Содержание к диссертации
Введение
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
Ф ПОЛ - перекисное окисление липидов
ПОПОП — п-бис[2-(5-фсншюксазоил)]бензол
ППО - 2,5-дифенилоксазол
PI IK - рибонуклеиновая кислота
СОД — супероксиддисмутаза
ТХУ-трихлоруксусная кислота
NBT - тетрапитротетразолиевый синий
^ ДНК - дсзоксирибонуклеиновая кислота
ДНКм - материнские ДНК
ДНКд -дочерниеДНК
НМАО - низкомолекулярные антиоксиданти
МДА - малоновый диальдегид
АО — антиоксидангы
ktl0i — коэффициент общей антиоксидантной защиты
koar— козффициеі IT общей активности генома
крспар - коэффициент репарации
куг коэффициент относительной устойчивости генома
кроили к ~ коэффициент репликации
ктрансл коэффициент трансляции
кпрол ~~ коэффициент продуктивности генома
[митотический индекс]м — нормированное значение митотического шщекса
[включение С-лейцина][д - нормированные значения включения С-лейцина
[включение 3Н-тимидина]м -нормированные значения включения 3Н-тамидина
Dq - значение квазипороговой дозы, Гр
tga - тангенс угла наклона кривой «доза-эффект»
Глава 1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 12
1Л, Стресс и адаптация 12
1.2. Прорастание семян - как адаптация к выживанию вида 18
1.3. Стресс и перекисное окисление липидов 20
1.4. Роль антиоксидантных систем при действии стресса 22
1.4. Ферменты супероксиддисмутаза и пероксидаза 25
1.4.2. Естественные антиоксиданты 28
1.5. Системы обеспечения надежности ДІЖ и репарация генетических повреждений 30
1.6. Устойчивость растений при действии радиации 33
1Л. Устойчивость клеток растений при действии температур 40
L8. Действие нитратов и нитритов на живые организмы 45
1.9. Изменение стресс-реакции растений под действием природных соединений 47
Глава 2, МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 51
2.1 .Характеристика растений 51
2.2. Методы исследования 52
2-2.1 . Методика нанесения физического (теплового и радиацион ного шока) и химического стресса (ионы анионного характера) 52
2.2.2. Посев и наблюдение за прорастанием 53
2.2.3. Оценка радиоустойчивости семян растений 53
2.2.4. Методика определения активности супероксиддисмутазы (СОД) 55
2.2-5. Методика определения активности пероксидазы 56
2.2.6. Определение суммарного содержания низкомолекулярных антиоксидантов 57
2.2.7. Методика определения интенсивности перекисного окисления липидов (ПОЛ) , 59
2.2.8. Методика введения радиоактивной метки 60
2.2.9. Методика определения митотического индекса 61
2.2.10. Комплексный цитолого-биохимический метод дифферен циальной оценки активности генома в процессах репликации, трансляции, репарации и сто устойчивости 62
2.2,1 L Методика определения нитритов 63
2.2.12, Методика определения нитратов 65
2.2.13, Методы, используемые при изучении влияния экстракта рододендрона золотистого (Rhododendron aureum) на адаптивный потенциал растений, подвергнутых острому у-облучению, гипер термии или действию нитратов и нитритов 65
2.2.14, Статистическая обработка результатов 67
Глава 3. ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ И ЦИТОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ПРОРОСТКОВ ДИКОРАСТУЩИХ РАСТЕНИЙ ПРИ ДЕЙСТВИИ ФИЗИЧЕСКИХ СТРЕСС-ФАКТОРОВ (ОСТРОЕ у-ОБЛУЧЕНИЕ И ГИПЕРТЕРМИЯ) НА СЕМЕНА 68
ЗЛ, Годовая динамика всхожести семян, антиоксидантные и ДНК-репарационные системы клеток проростков дескурайнии Софьи и иван-чая узколистного без воздействия стресса **8
3.1.1. Годовая динамика всхожести семян и сезонное изменение аптиоксидантпои защиты проростков дескурайнии Софьи и иванчая узколистного без влияния стресс-факторов "
3-2. Годовая динамика всхожести семян, антиоксидантные и ДНК- репарационные системы клеток проростков дескурайнии Софьи и иван-чая узколистного при остром у-облучении семян 71
