Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 13
1.1. Микрофлора кишечного тракта рыб 14
1.1.1. Разнообразие кишечной микрофлоры рыб 15
1.1.2. Роль симбионтной микрофлоры, населяющей кишечный тракт рыб 22
1.1.3. Микроорганизмы с неустановленным функциональным значением 24
1.2. Микроорганизмы - возбудители инфекционных заболеваний
внешних покровов рыб 30
1.2.1. Инфекционные заболевания рыб Байкала и озёр Забайкалья 31
1.2.2. Сочетанные инфекции внешних покровов рыб 33
1.3. Особенности экологии лососевидных рыб 37
ГЛАВА 2. Объекты и методы исследований 43
2.1. Характеристика объектов исследования и пробоподготовка 43
2.2. Методы исследования
2.2.1. Молекулярно-генетические методы 45
2.2.2. Методы микроскопического анализа 55
2.2.3. Культивирование на селективных питательных средах 56
2.2.4. Серологические методы 58
ГЛАВА 3. Таксономическое разнообразие кишечной микрофлоры байкальского омуля и хариуса (thymallus) 60
3.1. Разнообразие кишечной микрофлоры байкальского омуля 61
3.2. Разнообразие кишечной микрофлоры рыб рода Thymallus 65
3.3. Сравнительная характеристика кишечной микрофлоры лососевидных рыб 72
ГЛАВА 4. Микоплазмы - специфичные представители микрофлоры рыб рода thymallus 76
4.1. Детекция и распространение генотипа Mycoplasma 76
4.2. Филогенетический анализ генотипа Mycoplasma 78
4.3. Культуральные и морфологические особенности Mycoplasma 83
4.4. Количественная оценка распределения байкальского генотипа Mycoplasma 87
ГЛАВА 5. Молекулярно-генетические исследования состава сообществ микроорганизмов, ассоциированньіх с язвенными поражениями внешних покровов рыб 90
5.1. Сообщества микроорганизмов язв рыб в аквариумных экспозициях 90
5.2. Сообщества микроорганизмов язв рыб озера Байкал 92
5.3. Сообщества микроорганизмов язв рыб озера Арахлей 95
Заключение 98
Выводы 100
Список литературы
- Разнообразие кишечной микрофлоры рыб
- Молекулярно-генетические методы
- Разнообразие кишечной микрофлоры рыб рода Thymallus
- Культуральные и морфологические особенности Mycoplasma
Введение к работе
Актуальность проблемы. Согласно многочисленным исследованиям в области микробной экологии, большинство бактерий в природных экосистемах существуют в сообществах, так как это облегчает доступ питательных веществ, способствует метаболической кооперации организмов и защищает клетки от негативного воздействия окружающей среды. Ассоциированная микрофлора присутствует в различных органах и тканях рыб, а ее качественные и количественные характеристики часто отражают характерные особенности окружающей среды.
В последнее время усилился интерес исследователей к микрофлоре кишечного тракта (КТ) рыб (Кузьмина, 2005; Извекова и др., 2007; Austin, 2002 и др.). Благодаря этим работам утвердилось представление, что она является жизненно необходимым компонентом КТ, зависящим от возраста, типа питания и экологических условий местообитания рыб. Исследование разнообразия кишечной микрофлоры рыб позволяет классифицировать микроорганизмы как автохтонные или собственные, и как аллохтонные или транзиторные. Специфичная кишечная микрофлора состоит из аэробных, факультативных и облигатных анаэробных бактерий.
Филогенетическая идентификация отдельных микроорганизмов в сообществах без культивирования является мощным инструментом в комплексном изучении микрофлоры рыб, так как с помощью этих методов можно получить характеристику видового состава всей ассоциированной микрофлоры, включая и некультивируемые бактерии. В настоящее время молекулярными методами получены нуклеотидные последовательности фрагментов гена малой субъединицы рибосомной РНК (16S рРНК) представителей рода Mycoplasma непосредственно из КТ различных видов рыб (Holben et al, 2002; Moran et al., 2005; Bano et al, 2007; Kim et al, 2007; Ward et al, 2009). Функциональное значение этих прокариотических организмов пока не установлено, но авторы предполагают, что микоплазмы могут являться составной и неотъемлемой частью кишечной микрофлоры рыб.
