пригодны они для существования вида. Эти краевые популяции, как правило, изолированы, в них происходят более резкие колебания численности, а сами особи становятся мельче по сравнению с особями из попоуляций, занимающих центр ареала. Кроме того, как уже было сказано, на периферии могут действовать иные векторы естественного отбора, т.к. пограничные микросреды отличны от микросред внутренней части ареала. Кроме того, они характеризуются большими колебаниями уровней освещенности, температуры, влажности и скорости ветра (Примак, 2002). Итогом действия перечисленных факторов может стать гомозиготизация аллелофонда таких периферийных популяций и, как следствие, более бедный генофонд и фенофонд по сравнению с группами из центральных территорий. Именно такими по фенам окрасочного раковинного полиморфизма являлись изолированные популяции виноградной улитки на крайней северной границе ареала вида в Шотландии, и некоторые из этих колоний были полностью мономорфными по отдельным фенам (Яблоков, 1980). Автором справедливо замечено также, что в подобных краевых колониях чаще будут выщепляться редкие фены, которые обычно скрыты в гетерозиготном состоянии в зоне оптимума вида. Как следствие, сумма фенофондов периферийных популяций может оказаться разнообразнее, чем в центральных группах. При этом каждая из краевых групп в отдельности должна быть менее разнообразной фенетически, чем центральная. (Яблоков, 1980).
Весьма интересными в этой связи являются высказывания Н. В. Тимофеева-Ресовского с соавторами (1973), согласно которым периферия ареала вида имеет две главные особенности. Это, во-первых, уменьшение размеров популяции и увеличение изоляции между этими популяциями, что увеличивает вероятность случайного выщепления и гомозиготизации рецессивных мутаций и полиплоидов, тем самым возникают условия для оживления эволюционного формообразования. Во-вторых, по периферии видовых ареалов популяции, как правило, существуют в экстремальных для данного вида абиотических и биотических условиях, что может благоприятно повлиять на возникновение географической изменчивости, характеризующей внутривидовые таксоны, путем изменения векторов отбора (Ивантер, 2010). Таким образом, внутрипопуляционное разнообразие в центре ареала переходит в межпопуляционное разнообразие на периферии (Тимофеев-Ресовский и др., 1973).
Фенетический анализ раковин Helix pomatia
Как уже упоминалось в третьей главе, на раковине Н. pomatia присутствуют продольные коричневые полосы в различных комбинациях, которые мы использовали в качестве маркеров популяционной структуры.
Результаты вычислений приведены в таблицах 4.1. и 4.2. Согласно полученным данным, подавляющее большинство изученных популяций по фенетическому разнообразию достоверно не отличаются друг от друга.
Так, по среднему количеству отмеченных фенотипов (pi) лидирует популяции «Киев» и «Хотмыжск», а наиболее фенотипически бедной оказалась группа «Майский». Однако, учитывая значения ошибки этого показателя (таблица 4.3) и доверительных интервалов (при р=0,05)(рис. 4.1) значимых различий между популяциями не выявлено.
Дисперсионный анализ, проведенный на основе построенных бинарных матриц, где наличие полосы обозначали как 1, а отсутствие как 0, показал, что индекс подразделенности популяций L st = 0,024. При этом на долю межпопуляционных отличий приходится лишь 2 % (табл. 4.2).
По результатам расчетов показателя фенетического сходства (г) (табл. 4.3.) наименьшие фенетические дистанции ( 0,999) отмечены между группами, «Курск»-«Майский» и «Яблоново»-«Майский», «Курск»-«Яблоново». Судя по средним значениям г наиболее оригинальной по фенетическому составу является группа, обитающая в г. Тверь (гсред=0,836), которая дальше всех дистанцировалась от популяций «Шопино», «Киев» и «Курск». Но данные отличия могли быть спровоцированы ошибкой выборочное из-за малого количества проанализированных особей.
Стоит отметить, что анализ фенотипического облика популяций Н. pomatia позволяет с одной стороны говорить о сходных генетических процессах, протекающих в изучаемых группах, а с другой стороны - выявить наиболее оригинальные по данным признакам популяции, что позволяет отчасти судить об их происхождении и о различиях векторов естественного отбора.
Результаты морфометрического анализа изучаемых популяций приведены в таблице 4.4. Полученные данные нельзя интерпретировать однозначно. Так, изученные группы достоверно отличаются как по абсолютным конхиологическим параметрам, так и по их индексам. Оригинальность популяций подтверждается также однофакторным дисперсионным анализом (табл. 4.5), согласно ему по всем конхиометрическим признакам межпопуляционные вариансы достоверно превзошли внутрипопуляционные P 0.05).
С другой стороны, кластеризация выборок по конхиологическим признакам не выявила какой-либо зависимости средних параметров раковины от географического положения группы (рис. 4.2). Так, в один и тот же кластер со смежными популяциями «Житомир» (№ 9), «Киев» (№ 10), «Харьков» (№ 8) и «Яблоново» (№ 11) попала довольно удаленная от них группа «Быково» (№ 12). А популяции из окрестностей г. Белгород (№ 2, 4, 6, 7) попали в разные кластеры (Снегин, Артемчук, 2014).