3.2.1. Радиочувствительность дескурайнии Софьи и иван-чая узколистного 71
3.2.2. Годовая динамика всхожести семян дескурайнии Софьи и иван-чая узколистного при у-облучении 74
3.2.3- Влияние острого у-облучения на активность антиоксидантных и ДНК-репарационных систем защиты клеток корневой меристемы проростков дикорастущих видов растений ?6
3.3. Годовая динамика всхожести семян, антиоксидантные и ДНК-репарационные системы клеток проростков дескурайнии Софьи и иван-чая узколистного при гипертермии семян 85
3.3.1. Годовая динамика всхожести семян дескурайнии Софьи и иван-чая узколистного при гипертермии 85
3.3.2. Влияние гипертермии на активность антиоксидантиых и ДНК-репарациошшх систем защиты клеток корневой меристемы проростков дикорастущих видов растений 87
Глава 4. ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ И ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ПРОРОСТКОВ ПШЕНИЦЫ СОРТА «ПРИЛЕНСКАЯ-19» ПРИ ДЕЙСТВИИ ХИМИЧЕСКИХ СТРЕСС-ФАКТОРОВ (НИТРАТ-И НИТРИТ-АНИОНЫ) НА СЕМЕНА 9б
4.1. Включение нитрат- и нитрит-анионов в клетки корней проростков и их влияние на энергию прорастания зерновок пшеницы 96
4.2. Влияние нитрат- и нитрит-ал ионов на активность антиоксидант них и ДНК-репарационных систем защиты клеток корневой мери стемы проростков пшеницы ""
Глава 5. ВЛИЯНИЕ ЭКСТРАКТА РОДОДЕНДРОНА ЗОЛОТИСТОГО НА ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ И ЦИТОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ КЛЕТОК РАСТЕНИЙ ПРИ ДЕЙСТВИИ СТРЕСС-ФАКТОРОВ
5.1. Влияние экстракта рододендрона па физиологи чес іше и цитолого-биохимические характеристики клеток растений без действия стресс-факторов 116
5.2. Влияние пред- и постобработки экстрактом рододендрона семян растений на действие разных по природе стресс-факторов 119
5.2.1. Влияние пред- и постобработки экстрактом рододендрона семян дескурайнни Софьи и иван-чая узколистного на действие острого у-облучегшя 119
5.2,2.Влияние пред- и постобработки экстрактом рододендрона семян дескурайнни Софьи и иван-чая узколистного при действии гипертермии 122
5.2.3. Влияние пред- и постобработки экстрактом рододендрона семян пшеницы сорта «Приленская-19» при действии нитратов и нитритов 125
ВЫВОДЫ 129
ЛИТЕРАТУРА 131
- Стресс и перекисное окисление липидов
- . Методика нанесения физического (теплового и радиацион ного шока) и химического стресса (ионы анионного характера)
- Годовая динамика всхожести семян, антиоксидантные и ДНК- репарационные системы клеток проростков дескурайнии Софьи и иван-чая узколистного при остром у-облучении семян
Введение к работе
В связи с загрязнением окружающей среды па фоне глобальных изменений климата в настоящее время повысилась значимость оценки надежности и устойчивости биоты, испытывающей на себе совокупное действие стресс-факторов разной природы и интенсивности. Мониторинг качества среды обитания может проводиться путем определения качественного и количественного состава тех или иных загрязнений физической, химической или биологической природы. Констатацию наличия загрязнителей в среде обитания живых организмов в настоящее время провести сравнительно легко, так как есть достаточно приборов и методик, позволяющих фиксировать присутствие того или иного токсиканта, превышение его содержания над условной нормой — ПДК [Але-кин, 1952, 1973; Макаров и др,3 1990; Максимов, 1993; Захаров и др., 2000; Ко-пырииа, 2002; Блонская и др., 1993, 2003; Шадрина и др., 2001, 2003; и др.]. При птом пе учитывается физиологическое состояние организмов, пределы их устойчивости к действию экотоксикантов и надежности, а также экосистем в целом.
