Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 13
1.1 Диарейные токсины моллюсков 13
1.1.1 Диарейные токсины моллюсков в системе классификации фикотоксинов 13
1.1.2 Общая характеристика токсинов группы окадаевой кислоты 14
1.1.3 Биологическая роль диарейных токсинов моллюсков 16
1.2 Продуценты токсинов 19
1.2.1 Характеристика видов рода Dinoph ysis как продуцентов токсинов 19
1.2.2 Характеристика видов рода Prorocentrum как продуцентов токсинов 22
1.3 Передача и трансформация ДТМ в экологических сетях 27
1.3.1 Передача токсинов группы ОК в пищевой цепи 27
1.3.2 Трансформация токсинов в процессе передачи по пищевой цепи 30
1.4 Методы качественной и количественной оценки ДТМ 32
1.4.1 Биологическое тестирование 33
1.4.2 Конкурентный иммуноферментный анализ 34
1.4.3 Ингибирование серин/треониновых фосфатаз 35
1.4.4. Высокоэффективная жидкостная хроматография ДТМ 36
1.5 Контроль и регулирование ДТМ в пищевых продуктах 41
1.5.1 Случаи отравления людей ДТМ 41
1.5.2 Нормы регулирования и мониторинга ДТМ в пищевых продуктах 43
Глава 2. Экспериментальная часть 45
2.1 Краткая характеристика района работ 45
2.2 Материалы 47
2.2.1 Реактивы 47
2.2.2 Отбор особей мидии Грея C. grayanus 48
2.2.3 Извлечение мягких тканей мидии Грея C. grayanus 48
2.2.4 Отбор проб фитопланктона и подсчет клеток Dinophysis spp. 48
2.2.5 Подготовка проб фитопланктона для анализа внутриклеточного содержания ДТМ из клеток Dinophysis spp... 49
2.2.6 Получение культуры Prorocen trum spp. 50
2.3 Методы 51
2.3.1 Подсчет клеток микроводорослей 51
2.3.2 Иммуноферментный анализ ДТМ 51
2.3.3 Высокоэффективная жидкостная хроматография с флуоресцентной детекцией 53
2.3.4 Высокоэффективная жидкостная хроматография с масс-спектрометрической детекцией 58
Глава 3. Результаты исследований 61
3.1 Динамика численности D. acuminata и содержание ДТМ в клетках D. acuminata и P. foraminosum... 61
3.1.1 Динамика численности Dinophysis spp. в Амурском заливе Японского моря
3.1.2 ДТМ в образцах Dinophysis spp. 64
3.1.3 ДМТ в культуре клеткой P. foraminosum 65
3.2 ДТМ в тканях мидии С.grayanus 67
3.2.1 Распределение ДТМ в теле мидии C. grayanus 67
3.2.2 Сезонная динамика концентрации ДТМ в тканях C. grayanus в период 2011-2013 69
3.2.3 Качественный состав ДТМ в пищеварительной железе мидии по данным ВЭЖХ-ФД 74
3.2.4 Распределение мидий с ДТМ на прибрежных акваториях залива Петра Великого 76
3.3 Оптимизация метода анализа ДТМ в форме флуоресцентных производных 4 бромометил-7-метоксикумарина 78
3.3.1 Оптимизация экстракции токсинов 78
3.3.2 Условия проведения анализа смеси ММК-производных аналогов окадаевой кислоты 80
3.3.3 Калибровка колонки при помощи смеси стандартов 83
Глава 4. Обсуждение результатов 84
4.1 D. acuminata и P. foraminosum как векторы переноса ДТМ 84
4.2 Распределение ДТМ в органах моллюска C.grayanus 86
4.3 Сезонная динамика и распределение ДТМ на акватории залива Петра Великого Японского моря 88
4.4 Оптимизация методов анализа токсинов группы ОК в тканях моллюсков и в клетках морских динофлагеллят 90
Заключение 94
Выводы 97
Список литературы 98
- Характеристика видов рода Prorocentrum как продуцентов токсинов
- Извлечение мягких тканей мидии Грея C. grayanus
- Динамика численности Dinophysis spp. в Амурском заливе Японского моря
- Оптимизация методов анализа токсинов группы ОК в тканях моллюсков и в клетках морских динофлагеллят
