Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Литературный обзор 8
1.1. Органические ксенобиотики мясных продуктов 8
1.1.1. Классификация опасных химических соединений в пищевых продуктах 8
1.1.2. Поликонденсированные ароматические углеводороды . 9
1.1.3. Гетероциклические ароматические амины 12
1.1.4. Нитрозамины и биогенные амины 18
1.2. Метаболизм органических ксенобиотиков в организме человека 22
1.3. Причинно-следственные связи возникновения органических ксенобиотиков в мясных продуктах 30
1.4. Способы снижения содержания органических ксенобиотиков в мясных продуктах 33
1.5. Стиль питания и здоровье человека 34
1.6. Методы исследования органических ксенобиотиков в мясных продуктах 35
1.6.1. Химико-аналитические методы 36
1.6.2. Биологические испытания на высших животных 39
1.6.3. Биологические методы на одноклеточных организмах и клеточных культурах 39
1.7. Биохимические методы исследования 45
1.8. Традиции в приготовлении мясных блюд 47
Глава II. Экспериментальные исследования. Объекты и методы 52
2.1. Объекты исследования 52
2.2. Биологический метод 52
2.3. Биохимический метод 54
2.4. Физико-химические приборные методы 54
Глава III. Комплексные исследования ПАУ в модельных мясных продуктах и оценка коптильных ароматизаторов 56
3.1. Проблема полициклических ароматических углеводородов в мясных продуктах 56
3.2. Сравнительные биологические и биохимические исследования 58
3.2.1. Схема исследования 58
3.2.2. Первый этап - экспрессное исследование на инфузориях Paramecium caudatum 61
3.2.3. Второй этап - пролонгированный опыт на Tetrahymena pyriformis 64
3.2.4. Третий этап исследования - оценка прироста культуры инфузорий на модельных мясных продуктах через 72 часа экспозиции 70
3.2.5. Четвертый этап - изучение активности пепсина в пробах модельных мясных продуктов 72
3.3. Аналитические исследования коптильных ароматизаторов и модельных мясных продуктов 74
3.3.1. Исследование коптильных ароматизаторов 74
3.3.2. Аналитическое исследование модельных мясных продуктов 76
Глава IV. Исследование модельных систем, содержащих гетероциклические ароматические амины 80
4.1. ГАА в модельных системах 80
4.2. Биологическая оценка модельных растворов с помощью автоматизированного биотеста на инфузориях Tetrahymena pyriformis 81
4.3. Сравнительная биологическая оценка жареного продукта на инфузориях Tetrahymena pyriformis 85
4.4. Аналитическое определение ГАА в модельных растворах 87
4.5. Аналитическое определение ГАА в модельном жареном продукте 90
Глава V. Исследование воздействия биогенных аминов, нитрита и нитрата натрия на простейших 93
5.1. Определение чувствительности инфузорий к биогенным аминам, нитриту и нитрату натрия 93
5.2. Исследование роста культуры Tetrahymena pyriformis на модельных средах, содержащих биогенные амины, нитрит и нитрат натрия 103
5.3. Изучение воздействия БА, нитрита и нитрата натрия на активность пепсина 105
Глава VI. Теоретическое рассмотрение и методология оптимального выбора композиционного состава добавок, повышающих безопасность мясных продуктов 107
6.1. Обоснование выбора добавок Изучение традиционных рецептур пряностей для мясных
6.2. Блюд
6.3. Анализ структурно-химического состава компонентов выбранной смеси 114
6.4. Механизм действия антиоксидантов и оценка антиоксидантной активности пряностей 126
6.5. Исследование действия на живую клетку смеси пряностей 131
Выводы 134
Библиографический список 135
Приложение 143
- Поликонденсированные ароматические углеводороды
- Биологический метод
- Проблема полициклических ароматических углеводородов в мясных продуктах
Введение к работе
Актуальность исследования органических ксенобиотиков в мясных продуктах. Один из самых важных факторов, определяющих уровень здоровья человека, является качество его питания. Среди всех заболеваний, как следствий нарушения питания, ведущая роль по тяжести и количеству принадлежит канцерогенезу. Известно, что в 35% случаев возникновения опухолей [1] причинами являются органические ксенобиотики пищевых продуктов. К этим ксенобиотикам относятся гетероциклические ароматические амины (ГАА), поликонденсированные ароматические углеводороды (ПАУ), нитрозамины (НА) и биогенные амины (БА).