Вместе с тем, вся эволюция живой материи, происходившая в условиях действия па биоту различных экстремальных стресс-факторов, привела к формированию у организмов ряда систем инактивации этих раздражителей, либо повышения устойчивости организмов к ним. Причем многие из этих систем являются относительно неспецифическими, т.е.. сформировавшись в ответ на действие одного стресс-фактора, обеспечивают устойчивость к группе других раздражи гелей.
Поэтому ответная реакция организма и биоты па действие загрязнений окружающей среды будет зависеть не только от природы и количество самого стресс-фактора, но и от активности систем обеспечивающих устойчивость клетки и организма к нему.
По современным представленням в клетке существуют три уровня защиты генетической информации от действия мутагенов - системы аитиоксидант-ной защиты, репарации ДНК и апоптоза [Гродзинский, 1983, 1989; Скальный, Кудрин, 2000; Жимулев, 2003; и др].
Функционирование систем антиоксидантной защиты и репарации ДНК приводит к тому, что ответная реакция организма (биоты) далеко не всегда пропорциональна концентрации (активности) экзогенных и эндогенных токсикантов - мутагенов. Если активность антиоксидантной защиты и (или) репарации ДНК снижена, организм будет испытать выраженный стресс даже при низких концентрациях мутагенов в окружающей среде, за счет накоплений эндогенных мутаций - неисправленных ошибок при репликации ДНК. С другой стороны, если активность систем антиоксидантной защиты и репарации ДНК высокая, накопления закрепленных мутаций в организме может не произойти даже при значительных загрязнениях окружающей среды различными по природе мутагенами.
То есть, для оценки качества среды обитания мало знать уровни (концентрации) тех или иных загрязнений. Необходимо знать активность систем защиты клетки от них, и в первую очередь> относительную устойчивость генома. Поэтому изучение эндогенных защитных систем, сформированных в результате адаптации биоты к существующим условиям обитания, включая антиоксидант-ные и ДНК-репарационные системы в клетках живых организмов, в настоящее время является одной из актуальных задач в экологии и биологии [Филиппов, 2000; Захаров и др., 2000; Журавская, 2001; Кершенгольц, 2002, Кершенгольц и др,, 2003]. Информация об активности антиоксидаптных и ДНК-репарационных систем, скоростях процессов репликации и трансляции, интегральных показателях устойчивости и продуктивности генома может быть полезна для решения и других прикладных экологических и медицинских задач.
Цель данной работы заключается в выявлении роли антиоксидантных и ДНК-репарационных систем, а также биологически активных веществ, их мо-
дифицирующих, в защите меристематических клеток растений от воздействия экотоксикантов на примерах острой у-радиации, повышенной температуры, нитрат- и нитрит-анионов.
В связи с этим были поставлены следующие задачи:
1- Установить взаимосвязь между годовой динамикой всхожести семян и сезонными изменениями антиоксиданти ой защиты клеток проростков деску-райнии Софьи, иван-чая узколистного в нативных условиях и при однократном воздействии на них физических стресс-факторов: острого у-облучения и гипертермии.
Выявить влияние острого у-облучения и гипертермии на активность систем репарации ДНК, дифференциалвную активноств генома в процессах репликации и направленных на трансляцию, относительную устойчивоств и продуктивность генома клеток корневой меристемы проростков дикорастущих видов растений.
Изучить интенсивность всасывания нитрат- и нитрит-анионов в клетки корешков проростков пшеницы сорта «Прилснская-19» и их влияние на физиологические характеристики, уровни антиоксиданти ой защиты и перекисного окисления липидов, дифференциальную активность генома в процессах репликации, трансляции, репарации ДНК, его относительную устойчивость и продуктивность в меристематических клетках корешков проростков пшеницы.