Микрофлора рыб и разнообразие ихтиопатогенов водоемов и водотоков Восточной Сибири недостаточно изучены. Известно, что районными ветеринарными станциями проводятся микробиологические исследования, основная задача которых - определить основные этиологические агенты инфекционных болезней рыб (Хандажапова и др., 2005; Цыбиков и др., 2009). В последнее время периодически возникают вспышки заболеваний рыб в заливах Байкала, озерах Республики Бурятия и Ивано-Арахлейской водной системы, которые приводят к их массовой гибели (Елизов, 2006; Михеев, Матюгина, 2010).
Цель исследования - изучить состав, структуру и разнообразие микробных сообществ, ассоциированных с лососевидными рыбами озера Байкал и некоторых водоемов Восточной Сибири.
Задачи исследования:
1. Определить доминирующие генотипы микроорганизмов и провести
сравнительный молекулярно-генетический анализ разнообразия кишечной
микрофлоры лососевидных рыб с разной пищевой стратегией на примере
байкальского омуля и представителей рода Thymallus.
2. Охарактеризовать Mycoplasma sp. как специфического представителя
микробного сообщества кишечника черного байкальского хариуса, с
помощью комплекса молекулярно-генетических, микроскопических и
серологических методов и оценить распространение этого
микроорганизма в различных видах лососевидных рыб.
3. Определить доминирующие генотипы и генетическое разнообразие
сообществ микроорганизмов, ассоциированных с язвенными
поражениями внешних покровов рыб в аквариумных экспозициях и
естественных водоемах Восточной Сибири.
Научная новизна. Впервые определён спектр доминирующих генотипов в кишечной микрофлоре байкальского омуля и черного байкальского хариуса, среди которых присутствуют бактерии, относящиеся к автохтонной и аллохтонной микрофлоре. Показано, что основной состав таксономических групп у омуля и хариуса одинаков, однако у рыб рода Thymallus дополнительно детектируются представители филы Spirochaetes и Mycoplasma sp. Впервые в составе кишечной микрофлоры черного байкальского и ленского хариусов определены генотипы Brevinema sp. и Mycoplasma sp. Установлено, что заболевания внешних покровов рыб из аквариумных экспозиций и естественных водоемов Восточной Сибири вызваны ассоциациями микроорганизмов, определены генотипы доминирующих ихтиопатогенов.
Практическая значимость полученных результатов. Разработан комплекс методов, позволяющих быстро и корректно проводить идентификацию и детекцию микроорганизмов, ассоциированных как с внешними покровами, так и с внутренними органами рыб.
Изучено разнообразие ассоциированной микрофлоры некоторых представителей подотряда лососевидных рыб (Salmonoidei), в который входят ценные промысловые виды, использующиеся для акклиматизации в различных водоемах и являющиеся объектами искусственного воспроизводства. Результаты исследования могут быть использованы для контроля и коррекции питания рыб в аквакультуре.
Поставлены методы детекции байкальского генотипа Mycoplasma на разработанных генотип-специфичных прайм ерах на ген 16S рРНК и район ITS. Полученные результаты могут быть востребованы при выявлении генотипа Mycoplasma в гидробионтах.
Определены генотипы региональных ихтиопатогенов, детекция которых необходима для профилактики и терапии заболеваний рыб, особенно в условиях аквакультуры. Полученные нуклеотидные последовательности фрагментов рибосомных генов могут быть использованы для разработки групп- и видо-специфичных праймеров и зондов для быстрой детекции
бактерий, вызывающих заболевания внешних покровов рыб естественных и искусственных популяций.
Основные положения, выносимые на защиту:
Состав аллохтонной микрофлоры кишечника рыб специфичен для мест обитания и в значительной степени определяется разнообразием сообществ микроорганизмов воды. Автохтонная микрофлора кишечника рыб более видоспецифична.
Mycoplasma sp. - специфичный представитель автохтонной микрофлоры некоторых видов лососевидных рыб Байкальского региона.
Использование молекулярно-генетических методов для определения состава сообществ микроорганизмов, ассоциированных с язвенными поражениями внешних покровов рыб, является решением проблемы детекции инфекционных агентов, вызывающих эти заболевания.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы представлены на международных и российских конференциях и симпозиумах: Всероссийской конференции молодых ученых «Экология в современном мире: взгляд научной молодежи» (Улан-Удэ, апрель 2007 г.); молодёжной научной конференции «Молодёжь и наука Забайкалья» (Чита, декабрь 2008 г.); II Всероссийском конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз Россия - 2009» (Пермь, май 2009 г., диплом I степени); The 13th Symposium for Biology Student of Europe «SymBioSe 2009» (Kazan, July-August 2009); Всероссийской конференции молодых ученых, посвященной 90-летию со дня рождения академика П.Л. Горчаковского «Экология: от южных гор до северных морей» (Екатеринбург, апрель 2010 г.); III Всероссийском конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз Россия-2010» (Нижний Новгород, май 2010 г.); Всероссийской конференции с международным участием «V Верещагинской байкальской конференции» (Иркутск, октябрь 2010 г., диплом I степени); IV Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз-Россия - 2011» (Воронеж, май 2011 г., диплом I степени).