Введение к работе
Актуальность темы. Фикотоксины – это вторичные метаболиты
микроводорослей, которые передаются по пищевым цепям и могут оказывать негативное воздействие на консументов высших порядков. Один из классов фикотоксинов – это токсины группы окадаевой кислоты (ОК), которые продуцируют микроводоросли родов Dinophysis (Ehrenberg, 1839)1 и Prorocentrum (Ehrenberg, 1834)2. Данные вещества переносятся от микроводорослей к двустворчатым моллюскам-фильтраторам, а затем к другим гидробионтам или человеку. Группа состоит из свободных форм токсинов - ОК, динофизистоксин-1 (ДФТ-1) и динофизистокин-2 (ДФТ-2). 7-О-ацил производные или динофизистокин-3 (ДФТ-3) – это неактивная форма токсинов, образующаяся в теле моллюсков. Токсины группы ОК являются ингибиторами серин/треониновых фосфатаз в клетках млекопитающих. Блокирование данных ферментов в желудочно-кишечном тракте человека вероятно вызывает повреждение клеток кишечного эпителия и приводит к диарейному синдрому3, поэтому эти вещества получили название «диарейные токсины моллюсков» (ДТМ).
Многие виды морских двустворчатых моллюсков-фильтраторов являются объектами марикультуры. Массовое развитие микроводорослей-продуцентов ДТМ может приводить к накоплению этими моллюсками токсинов, что в последствие может приводить к массовым отравлениям людей при употреблении моллюсков в пищу. Дальневосточные моря России обладают наибольшим потенциалом в развитие марикультурных хозяйств в Российской Федерации4. В этом регионе обнаружено 37 видов микроводорослей, которые потенциально способны продуцировать фикотоксины4, среди которых D. acuminata (Claparde & Lachmann, 1859) и P. foraminosum (Faust, 1993). Однако, динамика численности микроводорослей родов Dinophysis и Prorocentrum и их действительная способность продуцировать ДТМ в условиях дальневосточных морей России не была подробно изучена до настоящего исследования.
Мидия Грея Crenomytilus grayanus (Dunker, 1853) является съедобным видом и одним из наиболее распространенных двустворчатых моллюсков в заливе Петра Великого5. Этот вид является долгоживущим и обладает крупными размерами, что делает его удобным объектом для исследования процессов накопления ДТМ.
Степень разработанности. Источники и пути передачи фикотоксинов активно
изучаются в развитых странах. Для акваторий Японского моря исследованы сообщества
фитопланктона и выявлены микроводоросли, которые являются потенциальными
продуцентами наиболее распространенных фикотоксинов. Изучена динамика
микроводорослей рода Dinophysis в заливе Восток Японского моря6. Показано, что увеличение численности микроводорослей может приводить к накоплению токсинов в
Reguera B. Harmful Dinophysis species: A review / B. Reguera, L. Velo-Suarez, R. Raine [et al.] // Harmful
Algae. – 2012. – Vol. 14. – P. 87-106.
Hoppenrath M. Taxonomy and phylogeny of the benthic Prorocentrum species (Dinophyceae)-A proposal and
review / M. Hoppenrath, N. Chomerat, T. Horiguchi [et al.] // Harmful Algae. – 2013. – Vol. 27. – P. 1-28.
Leftley J.W. Phycotoxins in seafood / J.W. Leftley, F. Hannah // Bioactive Compounds in Foods / eds. J. Gilbert,
H.Z. enyuva. – Oxford, UK.: Blackwell Publishing Ltd., 2008. – P. 52-109.
Orlova T.Y. Harmful algal blooms on the eastern coast of Russia / T.Y. Orlova, G.V. Konovalova, I.V. Stonik [et
al.] // PICES Scientific Report. – 2002. – No. 23. – P. 47-58.