Установить стрссс-модифицирующее влияние комплекса биологически активных веществ экстракта рододендрона золотистого при действии физических и химических факторов па семена растений по следующим критериям: энергия прорастания семян и выживаемость проростков; скорость деления клеток, активность и устойчивость генома, активность систем репарации ДНК, ан-тиоксидантной защиты и перекисного окисления липидов в клетках проростков.
Положения, выносимые на защиту
1. Высокие амплитуда колебаний годовой всхожести семян и сезонная
изменчивость уровня антиоксидантнои защиты ютеток корешков проростков
растений являются показателями большей устойчивости меристематических клеток к действию экологических стресс-факторов.
2. Неспецифический биохимический адаптационный потенциал, вклю
чающий системы антиоксидантнои (ферментативной и низкомолекулярной)
защиты, общую устойчивость и дифференциальную активность генома в про
цессах репликации, репарации ДНК и направленных на трансляцию, определя
ет общую относительную устойчивость растительных организмов к действию
экогоксикантов: острой радиации, гипертермии, нитрат- и нитрит-анионов.
3. Способность комплекса биологически активных веществ экстракта ро
додендрона золотистого активировать антиоксидантные и/или ДНК-
репарационные системы меристематических клеток корней проростков и сни
жать скорость репликации в них позволяет использовать его для модификации
стресс-реакций клеток растительных организмов при действии на них экоток-
сикантов различной природы; лучевой, гипертермической, химической (нит
рит- и нитрат-анионы).
Научная новизна работы
Показана ключевая и взаимодополняющая роль антиоксидантных и ДНК-репарационных систем в формировании устойчивости растительных клеток от токсического действия экологических стресс-факторов: острой радиации, гипертермии, нитрат- и нитрит-анионов.
Установлено, что в рамках ответной реакции растительных клеток на действие исследованных стресс-факторов первоочередными являются изменения биохимических систем, обеспечивающие устойчивость организмов (даже в ущерб их продуктивности) - активация антиоксидантных и/или ДНК-репарационных систем, снижение активности систем репликации (иногда трансляции).
]]
На фоне действия на клетки растений указанных стресс-факторов установлена модифицирующая роль экстракта рододендрона золотистого по отношению к системам антиоксидантной защиты и дифференциальной активности генома, приводящая к повышению их устойчивости.
Практическая значимость работы
Представленные в работе результаты по изучению действия острого радиационного облучения, гипертермии, нитрат- и нитрит-анионов на меристе-матические клетки растений могут быть использованы при проведении экологической экспертизы для оценки состояния биоты и долгосрочных прогнозов ее адаптации к действию широкого спектра техногенных и природных токсикантов и физических стресс-факторов.
Стресс и перекисное окисление липидов
В отсутствие экстремальных эндо- или экзогенных факторов процесс ПОЛ (перекисное окисление липидов) протекает в клетках сбалансировано. Концентрация продуктов ПОЛ удерживается на постоянном низком уровне [Барабой и др., 1992]. АФК и перекиси липидов вовлекаются в нормальный метаболизм клетки, участвуют в синтезе ряда веществ, разборке поврежденных мембранных структур [Бурлаковз, Храпова, 1985], Показано, что О2 ", Н2О2, NO при низких концентрациях являются физиологическими модуляторами в митохондриях, регулируя транспорт Са + [Richter et al., 1995]. АФК участвуют также в лигнификации клеточной стенки, защите растений от микрофлоры [Albert et al., 1986]
Перекиси липидов могут выступать в роли аллостерических факторов, активируя или илгибируя деятельность некоторых ферментов. Кроме того, ПОЛ - процесс, связанный с регуляцией состава и структуры мембран и используется клеткой как механизм регуляции активности мембраносвязанных ферментов [Бурлакова, Храпова, 1985], Предполагается, что ПОЛ в интактных клетках принимает участие в регуляции транспорта веществ через мембрану [Владимиров, Арчаков, 1972]- Стационарность скорости реакций ПОЛ поддерживается антиоксидантиыми системами. В условиях стресса происходит нарушение равновесия про- и апгиоксидантов в клетке.