Публикации. По результатам исследования опубликована 31 научная работа, из них 7 - статьи, из которых 6 из списка ВАК, 1 - глава в монографии, 1 - методическое пособие и 22 - тезисы конференций.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов, списка литературы и приложений. Работа изложена на 138 страницах, содержит 5 таблиц и 18 рисунков. Список литературы включает 232 наименования, из которых 57 - российских и 175 -зарубежных изданий.
Реализация и внедрение результатов исследования. Теоретические положения, результаты исследований и рекомендации использованы при подготовке научно-исследовательских отчетов по следующим проектам: бюджетной теме № VI.51.1.9 (рук. Парфенова В.В., гос. per. № 01201052128); гранта РФФИ-Байкал № 05-04-97221 (рук. Дзюба Е.В.); Программе РАН № 27.13 (рук. Дзюба Е.В.); инновационному проекту СО РАН (рук. Белькова Н.Л.) и Государственному контракту № 16.512.11.2075 (рук. Дзюба Е.В.).
Благодарности. Автор выражает глубокую признательность научному руководителю к.б.н., доценту Н. Л. Бельковой и научному консультанту к.б.н. Е. В. Дзюба за помощь в организации и проведении исследований. За оказанную помощь при выполнении работ и обсуждении результатов благодарю сотрудников отдела микробиологии, лабораторий ихтиологии, аналитической биоорганической химии, геносистематики и отдела ультраструктуры клетки Лимнологического института СО РАН. Отдельную благодарность выражаю заведующей Центром лабораторной диагностики «Мечников» (ИГМУ, Иркутск) Г.Ю. Коган и сотруднику Т.И. Никифоровой, а также заведующей центром по микоплазмозам д.б.н. И.В. Раковской и сотрудникам центра ФГБУ «НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи» (г. Москва) за оказанную помощь в работе по изучению микоплазм. Выражаю благодарность Н.А. Докучаеву (с. Петропавловское, Киренский район) и главному ветеринарному врачу Киренского района Х.Х. Эрбиеву за помощь в сборе материала на реке Чечуй (бассейн реки Лена). Особую благодарность приношу своим родным за моральную и финансовую поддержку.
Разнообразие кишечной микрофлоры рыб
Изучение разнообразия кишечной микрофлоры проводят методами, различающимися по способу детекции или визуализации целевого объекта, поэтому описание состава микроорганизмов в кишечнике разных видов рыб, охарактеризованное разными авторами, сильно отличается [30, 69, 79, 99, 101, 105, 117, 127, 142, 172, 218 и др.]. Так, методы культивирования на селективных питательных средах позволили охарактеризовать отдельные физиологические группы микроорганизмов, показать большое разнообразие молочнокислых и сапрофитных бактерий в кишечнике рыб [77 115 159 1961 Для количественной характеристики микробного разнообразия используются методы световой микроскопии [182], а электронной микроскопией показано не только присутствие бактериальных клеток в пищеварительном тракте рыб, но и уточнена их локализация [101, 105, 121]. Для идентификации некультивируемых микроорганизмов активно применяются современные молекулярно-генетические подходы [77, 93, 119, 120, 218 и др.]. В последнее время в научной литературе все чаще стали появляться результаты исследований кишечной микрофлоры рыб, полученные с помощью комплексного использования методов культивирования на селективных питательных средах и молекулярно-генетического анализа микробного сообщества в целом. Большинство авторов отмечают различия в составе доминирующей микрофлоры полученные этими двумя подходами. Так, традиционными микробиологическими методами показано большое разнообразие культивируемой кишечной микрофлоры, а изучение генетического разнообразия выявило что в целом оно очень просто и доминирует небольшое число филотипов. Для рыб, обитающих в пресных водах, это такие организмы как Acinetobacter, Aeromonas, Mycoplasma, Pseudomonas и Spirochaeta [174, 198]. Для морских рыб - это представители родов Mycoplasma и Clostridium [99, 155, 174, 223]. Филогенетическая идентификация отдельных микроорганизмов в сообществах микроорганизмов без культивирования является мощным инструментом в комплексном изучении микрофлоры рыб, особенно на начальном этапе этих исследований так как с помощью этих методов можно получить характеристику видового состава всей ассоциированной микрофлоры, включая и некультивируемые группы бактерий. Это позволяет определить наиболее значимые в функциональном отношении группы микроорганизмов и более целенаправленно выбрать методики выделения отдельных физиологических групп органотрофных бактерий на