Жесткая тепловая обработка мясных продуктов (особенно открытый огонь) способствует не только получению вкусных блюд, но и является причиной образования в них мутагенных факторов, таких как ПАУ и ГАА. По некоторым данным [2] самые сильные мутагенные/канцерогенные химические соединения пищевых продуктов это - гетероциклические ароматические амины (ГАА). Это чрезвычайно мощные мутагены. В гепатоцитах человека ГАА трансформируются и становятся фактором, запускающим процесс канцерогенеза.
Изучение органических ксенобиотиков в пищевых продуктах базируется на количественном определении их с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии и хромато-масс-спектрометрии. Эти исследования имеют высокую себестоимость и сопряжены с трудоемкими и длительными процессами пробоподготовки. Оптимизация методологии исследований для обеспечения безопасности пищи состоит в рациональном сочетании дорогих аналитических и интегральных биологических методов. К ним относятся испытания на живых организмах - от одноклеточных до млекопитающих.
5 Такой подход особенно привлекателен для изучения пищевых
продуктов, во-первых, тем, что позволяет существенно сократить время и
затраты на проведение исследований и, во-вторых, кроме обнаружения тех
или иных соединений, выявляет действие на живой организм всего
комплекса органических соединений, присутствующих в исследуемом
объекте.
Совершенствование методических основ определения и идентификации ГАА, ПАУ и других ксенобиотиков пищевых продуктов позволит повысить эффективность мониторинговых санитарных исследований, а также оптимизировать разработку новых технологий и новых видов пищевых продуктов. Это, в свою очередь, будет способствовать повышению качества пищевых продуктов и, соответственно, здоровью людей.
Цель и задачи исследования. Цель работы заключалась в создании методического подхода к исследованию органических ксенобиотиков в составе пищевых композиций и разработка способа снижения их образования в мясных продуктах. В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:
установить соответствие результатов биологических, биохимических и аналитических исследований разных групп ксенобиотиков (ПАУ, ГАА, биогенные амины) на модельных системах;
определить особенности воздействия на живую клетку модельных систем рассматриваемых классов ксенобиотиков в сочетании с природными антиоксидантами;
провести анализ традиционно используемых рецептур пряностей и оптимизировать составы смесей пряностей, обеспечивающих снижение количества ПАУ и ГАА в мясных продуктах;
оценить антиоксидантную способность выбранной смеси пряностей;
провести сравнительное исследование модельного мясного продукта, содержащего рассматриваемые ксенобиотики с добавкой выбранной смеси
пряностей и контрольного образца без добавок и разработать рекомендации по получению готовой мясной продукции с пониженным содержанием ПАУ и ГАА.
Научная новизна. Экспериментально установлена возможность использования простейших эукариот в качестве тест-объектов для исследования основных групп органических ксенобиотиков (ПАУ, ГАА и биогенных аминов) мясных продуктов.
Предложен двухэтапный способ оценки безопасности на двух видах простейших - Paramecium caudatum и Tetrahymena pyriformis.
Разработан системный подход к оптимизации смесевых рецептур сухих пряностей.
Экспериментально доказано положительное действие смеси сухих пряностей на увеличение безопасности мясных продуктов и снижение скорости окислительных процессов при хранении.
Практическая значимость диссертационной работы заключается в создании методологии исследования и скрининговои оценки качества мясных продуктов, а также способа повышения их безопасности. Разработана экономически эффективная, экспрессная методика анализа содержания ПАУ и ГАА в мясной продукции. Определены и рекомендованы оптимальные дозы введения компонентов специй, обеспечивающих снижение содержания вредных веществ в пищевых рецептурах на основе мясного сырья. Выполненными исследованиями установлена практическая возможность выработки продукции с безопасным содержанием ПАУ и ГАА.
Разработанный подход повышает достоверность, снижает трудоемкость и стоимость исследований безопасности пищевых продуктов.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Результаты сравнительных исследований ПАУ биологическим (на простейших), биохимическим и аналитическим методами в мясных модельных продуктах и коптильных ароматизаторах.
2. Результаты сравнительных исследований воздействия ГАА на
клеточном уровне.
Результаты исследований содержания биогенных аминов, нитрата и нитрита натрия на простейших (инфузорий).