Многочисленные исследования, проведенные к настоящему времени, не оставляют сомнения в том, что в стрессовых условиях в организме возникают повреждения, связанные с окислительными процессами. Активация реакций ПОЛ наблюдается при стрессах различной природы: интоксикации Оз, S02, N02l ионизирующей и УФ радиации, авитаминозах, гипер- и гипотермии, типе-роксии и гипооксии, засолении, водном дефиците и т.д. [Владимиров, Арчаков, 1972; Козлов, 1973; Иванов и др., 1975; Тарусов, Веселовский, 1978; Меерсон, 1986; Куликов и др., 1988; Мерзляк, 1989; Веселовский, Веселова, 1990; Владимиров и др., 1991; Барабой и др., 1992; Gueta-Dahan et al, 1997; Bohnert, Shev-eleva, 1998].
Далее будут рассмотрены антиоксидантные и ДНК-репарирующие системы клеток организмов, так как они и формируют основной механизм устойчивости организмов к действию разных по природе стрессирующих факторов. 1.4, Роль антиокгсндантных систем при действии стресса
При действии любых стресс-факторов в клетках живых организмов накапливается большое количество свободных радикалов и перекисей, которые способствуют старению и разрушению организма в целом [Меерсон, 1981; Журавлев, 1982; Кузин, 1983]. Как было отмечено выше, организмы способны противостоять действию неблагоприятных факторов (стрессоустойчивость). Защита организма от токсического действия избытка свободных радикалов и различных по природе перекисей на его клетки обеспечивается активацией антиоксидантних систем (рис.Ы) [Кершенгольц, 1996а; Журавская и др., 19976, 2000; Федорова, 1999; Филиппов, 2000; Филиппова, 2003].
Ингибиторы свободнорадикальных реакций (истинные антиоксиданты) -класс веществ, снижающих скорость перекисного окисления. Это вещества, взаимодействующие с радикалами, ведущими цепи окисления, обрывающие эти цепи и (или) замедляющие цепной процесс. Так как растворимость кислорода и активных форм кислорода (АФК) в липидных средах в 7,3-7,5 раз выше» чем в цитоплазме, то наибольшее биологическое значение среди антиоксидантов имеют, по-видимому, жирорастворимые полифенолы: токоферолы, убихиноны, некоторые стероидные гормоны [Козлов, 1966]. По своей химической природе и механизму действия эти вещества близки к наиболее активным синтетическим антиоксидантам, таким как гидрохинон, ионол, нафтолы. В мембранных структурах активность в качестве антиокислителей у этих соединений зависит от их растворимости в липидах [Нейрфах, 1969; Петрусевич, 1966; Владимиров, 1972].
Чрезмерная активация перекисного окисления липидов и превращение его в звено патогенеза важнейших болезней представляет собой явление того же масштаба и значения, что и аналогичное "превращение" стресс-синдрома из звена адаптации в звено патогенеза.
Фактором, предопределяющим такое превращение или, напротив, предотвращающим его, является соотношение прооксидантных и антиоксидантных систем, которое В.Б. Спиричев (1974) удачно определил как "антиоксидантиыи статус организма".