Известно, что рыбы имеют специфичную кишечную микрофлору, состоящую из аэробных, факультативно анаэробных и облигатных анаэробных бактерий, причем состав микроорганизмов зависит от возраста. типа питания и экологических условий местообитания. Одной из самых распространенных групп автохтонных микроорганизмов, населяющих КТ, являются культивируемые молочнокислые бактерии. Наличие представителей этой группы показано в различных органах рыб на разных стадиях их развития [24, 196]. Ввиду того, что молочнокислые бактерии в перспективе имеют биотехнологическое применение в качестве пре- и пробиотиков, особое место исследователями уделено микроорганизмам, выделяемым из кишечника рыб - основных объектов мари- и аквакультуры: карпа {Cyprinus carpio), амурского сома (Parasilurus asotus) и др. Среди молочнокислых бактерий интерес представляют представители следующих родов: Carnobacterium, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc и Streptococcus [60, 97, 196, 221, 224]. Исследования культивируемых молочнокислых микроорганизмов показали что их разнообразие состав и количество в КТ зависит от целого ряда факторов таких как качественные и количественные показатели питания, химический и температурный режимы воды, загрязненность окружающей среды и др. [196].
Еще одной группой культивируемых микроорганизмов являются спорообразующие бактерии филогенетической линии Firmicutes. Показано, что они являются постоянной составной частью микрофлоры карпа и радужной форели {Parasalmo mykiss\ выращиваемых в садках и бассейнах со сбросовыми водами [49]. В содержимом КТ этих рыб среди спорообразующих аэробных мезофильных и термофильных бактерий преимущественно определены виды Bacillus pulvifaciens, В. laterosporus. В кишечном тракте сеголеток весной представители рода Bacillus содержатся в небольших количествах (10 кл/г вл. м.). Количество спорообразующих бактерий возрастает до 107-108 кл/г вл. м. в летний период и до 109 кл/г вл. м. - в йсенний перио1. Одним из основных фактород, влияющих на сод-рвание мийрофлоры кишечника, является хнтенсивное питание рыбы в этот иериок. Кроме спорообр,зующих бактерий авторани были выделенп и идентифицированы молочнокислык бактерии, дрожжи, и также представители гетеротрофной микрофлоры Stenotrophomonas maltophilia (сип. Alcaligenes bookeri), Citrobacter (сип. Escherichia) freundii, Parasporobacterium aerofaciens, Pseudomonas aeruginosa, Aeromonas (сии. Pseudomonas) caviae, Pseudomonas boreopolis и P.fluorescens [49].
Сравнительные исследования литературных данных по разнообразию кишечной микрофлоры у морских и пресноводных рыб показали, что аэробная микрофлора их кишечника сходна с таковой внешних покровов, жабр и пищи [31]. Отмечено, что у представителей семейства лососевых (Salmonidae) преобладают виды родов Acinetobacter, Aeromonas и Enterobacter, у карпа - Bacillus, у судака (Stizostedion lucioperca) -Achromobacter, Proteus и Pseudomonas, у личинок кумжи (Salmo truttd) -Flavobacterium и Pseudomonas, у белого толстолобика {Hypophtalmichthis molitris) - Achromobacter, Aeromonas и Micrococcus, у обиттющих в прудах карпа, серебряного карася (Crassius auratus), белого амура {Ctenopharyngodon idella) и линя {Tinea tinea) - Aeromonas и Pseudomonas. В кишечнике ряда пресноводных рыб - щуки (Esox lucius), леща (Abramis brama), плотвы (Rutilus rutilus) и окуня (Perca fluviatilis), обитающих в Волге, чаще встречаются микроорганизмы родов Bacillus, Pseudomonas, а также кокковые формы, коринебактерии и микромицеты.
Молекулярно-генетические методы
Селективная инактивация ДНК мертвых клеток. К пробе объемом не более 100 мкл добавляли ЭМА до конечной концентрации в растворе 100 мкг/мл, пробирки помещали в ледяную баню (около 0С) и выдерживали при освещении (1000 Вт) 60 с. После этого биологический материал использовали для выделения ДНК.