Селин Н.И. Структура поселений и рост Мидии Грея в сублиторали Японского моря / Н.И. Селин //
Биология моря. – 1991. – Т. 2. – С. 55-63.
Selina M.S. Distribution of potentially toxic dinoflagellates Dinophysis (Dinophyta) in Vostok Bay of the Sea of
Japan / M.S. Selina // Russian journal of marine biology. – 1993. – No. 5-6. – P. 23-29.
тканях гидробионтов7. Токсины группы ОК, в основном, накапливаются в пищеварительной железе моллюсков8. Разработаны методы иммуноферментного анализа (ИФА) токсинов, высокоэффективной жидкостной хроматографии с флуоресцентной детекцией (ВЭЖХ-ФД) и с масс-спектрометрической детекцией (ВЭЖХ-МС). В России установлена предельно-допустимая концентрация (ПДК) аналогов ОК в нерыбных морепродуктах – 160 мкг/кг сырого веса9.
Цель исследования. Изучить состав и распространение токсинов группы окадаевой кислоты на примере микроводорослей родов Dinophysis и Prorocentrum и мидии C. grayanus из залива Петра Великого Японского моря
Задачи исследования:
-
Определить качественный и количественный состав токсинов в образцах D. acuminata и P. foraminosum.
-
Изучить качественный и количественный состав токсинов группы ОК в теле двустворчатого моллюска C. grayanus.
-
Исследовать динамику накопления токсинов группы ОК в тканях мидии Грея и распределение мидий, содержащих токсины группы ОК, в заливе Петра Великого Японского моря.
-
Оптимизировать методы анализа токсинов группы ОК в тканях моллюсков и в клетках морских динофлагеллят.
Научная новизна. Получены новые фундаментальные данные о способности бентосных микроводорослей вида P. foraminosum продуцировать ДФТ-1 в условиях лабораторного культивирования.
Впервые показано, что D. acuminata из популяции, обитающей в заливе Петра Великого, продуцирует токсины группы ОК в естественных условиях обитания.
Впервые определена сезонная динамика состава токсинов группы ОК в тканях мидии C. grayanus. Также проведен анализ трехлетней динамики микроводорослей рода Dinophysis на акватории залива Петра Великого. Показана возможная связь между уровнем токсинов в мягких тканях мидии и численностью микроводорослей рода Dinophysis на акватории.
Впервые показано, что в тканях двустворчатого моллюска C. grayanus активные формы токсинов группы ОК накапливаются преимущественно в пищеварительной железе, в то время как неактивные формы токсинов, представленные 7-O-ацил производными, которые не оказывают токсического эффекта, накапливаются вне пищеварительной железы.
Практическая и теоретическая значимость работы. Проведена оптимизация двух методов исследования состава токсинов группы ОК: ИФА и ВЭЖХ-ФД. Показано, что для корректного использования ИФА необходимо проводить щелочной гидролиз для выявления токсинов в форме 7-O-ацил производных, которые составляют до 82% от общей концентрации данных токсинов в теле моллюска. Метод ВЭЖХ-ФД с применением 4-бромометил-7-метоксикумарина (БММК) в качестве флуоресцентной метки подходит для анализа токсинов в тканях морских двустворчатых моллюсков и в клетках морских
7 Yasumoto T. Diarrhetic shellfish toxins / T. Yasumoto, M. Murata, Y. Oshima [et al.] // Tetrahedron. – 1985. –
Vol. 41. – No. 6. – P. 1019-1025.
8 Blanco J. Anatomical distribution of diarrhetic shellfish poisoning (DSP) toxins in the mussel Mytilus
galloprovincialis / J. Blanco, C. Mario, H. Martn [et al.] // Toxicon. – 2007. – Vol. 50. – No. 8. – P. 1011-1018.
9 Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов. Санитарно-
эпидемиологические правила и нормативы / Главный государственный санитарный врач РФ //
Постановление. – 2008.