Для клетки в состоянии стресса характерно увеличение содержания анти-оксидангов. При действии УФ радиации в клетках пшеницы накапливается а-токоферол [Веселовский, 19S2], Низкие температуры и гипероксия вызывают многократное увеличение концентрации токоферола в тканях эвглены [Ruggeri et aL, 1985]. Содержание токоферолов в зерне яровой пшеницы увеличивается после воздействия весенних заморозков на 25%, осенних - на 32% [Винтер, 1980]. Считается, что устойчивость растений к озону тем выше, чем больше в тканях содержится СОД. Наряду с СОД при фумигации возрастает количество пероксидазы, аскорбатоксидазы [Веселовский, Всселова, 1990]. В клетках корпя кукуруз в условиях гипотермии также возрастает активность пероксидазы [Акимова, Родченко, 1976]. Таким образом, накопление различных антиокси-дантов можно отнести к проявлению общей неспецифической защитной реакции клетки [Куликов и др., 1988]. Ряд авторов отводят активации ПОЛ роль ключевого звена в патогенезе стресса [Барабой, 1991; Барабой и др., 1992]- В сшпи с этим рассматривают три последовательные фазы развития ПОЛ в рамках стресс-реакции, соответствующие классическим. Во время первой фазы (фаза тревоги) происходит резкая активация липопероксидации. На второй стадии про- и антиокислительное равновесие стабилизируется на уровне, близком к исходному. Ее можно охарактеризовать как стадию резистентности, в ходе которой снижается интенсивность ПОЛ за счет увеличения антиоксидантних ресурсов. Для третьей фазы типична вторичная продукция ПОЛ и соответствующее снижение суммарной антиоксидантной активности. Эту стадию стресса можно рассматривать как проявление определенного истощения антиоксидант-ных ресурсов [Колеспиченко, Войников, 2003].
Методика нанесения физического (теплового и радиацион ного шока) и химического стресса (ионы анионного характера)
Облучение семян проводили у-квантами Сов дозах 0,5,20, 60, 250 Гр; при мощности дозы 18,6 рад/сек в Институте экологии растений и животных УрО РАН (г.Екатеринбург). Контролем служили необлученные семена.
Тепловой шок наносили следующим образом: семена дескурайнии Софьи и иван-чая узколистного подвергли гипертермии на водяном термостате Lauda в диапазоне температур от 40 до 55 С в течение 10 минут-Семена высушили и посеяли в чашках Петри.
В качестве ионов анионного характера для нанесение химического стрес са служили нитрат-, нитрит-анионы. Зерновки пшеницы «Приленская 19» зама чивали в дистиллированной воде в течение 24 часов. После чего проводили по сев в нитратной, или нитритной среде разной концентрации в чашках Петри. В варианте с нитратной средой диапазон концентраций составил от 10 до 250 мМ KN03, а в случае нитритной среды - от 10 до 100 мМ KN02. ZZZ Посев и наблюдение за прорастанием ф Посев проводили в чашки Петри на ватно-фильтровальной подкладке, смоченной дистиллированной водой- Проращивали в комнатных условиях на свету при температуре 20-22 С. Опыты закладывали в четырех повторностях по 50 штук семян в каждой. Критериями оценки действия физических и химических стресс-факторов являлись: а) энергия прорастания семян (7 день - для дикорастущих видов растений, 3 день - для пшеницы); б) всхожесть семян (на 14 день - для дикорастущих растений, 7 день - для пшеницы) [ГОСТ 12038-84]; в) выживаемость - на 35 день только у дикорастущих видов растений,
Известно, что характер кривых «доза-эффект» для разных видов растений в классических (линейных, не логарифмических) координатах разнообразен, сильно варьирует в диапазоне эффективных доз [Ярмоненко, 1977; Кудряшов, Беренфельд, 1982; Гродзинский, 1989]. При этом такой показатель, как полулетальная доза (ЛД5о) не дает полной оценки радиочувствительности. При его использовании часто теряется информация о биохимических и цитологических процессах, протекающих в клетках организмов. Поэтому, радиоустойчивость семян растений (по критериям всхожести, выживаемости на определенных срок наблюдений и др.) анализировалась по методике, предложенной А.