Результаты изучения популяционной структуры Helix pomatia с помощью ISSR-маркеров ДНК
Данный раздел посвящен анализу популяционной структуры Н. pomatia, проведенному с помощью межмикросателлитных последовательностей ДНК (ISSR - Inter simple sequence repeats) (Zietkiewicz et. al., 1994). В предыдущих разделах популяционная структура виноградной улитки была описана с помощью конхиологических признаков и аллозимов. Но использование этих, безусловно, важных маркеров популяционной структуры имеют ряд ограничений. Например, метрические признаки раковины Н. pomatia не дискретны и подвержены модификационной изменчивости, и не позволяет реализовать набюдение за генетическими процессами, протекающими в исследуемых группах. Также известно, что фенотипы раковин (включающие совокупность продольных лент), а также изоферменты являются отражением изменчивость только кодирующей части генома, на долю которой приходится около 10 % от общей ДНК, а остальная, «молчащая» (или «сателлитная») ДНК участвует в анализе. Тем не менее, эти участки содержат множество селективно нейтральных сайтов, при помощи которых можно наблюдать за генетико-автоматическими процессами в популяциях (Снегин, 2012). Самым удобным способом решения этой задачи является использование /557?-маркеров ДНК, применение которых основано на использовании одного праймера, имеющего множественные комплементарные участки, имеющие тандемные повторы, разбросанные по всему геному. (Снегин, Артемчук, 2017)
Как указывалось в третьей главе, для проведения ПЦР мы использовали три прайм ера - UBC 809, UBC 811 я UBC 827, дающие для анализа в совокупности 57 локусов.
Уровни генетической гетерогенности исследуемых популяций, приведены в таблице 5.6.
Учитывая тот факт, что самые западные из исследованных популяций, обитающие в Чехии, Словаки и Польше, можно считать аборигенными и находящимися ближе к центру ареала, уровень их генетической изменчивости сопоставимый с восточными группами, вероятно, свидетельствует о том, что в случае антропохории, традиционная модель об обеднении аллелофонда в периферийных группах, вероятно, нарушается. Данное явление может быть следствием непреднамеренного хаотичного заноса улиток (как единичных экземпляров, так и целых групп) на новые территории. При этом не исключено, что часть вновь образованных поселений быстро вымирают и не становятся объектами наблюдений. В то время как выжившие колонии, пройдя через горнило естественного отбора и стадию так называемой «генетической революции» (Майр, 1968) уже смогли сформировать сбалансированную генетическую систему, аналогичную центральным популяциям.
При этом нужно отметить, что показатели генетической гетерогенности популяций, полученные нами ранее с помощью аллозимов не коррелируют с аналогичными показателями, вычисленными на основе ISSR-маркеров (рис. 5.3.). Только в популяции «Тверь» в обоих случаях получены сходные значения, но это явление может быть вызвано малым количеством исследуемых особей. Данный факт свидетельствует о различиях генетических процессов, протекающих по нейтральным и селективно значимым локусам генома. Вероятно, аллельный состав и набор генетических комбинаций по аллозимам в большей степени определяется естественным отбором, тогда как структура популяционных генофондов, выявляемая по используемым ДНК-локусам, являются результатом дрейфа генов.
Усредненные значения ожидаемой гетерозиготности и индекса Шеннона оказались ниже аналогичных показателей генетического разнообразия, выявленных по аллозимным маркерам. Данный факт свидетельствует о различиях генетических процессов, протекающих по нейтральным и селективно значимым локусам.
Анализ молекулярной дисперсии (AMOVA) по локусам ДНК (табл. 5.7) выявил умеренную генетическую разобщенность между популяциями Helix pomatia. На межпопуляционные различия пришлось 23 % изменчивости, при этом индекс дифференциации Ф5Г=0,233, а уровень потока генов Nm=0,S22 особи за поколение. Важно, что эти показатели несколько отличаются от аналогичных показателей, полученных по аллозимным маркерам (см. раздел 5.1), где соотношение межпопуляционной дисперсии {Vap) и внутрипопуляционной дисперсии (Vwp) было 30/70 %, при этом ФіГ=0,291, Nm=0,609.
Весьма примечательно выглядит и тот факт, что попарный уровень дифференциации 0st между западными группами (пункты 12, 13, 14) сопоставим с аналогичными показателями, вычисленными между восточными колониями (табл. 5.8). При этом в 56% случаев уровень разобщенности между восточными группами был ниже, чем между западными популяциями.
Кроме того, результаты анализа молекулярной дисперсии популяций Н. pomatia по ДНК-маркерам оказались сходными с аналогичными показателями, полученными для аборигенных фоновых в районе исследования видов моллюсков Bradybaena fruticum и Chondrula tridens (Снегин, 2012). Так, у В. fruticum по локусам ДНК уровень дифференциации популяций Ф5Г=0,298, уровень потока генов 7V/w=0,708, а соотношение Vap/Vwp=30/70%. У Ch. tridens - Ф==0,185, Nm=0,954, Vap/Vwp=19/81% (Снегин, 2015). При этом уровень генетической разобщенности популяций виноградной улитки оказался значительно ниже, чем у популяций реликтового вида Helicopsis striata (ФіГ=0,404,7V/w=0,360, Vap/Vwp=40/60 %), также обитающего на юге Среднерусской возвышенности (Снегин, 2015). В таблице 5.9 приведены значения гетерозиготности и оценки степени дифференциации исследуемых популяций Н. pomatia по различным локусам.
Данные показали аналогичный с показателями AMOVA уровень разобщенности изучаемых групп Gst= 0,255 (табл. 5.8).
Известно, что средние величины Gst, соответствуют уровню генетической дифференциации, наблюдаемой при селективно-нейтральном процессе. В этом случае локусы с наибольшими значениями Gst вероятнее всего могут испытывать действие дизруптивного отбора, а локусы с низкими показателями индекса подразделенности подвержены влиянию стабилизирующего отбора (Алтухов, 2004).
В соответствии с результатами, наибольшая дифференциация между популяциями отмечена по локусам: UBC 809-10, -14, -16; UBC 811-16, -17; UBC 827-14, -20.
Результаты кластерного анализа и полигоны Дебеца (лепестковые диаграммы) исследуемых популяций, построенные с использованием частот д-аллеля, приведены на рисунках 5.4 и 5.5.