Выделение суммарной ДНК на сорбентах проводили с помощью наборов ДНК-сорб В и РИБО-сорб по прилагаемым к наборам инструкциям производителя (ФГУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва). К образцу объемом около 100 мкл добавляли лизирующий буфер в соответствии с инструкцией, тщательно перемешивали. Для удаления клеточного дебриса лизат центрифугировали 5 мин при 12000 об/мин. Надосадочную жидкость переносили в новую пробирку и добавляли к ней 25 мкл сорбента. Взвесь тщательно суспендировали на вортексе и выдерживали при комнатной температуре 5 мин периодически перемешивая. Затем центрифугировали 30 с при 12000 об/мин, супернатант удаляли. Далее проводили серию отмывок буферами строго по инструкции. После последней отмывки взвесь центрифугировали 2 мин при 12000 об/мин, супернатант удаляли и осадок подсушивали 30 мин при 60С. Осадок хранили при 4-10С до элюции нуклеиновых кислот. Нуклеиновые кислоты элюировали в 50 мкл безнуклеазной стерильной воды или ТЕ-буфера (10 мМ трис-HCl, рН 7,5; 1 мМ ЭДТА). Для этого осадок тщательно суспендировали, прогревали в термостате 5 мин при 60С и центрифугировали 5 мин при 12000 об/мин. Надосадочную жидкость тщательно, без сорбента, отбирали в новую пробирку и использовали в качестве матрицы в ТТТТР.
Выделение суммарной ДНК методом модифицированной очистки с цетилтриметиламмония бромидом (ЦТАБ, цетавлон) [12]. Для выделения ДНК к 100 мкл образца в ТЕ-буфере добавляли 100 мкл лизирующего буфера с ЦТАБ (10 мМ трис-HCl, рН 8,0; 1,4 М NaCl; 20 мМ ЭДТА; 2% ЦТАБ), гомогенизировали 10 мин при 60С, затем добавляли еще 150 мкл этого буфера и выдерживали 30 мин при 60С, периодически перемешивая. Смесь центрифугировали в течение 5 мин при 12000 об/мин, супернатант переносили в новую пробирку, а осадок промывали 100 мкл лизирующего буфера. Супернатанты объединяли и добавляли 5 мкл протеиназы К (10 мг/мл), смесь инкубировали 30 мин при 60С. Затем добавляли 1 мл 1% ЦТАБ, перемешивали и осаждали цетавлоновую соль нуклеиновых кислот с помощью замораживания-оттаивания. Осадок собирали центрифугированием в течение 15 мин при 12000 об/мин, дважды промывали 300 мкл 1% ЦТАБ. Супернатант удаляли, а осадок подсушивали и экстрагировали этанолом (2 раза по 400 мкл) 10 мин при 60С, отделяли супернатант центрифугированием в течение 30 мин при 12000 об/мин. К объединенному супернатанту добавляли 80 мкл ЗМ ацетата натрия (рН 5,0) и выдерживали ночь при -20С для осаждения нуклеиновых кислот. ДНК осаждали центрифугированием при 12000 об/мин в течение 30 мин, промывали 70% этанолом, подсушивали при комнатной температуре и растворяли в ТЕ-буфере.
Выделение суммарной ДНК методом ферментативного лизиса с фенол-хлороформной экстракцией [4]. К 100 мкл образца добавляли 300 мкл ТСБ (рН 8,0) с лизоцимом (10-20 мг/мл) до конечной концентрации лизоцима 5 мг/мл. Лизис вели 15-60 мин при 37С. Затем добавляли 25 мкл протеиназы К (10 мг/мл) и инкубировали еще 15-30 мин при 60С. Добавляли 10% додецилсульфата натрия (ДСН) до конечной концентрации 1% в растворе и выдерживали 10 мин при комнатной температуре. Белки и полисахариды экстрагировали фенолом и хлороформом. Для этого к водной фракции добавляли равный объем фенола, насыщенного трис-НС1 (рН 8,0), суспензию взбалтывали 10-15 мин и центрифугировали при 12000 об/мин 10 мин. Для дальнейшей работы верхнюю водную фазу тщательно отбирали, не захватывая интерфазу, и далее экстрагировали равным объемом смеси фенол-хлороформ (1:1) и центрифугировали 10 мин при 12000 об/мин. Затем водную фазу обрабатывали равным объемом хлороформа. После экстракции макромолекул к водной фазе добавляли 1/10 объема ЗМ ацетата натрия (рН 5,0) и 2 объема абсолютного этанола. ДНК осаждали в течение ночи при -20С, собирали центрифугированием при 12000 об/мин в течение 30 мин. Для удаления солей осадок промывали 400 мкл 70% холодного этанола, еще раз центрифугировали. Надосадочную жидкость удаляли осадок подсушивали на воздухе и растворяли в ТЕ-буфере или безнуклеазной стерильной воде.