Алгоритм выбора оптимального состава смеси пряностей.
Результаты оценки положительного воздействия выбранной смеси пряностей на живую клетку.
Апробация работы. Основные положения и результаты работы были обсуждены на 5-ой международной научно-технической конференции «Пища, экология, человек» (Москва, 2003 г); конференции МГУПБ «Технологии живых систем» (Москва, 2003 г); 2-ой Каспийской международной экологической конференции (Турция, Стамбул, 2004 г); научно-практической конференции «Развитие масло-жировой, маслодельной и сыродельной промышленности» (Москва, 2005 г); конференции МГУПБ «Технологии живых систем» (Москва, 2006 г); 9-ой международной конференции «Интеграция в мясную промышленность России современных методов управления качеством и прослеживаемости», ВНИИМП им. Горбатова (Москва, 2006).
Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 13 печатных работ.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов, приложения и списка литературы, содержащего 86 источников, в том числе 24 работы зарубежных авторов, и приложения, содержит 159 страниц машинописного текста, 57 рисунков, 22 таблицы.
Поликонденсированные ароматические углеводороды
Среди полициклических ароматических углеводородов наиболее изученным является бензо[а]пирен, который является проканцерогеном и обнаруживается в относительно высоких концентрациях (до 200 нг/г готового продукта) в мясе, жаренном над открытым огнем [7] и в копченых готовых мясных продуктах [8]. При таком способе тепловой обработки ПАУ образуются и. концентрируются в корочке, формирующейся на поверхности продукта. Высокое содержание жира в продукте способствует увеличению содержания ПАУ, так как вытапливающийся жир в капельножидком виде поступает на горячие угли и, как следствие, подвергается пиролизу, продукты которого с дымами переносятся на поверхность мяса.
В ассортименте вырабатываемых мясопродуктов наибольшим потребительским спросом пользуются изделия, технология изготовления которых включает обработку древесным дымом [9]. Копчение рассматривается как процесс, обеспечивающий изделиям формирование приятного вкуса и аромата, а также как универсальный антиокислительный и бактериостатический фактор. Среди составляющих компонентов коптильного дыма идентифицированы полициклические ароматические углеводороды, содержащиеся в нем в довольно ощутимых количествах и попадающие в изделия при копчении. Количество поликонденсированных ароматических углеводородов, попадающих в организм только из мясных и рыбных копченых продуктов, сопоставимо с таковыми, поступающими из атмосферного воздуха промышленных городов или из табачного дыма.
Из всего огромного семейства ПАУ более чем для 200 постулирована канцерогенная активность и многие из них были идентифицированы в копченых продуктах [10].
Бензо[а]пирен относительно легко идентифицируется по его характерному очень интенсивному спектру флуоресценции. Поэтому этот полициклический углеводород принято считать индикатором наличия ПАУ в различных объектах, в том числе и пищевых продуктах. Его канцерогенная активность принята равной единице.
Биологический метод
Причинами возникновения многочисленных полициклических ароматических углеводородов в мясных продуктах являются копчение и жарение на открытом огне, которое способствует синтезу в мясных продуктах ПАУ и ГАА. Исследования модельного жареного продукта будут представлены в главе IV.
Копчение представляет собой химический способ обработки продукта, имеющий целью, в первую очередь повышение его сохранности. При копчении составляющие коптильного дыма осаждаются на поверхности и проникают в микроструктуру продукта. Характерный вкус и запах копченым изделиям придают гетероциклические вещества, углеводороды, альдегиды, спирты и карбоновые кислоты, определяющие консервирующее действие дыма. Они, как правило, хорошо растворяются в водных растворах. Наряду с этими соединениями коптильный дым содержит большое количество жирорастворимых углеводородов, среди которых присутствуют полициклические ароматические углеводороды (ПАУ), обладающие канцерогенными свойствами. Эти вещества содержатся в основном в дисперсной фазе дыма (частицах смолы и сажи), которая в процессе копчения оседает на поверхности продукта и легко выделяется из конденсатов дыма.
В копченых мясных продуктах регламентировано только содержание бензо[а]пирена. Не менее важно определять и другие ПАУ [83], среди которых дибензо[а,Ь]антрацен обладает соизмеримой канцерогенной активностью с бензо[а]пиреном (табл. 1).