Н. Журав-ской(1993). По этой методике дозовая кривая, на основе полученных данных о выжи ваемости одномесячных растений на стадии листообразования и выполненная в натурально-логарифмическом масштабе, была разделена на две части (рис, 2.1). Первая часть (плечо дозовой кривой - АВ) - диапазон доз, в котором со храняется способность организма поддерживать гомеостаз (за счет антиокси Щ дантного статуса и репарирующих систем), несмотря на усиливающееся дейст вие радиационного фактора. Проецируя длину плеча (L) на ось абсцисс полу 54 чали важную количественную характеристику - значение квазипороговой дозы (Dq) [Ярмоненко, 1977; Кудряшов, Ееренфельд, 1982; Гродзинский, 1989]. Вторая часть дозовой кривой (ВС) - характеризовалась обратно пропорциональной зависимостью изучаемого критерия от величины дозы облучения. Количественно эту зависимость оценивали по тангенсу угла наклона (tga) второго участка кривой «доза-эффект», величина которого была тем больше, чем быстрее возрастали (или снижались) наблюдаемые показатели в интервале доз радиации. Наклонный участок дозовой кривой характеризует второй вид устойчивости - резистентность геномных систем клеток организма. -і 1 0,1 5 2,3 3,9 4,3 4,6 6,2 6,9 15 Рис.2.1. Кривая «доза-эффект», выполненная в логарифмических координатах по оса абцисс - In дозы; по оси ординат - In злаченый наблюдаемых параметров. По форме кривой, выполненной в натурально-логарифимических координатах, можно судить о степени радиочувствительности вида, имея в виду антиоксидантный статус, активность и устойчивость репарационных систем клеток исследуемого организма. Такой анализ дает возможность сравнивать между собой разные виды и судить о механизмах (в первом приближении) их устойчивости к действию радиации. Используя значения Dq и tga, можно давать сравнительную характеристику видовой радиочувствительности семян, ко Щ торую мы использовали в своей работе.
Определение активности СОД основано на инактивации супероксидради-кала (т02 ) этим ферментом. Модификация методики заключалась в измерении величины молярного коэффициента экстинкции бисформазановых комплексов ровно через 5 минут после их образования, то есть за время, которое необходимо для измерения активности СОД, Опытная величина молярного коэффициента экстинкции позволила представить активность СОД в международных единицах размерности, удобных для интерпретации и сравнения.
Экстракцию СОД проводили следующим образом. Навеску исследуемого материала (корешки проростков) гомогенизировали в ОД М натрий-карбонатной буферной смеси с рН=10,2. Гомогенат центрифугировали при 3000 g в течение ] 0 минут. Супернатант сливали в пробирку и хранили при температуре 0С, в темноте.
То есть, чем больше активность СОД, тем меньше образуется окрашенного продукта - восстановленного тетранитротетразолиевого синего (NBT восст.) или бисформазана.
Реакционная смесь состояла из следующих растворов: ОД мл (39,05 мкмоль/л) рибофлавина, 0,2 мл (122,3 ммоль/л) метионина, 0,1 мл (1,7 ммоль/л) NBT, 2,5 мл ОД М натрий-карбонатной буферной смеси с рН=10,2 и ОД мл экстракта.
Определяли начальную оптическую плотность при Х=560 нм. Затем кювету с реакционной смесью освещали люминесцентной лампой в течение 5 минут и измеряли (D56o)oni-rT Определение (D56O)KOHTP, проводили также, но без внесения экстракта. Активность СОД (мкмоль/г мин) рассчитывали по формуле: V/ - объем суммарный объем реакционной смеси; V2 - объем буферной смеси, используемый для гомогенизации и экстракции, мл; V3 - объем экстракта, вносимый в реакционную смесь и используемый для анализа, мл; m — масса исследуемого материала, г; Єз&о — молярный коэффициент экстинции бисформазанапри Х = 560нм 3,98« 10 М" cm"
Годовая динамика всхожести семян, антиоксидантные и ДНК- репарационные системы клеток проростков дескурайнии Софьи и иван-чая узколистного при остром у-облучении семян
Для подбора доз облучения семян был проведен анализ радиочувствительности исследуемых двух дикорастущих видов растений. Их семена были облучены у-квантами Со в диапазоне от 0,5 до 500 Гр. Па основе полученных данных выживаемости (на 35 день) проростков построены кривые «доза-эффект» и вычислены значения квазипороговой дозы (Dq) и тангенса угла наклона этих кривых (tga; рис, 3.2. и 3.3.) 72 Установлено, что ответная реакция на действие ионизирующего излучения дескураинии Софьи и иван-чая узколистного отличалась. Значение квазипороговой дозы (Dq) дескураинии Софьи — 67, а у иван-чая узколистного 25 Гр. Тангенс угла наклона кривой «доза-эффект» у иван-чая узколистного lt8, а у дескураинии Софьи - 1,4 (табл. 3.2.).