динофлагеллят. Данный метод планируется к валидации и аккредитации для использования службами Россельхознадзора.
Расширен мировой список продуцентов фикотоксинов, подлежащих контролю при мониторинговых исследованиях Мирового океана.
Способность микроводорослей D. acuminata продуцировать токсины группы ОК и анализ многолетней динамики микроводорослей рода Dinophysis имеют непосредственное практическое значение при реализации проектов развития марикультурных хозяйств в Приморском крае на акватории залива Петра Великого Японского моря.
Методология и методы диссертационного исследования. В данной работе применяли традиционные методы сбора, идентификации, подсчета и культивирования микроводорослей. Для оценки качественного и количественного состава токсинов применяли методы ИФА и ВЭЖХ с различными детекторами.
Положения, выносимые на защиту.
-
Микроводоросли D. acuminata и P. foraminosum, обитающие на акватории залива Петра Великого, способны продуцировать токсины группы окадаевой кислоты.
-
Окадаевая кислота, динофизистоксин-1 и динофизистоксин-2 накапливаются преимущественно в пищеварительной железе моллюска C. grayanus, а их 7-О-ацил производные локализуются вне пищеварительной железы.
-
Токсины группы окадаевой кислоты присутствуют в тканях моллюска C. graynus из залива Петра Великого Японского моря в течение всего года; превышение ПДК возникает в период март-октябрь, а распределение моллюсков, содержащих опасный для человека уровень токсинов, на акватории носит неравномерный характер.
-
Метод ИФА с щелочным гидролизом достоверно отражает соотношение свободных форм токсинов группы окадаевой кислоты и их 7-О-ацил производных в тканях гидробионтов, а метод ВЭЖХ-ФД – качественный и количественный состав токсинов в тканях гидробионтов и в клетках динофлагеллят.
Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность результатов обеспечивается использованием современных определителей при идентификации микроводорослей, трехкратными повторами при проведении любой экспериментальной работы и применением метода внутреннего стандарта для оценки возможных потерь при подготовке проб к анализу.
Основные результаты исследований представлены и обсуждены на
международных и региональных мероприятиях: Всероссийский с международным
участием конгресса молодых ученых-биологов «Симбиоз-Россия» (Иркутск, 2013), I
межрегиональной молодежной школы конференции «Актуальные проблемы
биологических наук» (Владивосток, 2013), PICES-2013 Annual Meeting «Communicating forecasts, uncertainty and consequences of ecosystem change» (Нанаймо, Канада, 2013), IOC/WESTPAC 9th International Scientific Symposium «A healthy ocean for prosperity in the Western Pacific: scientific challenges and possible solutions» (НяЧанг, Вьетнам, 2014), PICES-2014 Annual Meeting «Toward a better understanding of the North Pacific: Reflecting on the past and steering for the future» (Йосу, Корея, 2014), XV Всероссийской молодежной школе-конференции по актуальным проблемам химии и биологии (МЭС ТИБОХ, 2014), Harmful Algal Blooms and Climate Change Symposium. (Гётеборг, Швеция, 2015), PICES-2015 «Change and sustainability of the North Pacific» (Циндао, Китай, 2015), ежегодной конференции сотрудников ИБМ ДВО РАН 2015.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 работ, в том числе 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из четырех глав, введения, заключения, выводов, списка литературы. Содержание диссертации изложено на 122 страницах машинописного текста, содержит 5 таблиц, 18 рисунков, 4 приложения. Список литературы включает 138 источников, в том числе 123 иностранных.
Характеристика видов рода Prorocentrum как продуцентов токсинов
На сегодняшний день известно три пути трансформации токсинов группы ОК другими организмами: окисление, дериватизация и расщепление. [77]. Основной целью подобных превращений является уменьшение полярности «родительских» токсинов группы ОК и снижение их ингибирующей активности в отношении серин/треониновых фосфатаз.