Совершенствование технологии копчения состоит в оптимизации ре-жимов дымогенераторов, а также в применении бездымного копчения с использованием коптильных препаратов, которые придают продуктам традиционные свойства копченостей и одновременно способствуют существенному уменьшению содержания канцерогенных полициклических ароматических соединений.
В зависимости от типа используемых коптильных препаратов, вида производимого продукта, а также характера взаимодействия коптильного средства с обрабатываемыми продуктами применяют разные технологические приемы, в том числе и добавление готового коптильного препарата непосредственно в продукт. Такой прием используется при изготовлении сосисок, сарделек и вареных колбас, в производстве разнообразных консервов, некоторых видов сырных изделий. При использовании этого приема необходима сертифицированная чистота коптильного препарата, состоящая в гарантированном отсутствии бензо[а]пирена и других ПАУ, обладающих канцерогенным действием.
С использованием высококачественного коптильного препарата готовые изделия становятся практически безопасными, приобретают приятный вкус и аромат, стойкость при хранении. Но в коптильных ароматизаторах, являющихся конденсатами дыма, содержатся разнообразные ароматические углеводороды и не всегда состав и свойства этих препаратов могут надежно контролироваться. При этом критерии совершенства коптильных препаратов выработать сложно, т.к. получение их зависит от используемого природного сырья (древесина различных пород деревьев), способов получения препарата и собственно технологии копчения. Разнообразные технологии получения коптильных препаратов и разные способы получения готовых продуктов добавляют достаточно большую долю неопределенности в оценку качества таких продуктов.
В качестве подходов, позволяющих повысить эффективность оценки безопасности мясных продуктов, могут быть использованы методы биотестирования на простейших и ферментные биосенсорные тесты. С помощью этих методов нами были исследованы коптильные ароматизаторы - «Арома-рос» и «Деликарома», а также сосиски, копченые в дымогенераторе Я5-ФКЕ [83]. Идентификация и количественное определение некоторых ароматических углеводородов произведено на газовом хромато-масс-спектрометре. Т.о., настоящее исследование носит комплексный характер, а данные, полученные в биологических опытах, сопоставлялись с результатами аналитических определений.
Проблема полициклических ароматических углеводородов в мясных продуктах
Для выявления действия ГАА на живые клетки инфузорий Tetrahymena pyriformis был использован модельный раствор, состоящий из креатина (0,014 мМ), глицина (0,014 мМ), глюкозы (0,07 мМ) и воды 50мл (раствор 1), а также 3 ингибирующие добавки к этому модельному раствору- L-цистеин (раствор 2), глютатион (раствор 3) и триптофан (раствор 4). Выбор добавок произведен в соответствии с [85] и основан на их растворимости в воде, поскольку исследуемая система - водный раствор. Каждую добавку в концентрации 0,3 мМ вводили в модельные растворы и нагревали при температуре 145С в течение 1 часа. В результате получили 4 окрашенных раствора:
- раствор 1 - коричневый;
- раствор 2 - желтый;
- раствор 3 - менее желтый;
- раствор 4 - коричневый (интенсивность окраски такая же, как у первого раствора).
При нагревании в ходе реакции Майяра в таких растворах происходит образование ГАА, идентичных соединениям этого класса, выделяемых из жареного мяса.
Первый этап исследования ГАА состоял в оценке действия модельных растворов на инфузорий Tetrahymena pyriformis. За 10 суток культивирования инфузорий с помощью прибора БиоЛаТ были построены кривые роста культуры для каждого из модельных растворов.
На втором этапе было проведено исследование жареного мясного продукта на инфузориях, для чего из порции №1 гомогенизированных сосисок (п. 3.2.1) отделили часть в 120 г для исследования ГАА. В течение 20 минут произвели обжарку части образца (100 г) на свином сале при температуре 200С. Жареный продукт исследовали на инфузориях, сравнивая прирост культуры на водной среде жареного продукта с приростом на водной среде исходного продукта.
На первом и втором этапах оценивали морфологию Tetrahymena pyriformis с помощью установки для визуальной оценки изменений формы клеток, показанной на рис. 11.
На третьем этапе, состоящем в аналитическом определении ГАА в модельных растворах и жареном мясном продукте с помощью жидкостной хроматографии, были получены количественные характеристики содержания ГАА в исследуемых образцах.