Сравнивая значения Dq и tqct изученных нами видов растений, можно сделать вывод, что дескурайния Софья является более радиоустойчивым растением (Dq-67 Гр, tqa l,4), чем иван-чай узколистный (Dq 25 Гр, tqct—1,8).
Радиоустойчивость имеет сложный характер зависимости от параметров антиоксидантнои защиты и структурной гетерогенности низкомолекулярньтх антиоксидантов (по значению Dq) и общей активности генома клеток проростков растений (по значению tga) [Журавская, 2001]. Из табл. 3-2. видно, что у дескураинии Софьи высокое значение Dq и значение к№3 больше на 14%, чем у иван-чая узколистного.
Поэтому дескурайния Софья имеет высокое значение Dq (67 Гр), чем иван-чай узколистный (Dq-25 Гр).
Повышенное значение tga у иван-чая узколистного характеризуется более активным (диспергированным) состоянием генома (коаг=1,6), чем у дескураинии Софьи (коаг=1,0) и поэтому его повышенной уязвимостью в интервале высоких доз облучения, в котором основной механизм токсического действия радиации связан, по-видимому, с «теорией мишени» [Тимофеев-Ресовский и др., 1968], Таким образом, дескурайния Софьи является более радиоустойчивым растением (Dq=67 Гр, tqa=l,4), чем иван-чай узколистный (Dq=25 Гр, tqa=l,8). Для дальнейших экспериментальных исследований были выделены дозы у-облучсния семян растений (0,5; 20; 60 и 250 Гр), которые лежат как в области меньше Dq (плечо дозовой кривой - диапазон доз, в котором сохраняется способность организма поддерживать гомеостаз), так и в области больше Dq (вторая часть кривой «доза-эффект» - обратно пропорциональная зависимость изучаемого критерия от величины дозы облучения),. Годовая динамика всхожести семян дескурайнии Софьи и иван-чая узколистного при облучении
Поскольку при сезонных исследованиях была установлена высокая корреляция между всхожестью и характеристиками их антиоксидантных систем [Журавская, 2001], то в экспериментах по влиянию на них стресс-факторов мы, в первую очередь, изучили изменения сезонной динамики всхожести.
На рис. 3.4. и 3.5- представлены кривые, показывающие ход годовой динамики всхожести семян дескурайнии Софьи и иван-чая узколистного, облученных у-квантами в диапазоне доз от 0,5 до 250 Гр. Кривые «доза-эффект» всхожести семян дескурайнии Софьи при всех дозах острого облучения в точности повторяют фазы колебания кривой всхожести семян контроля {пеоблу-ченные семена). При у-облучении дозами 0.5, 20 и 60 Гр изменение всхожести семян достоверно неотличимо от контроля, а облучение дозой 250 Гр привело к снижению ее в фазе "активность", т.е. в январе - па 33% , июле - на 31% и в ноябре - на 35% . В фазе "покой " всхожесть всех облученных семян достоверно не изменилась и колебалась в марте от 1S до 31 %, в июне - 3-9 % и в августе - 6-25%. Кривые, показывающие зависимость динамики всхожести семян иван-чая узколистного от полученной дозы радиации (рис, 3.5), статистически достоверно не отличаются друг от друга. Всхожесть в течение года при всех дозах облучения колебалась от 75 до 96%.