Выделение плазмидной ДНК с исследуемым фрагментом проводили коммерческим набором AxyPrep Plasmid Miniprep Kit (Axygen, США). Для выделения плазмидной ДНК брали 100-150 мкл клеточной суспензии, добавляли 250 мкл буфера S1, перемешивали на вортексе. Затем вносили 250 мкл буфера S2, инкубировали при комнатной температуре 5 мин, мягко перемешивая до просветления раствора. На следующем этапе добавляли 350 мкл буфера S3, мягко перемешивали, центрифугировали на настольной центрифуге 10 мин при 12000 об/мин. Полученный супернатант наносили на колонку, центрифугировали 1 мин при 12000 об/мин. Проводили серию отмывок буфером W1, фильтрат удаляли центрифугированием. Для элюции ДНК добавляли 70 мкл элюента, инкубировали 5 мин при комнатной температуре, центрифугировали при 12000 об/мин 1 мин. Концентрацию полученной плазмидной ДНК измеряли на спектрофотометре NanoVue (GE Healthcare, Великобритания). Количество молекул плазмиды (мол./мкл) рассчитывали исходя из известных концентраций для двухцепочечных фрагментов ДНК [199].
Дизайн специфичных праймеров на байкальский генотип Mycoplasma разрабатывали на основе сравнения 224 последовательностей гена 16S рРНК представителей рода Mycoplasma из международной базы данных с полученными в данной работе 32 нуклеотидными последовательностями. Все последовательности микоплазм выравнивали при помощи программы ClustalW v. 1.4. В редакторе последовательностей BioEdit отмечали фрагменты ДНК, консервативные внутри целевой группы и отличающиеся от других видов микоплазм, которые затем проверяли на способность к образованию шпилек и димеров с помощью программы OligoCalc [139] при условии, что для образования этих структур достаточно трех нуклеотидов. Температуру отжига праймеров в ПЦР рассчитывали с помощью программ OligoCalc и PerlPrimer. Разработано четыре праймера на байкальский генотип Mycoplasma (табл. 2).
Дизайн специфичного праймера на межспейсерный район ITS представителей рода Mycoplasma разрабатывали на основе сравнения 10 последовательностей этого района и начала гена 23 S рРНК представителей рода Mycoplasma из международной базы данных с полученными в данной работе 6 нуклеотидными последовательностями (прил. 1).
Разнообразие кишечной микрофлоры рыб рода Thymallus
Групп-специфичная ПЦР не выявила особенных отличий в структуре микробных сообществ кишечной микрофлоры омуля трех МЭГ в весенний период (рис. 5). Детектируется одинаковый спектр следующих таксономических групп: Proteobacteria (классы Alpha и Beta), Actinobacteria, Bacteroidetes, Planctomycetes и Firmicutes. Не были детектированы представители филы Spirochaetes и байкальский генотип Mycoplasma. В осенний период у омуля прибрежной МЭГ сохраняется такой же широкий спектр таксонов, в то время как у омуля придонно-глубоководной МЭГ разнообразие существенно ниже; не были детектированы представители класса Betaproteobacteria, фил Actinobacteria и Bacteroidetes (рис. 5). Известно, что наиболее заметно выражены сезонные изменения в питании омуля, который обитает в прибрежной зоне озера, где абиотические условия среды (температура, прозрачность и др.) очень изменчивы, вследствие чего меняется состав кормовой базы. В летне-осенний период в пищевом спектре прибрежного омуля отмечаются кладоцеры, донные амфиподы, моллюски [7]. Придонно-глубоководный омуль в течение всего года обитает на значительных глубинах, где условия среды более стабильны. В его рационе сезонные изменения выражены незначительно.
Изучение кишечной микрофлоры черного байкальского хариуса из озера Байкал в весенний период с помощью групп-специфичной амплификации показало, что основной спектр таксономических групп совпадает с таковым у омуля в весенний период, дополнительно у хариуса детектируются представители филы Spirochaetes и байкальский генотип Mycoplasma (рис. 6).
Электрофореграмма ампликонов с суммарной ДНК, выделенной из кишечника байкальского омуля трех морфо-экологических групп в весенний (А, Б, В) и осенний (Г, Д) периоды на групп-специфичных праймерах: EUB - универсальные на ген 16S рРНК (900 П.Н.); ARC - Archaea (600 п.н.); ALF - класс Alphaproteobacteria (400 п.н.); BET - класс Betaproteobacteria (350 п.н.); GAM - класс Gammaproteobacteria (800 п.н.); ACT - фила Actinobacteria (640 п.н.); CF -фила Bacteroidetes (1050 п н V CYA - фила Cyanobacteria (650 п н ); PLA -фила Planctomycetes (420.пн у BLS фила Firmicutes 400 п н ); SPI -фила Spirochaetes (500 п н V Мус - байкальский генотип Mycoplasma (150 п н ); М-маркер молекулярного веса Рис. 6. Электрофореграмма ампликонов с суммарной ДНК, выделенной из кишечника черного байкальского хариуса из оз. Байкал в весенний период на групп-специфичных праймерах: EUB -универсальные на ген 16S рРНК (900 п.н.); ARC - Archaea (600 п.н.); ALF - класс Alphaproteobacteria (400 п.н.); БET - класс Betaproteobacteria (350 п.н.); GAM - класс Gammaproteobacteria (800 п.н.); ACT - фила Actinobacteria (640 п.н.); CF - фила Bacteroidetes (1050 п.н.); CYA - фила Cyanobacteria (650 п.н.); PLA - фила Planctomycetes (420 п н V BLS - фила Firmicutes (400 пн SPI - фила Spirochaetes (500 пн); Мус - байкальский генотип Mycoplasma (150 пнУ М - маркер молекулярного веса.
Показано, что отличительной особенностью состава кишечной микрофлоры черного байкальского хариуса из аквариумной экспозиции Байкальского музея ИНЦ СО РАН является невысокий спектр доминирующих групп микроорганизмов и отсутствие строго аэробных форм, которые можно было бы с уверенностью классифицировать как привнесенную, аллохтонную микрофлору. Несомненно, это вызвано регулярной дезинфекцией воды в аквариумных экспозициях, предотвращающей рост широко распространенных, водных гетеротрофных микроорганизмов и специфичностью питания рыб (замороженный рыбный фарш). Микроорганизмы в ассоциациях, в том числе в составе кишечной микрофлоры, формируют устойчивые сообщества, способные существовать неопределенно долго за счет поступающей извне энергии. Устойчивое микробное сообщество функционирует как единый организм, выполняет комплекс биохимических реакций и не имеет внутренних причин для остановки своей деятельности. Условием устойчивости сообщества является замкнутость циклов биогенных элементов, позволяющая существовать стабильно и поддерживать энергетический баланс. Постоянство поступающих извне питательных компонентов предполагает развитие кооперации или специализации среди микроорганизмов, уменьшение конкуренции за питательные ресурсы, следовательно уменьшение числа таксономических единиц в микробном сообществе, как это наблюдается в составе кишечной микрофлоры омуля придонно-глубоководной МЭГ и хариуса из аквариумной экспозиции. Переход макроорганизма на другой тип питания сопровождается изменением пищевого спектра, появлением новых пищевых компонентов и, как следствие увеличением разнообразия микроорганизмов это подтверждается результатами анализа микрофлоры КТ осенних популяций омуля прибрежной и придонно-глубоководной МЭГ. Пищевые спектры рыб достаточно широки во всех исследуемых водоемах но качественный состав кормовых объектов составляющих основу их питания различен.
Культуральные и морфологические особенности Mycoplasma
Использованная в работе система праймеров, специфичная для филы Bacteroidetes, позволяет амплифицировать до 75% известных представителей рода Flavobacterium, среди которых известен целый спектр патогенных для рыб микроорганизмов Flavobacterium psychrophilum, F. columnar е и F. branchiophilum. F. psychrophilum (син.: Cytophaga psychrophila, Flexibacter psychrophilus) первоначально определен как типичный патоген, вызывающий язвы на теле и гниль плавников лососевых рыб при низких температурах (бактериальная холодноводная болезнь, англ. «visceral myxobacteriosis» и/или «bacterial cold water disease» (ВСWD), Coldwater Disease (CWD)) [143]. Инфицированные рыбы, как правило имеют повреждения внешних покровов тела разрушенные плавники и/или обширные эрозии хвостового плавника приводящие к обнажению мышц и позвоночника [ПО]. Болезнь у рыб обычно возникает при температуре воды 4-10С [21]. Она детектирована практически повсеместно в Северной Америке, Великобритании, Европе и некоторых частях Океании, особенно в пресноводных лососевых и форелевых хозяйствах, температура воды в которых ниже 15С. Установлены горизонтальные и вертикальные пути передачи инфекции, потенциальным источником которой, являются больные и мертвые рыбы [217]. Смешанные инфекции, вызванные вирусными, бактериальными, паразитарными возбудителями и F. psychrophilum, часто наблюдаются у различных видов рыб. Известны случаи инфицирования радужной форели F. psychrophilum и вирусом инфекционного панкреонекроза (англ. «Infectious Pancreatic Necrosis virus»). F. psychrophilum часто встречается в сочетании с вирусом инфекционного гемопоэтического некроза (англ. «infectious hematopoietic necrosis virus») и грибами [193].
Многие виды рода Aeromonas патогенны для позвоночных животных. Заболевания рыб, вызванные Aeromonas spp., в аквакультуре характеризуются высокой летальностью. Септицемия, вызываемая подвижными аэромонадами {A. hydrophila (сип. A. liquefaciens), А. hydrophila subsp. dhakenis, A. jandaei, A. bestiarum, A. veronii, A. sobria {A. sobria biovar sobria и A. veronii biovar sobria)), отмечена у многих видов пресноводных рыб [73]. Однако некоторые исследователи ставят под сомнение роль A. hydrophila как возбудителя заболевания, так как в некоторых случаях его присутствие в тканях рыб определяется только в качестве вторичного инфекционного агента [73]. Тем не менее, есть данные о развитии тяжелых поражений кожи у О. mykiss, инфицированной Aeromonas spp. при температуре воды 4С, которые начинаются с появления локализованных депигментированных пятен, окруженных гиперемированными зонами, и приводят в итоге к потере чешуи, отторжению некротизированных тканей и образованию язв [193].
Представители рода Saprolegnia (S. parasitica, S. diclina, S. monoica и S. ferax) часто рассматриваются не как сапрофиты, а как паразиты различных видов пресноводных рыб [165]. Они являются наиболее важными патогенами, так как вызванные ими заболевания приносят серьезный экономический ущерб аквакультуре рыб, а также способствуют снижению диких популяций лососевых по всему миру [149]. Изоляты Saprolegnia из лососевых рыб растут и воспроизводятся при низких температурах воды [167]. Фактором, способствующим заболеванию, является снижение иммунитета рыб в результате травмы, различных форм стресса и общего эндокринного статуса, а развитие инфекции может сильно варьировать из-за разницы в вирулентности отдельных штаммов Saprolegnia [158, 167].
Особенности экологии байкальского омуля в сочетании с физиологическим состоянием рыб после длительного подледного периода при низкой интенсивности питания, с высокой численностью гетеротрофов в устьевых и присклоновых зонах и с оптимальной температурой воды для развития возбудителя, вероятно, являются факторами, способствующими возникновению и передаче инфекций внутри нагульных стад.
Проведена молекулярно-генетическая идентификация микроорганизмов, вызвавших эпизоотию в популяции окуня озера Арахлей. Анализ соскобов внешних покровов больных рыб выявил представителей родов Aeromonas salmonicida, A. veronii, Flavobacterium psychropMum и Saprolegnia parasitica (прил. 2).
Определены два генотипа, имеющие среди ближайших родственников филогенетически удаленные патогенные штаммы аэромонад (рис. 17). Клон Yal-6 близок A. salmonicida, т.к. его последовательность формирует общий кластер с последовательностями типовых штаммов Aeromonas этого вида, несмотря на отличия в консервативной области 730-752 п.н. (по 16S рДНК A. salmonicida subsp. pectinolytica DSM 12609 , AF134065). Это широко известные патогенные для рыб штаммы, которые вызывают системные и язвенные болезни у многих промысловых видов рыб. Последовательность Yal-3 кластеризуется с типовыми штаммами Aeromonas ichthiosmia DSM 6393 (Х71120) и Aeromonas veronii bv. veronii АТСС 35624 (Х60414). Эти штаммы признаны конспецифичными на основе полученных ранее молекулярных данных: филогенетического анализа по гену малой субъединицы РНК [87], ДНК-ДНК гибридизации [126] и результатов анализа полиморфизма длин амплифицированных фрагментов (ПДАФ) [123].