Окисление ОК до диольных аналогов известно для диатомовых микроводорослей Conticribra weissflogii (K.Stachura-Suchoples & D.M.Williams, 2009), но только когда их клетки не повреждены. Подобная трансформация происходит за счет окисления по монооксигеназному пути и служит для превращения ОК в eё менее полярные производные, обладающие низкой афинностью к белкам-мишеням [130]. Причины данной модификации остаются малоизученными.
Дериватизация ОК с помощью жирных кислот осуществляется двустворчатыми моллюсками. После фильтрации микроводорослей двустворчатые моллюски трансформируют высвободившиеся токсины в форму ДФТ-3. 7-О-ацил производные «родительских» токсинов были обнаружены только в тканях моллюсков. Этот факт дает право полагать, что биосинтез сложных эфиров ОК и жирных кислот характерен только для моллюсков [77].
У разных видов моллюсков содержание свободной ОК и ее производных в тканях существенно отличается. Различные виды мидий Mytilus spp. в основном содержат ДТМ в форме ОК и редко в форме её производных. Однако другие виды моллюсков, такие как устрицы и гребешки, могут содержать до 90% ДТМ в форме различных производных ОК [76]. Например, в тканях мидий M. galoprovincialis из прибрежных вод Испании и M. edulis из прибрежных вод Франции, основная часть ОК и ее аналогов, включая ДФТ-3, содержалась в пищеварительной железе, а в окружающих мягких тканях обнаружили не более 6,2% всех токсинов [27; 69]. В то же время, в тканях A. irradians, собранных у побережья Канады, 76% аналогов ОК содержалось в пищеварительной железе, 12% - в гонадах и около 12% - в жабрах, мантии и мускуле-замыкателе [26]. Однако, в этой работе не был использован щелочной гидролиз, поэтому содержание ДФТ-3 в A. irradians остается неизвестным. Ранее было показано, что в съедобных тканях австралийского двустворчатого моллюска P. fumatus содержалось только 34% аналогов ОК [67]. Для португальского вида Cerastoderma edule (Linnaeus, 1758) известно, что больше 95% аналогов ОК в съедобной части (без пищеварительной железы) содержится в форме сложных эфиров [127].
Существует предположение, что формирование ДФТ-3 происходит под действием ферментативных систем в пищеварительной железе моллюсков и далее может подвергаться переносу в другие органы для хранения и элиминации. Было показано, что ОК может быть ассоциирована в тканях моллюсков с молекулярными комплексами, схожими по структуре с липопротеинами млекопитающих. Предполагают, что данные комплексы могут участвовать в транспорте ДФТ-3 в окружающие ткани моллюсков в процессе метаболизма [98]. Соотношение свободных «родительских» токсинов и ДФТ-3 в пищеварительной железе и других органах может носить динамический характер и изменятся в процессе накопления, трансформации и элиминации токсинов моллюсками.
В организм человека токсины попадают после употребления в пищу морепродуктов, пораженных этими токсинами. В теле двустворчатых моллюсков токсины могут содержаться в двух формах (свободного «родительского» токсина и ДФТ-3), а в теле ракообразных до 90% токсинов находится в форме ДФТ-3, поэтому в организм человека токсин попадает, в основном, в форме ДФТ-3. Под действием пищеварительных ферментов происходит расщепление ДФТ-3 на остаток жирной кислоты и свободный «родительский» токсин. Этим объясняется тот факт, что первые симптомы отравления наблюдаются в интервале от 30 до 240 минут после приема пищи [75].
Таким образом, в процессе передачи и трансформации токсинов группы ОК участвуют несколько типов живых организмов. Микроводоросли и беспозвоночные в процессе эволюции выработали молекулярные механизмы, позволяющие им защищать собственный организм от действия токсинов группы ОК. Данные механизмы заключаются в химической трансформации токсинов с целью уменьшения их ингибирующей активности по отношению в серин/треониновым фосфатазам. У человека, по-видимому, ферментативные системы, позволяющие уменьшить токсический эффект токсинов группы ОК на организм, работают не так эффективно в отношении токсинов группы ОК. Вследствие этого при употреблении в пищу морепродуктов с высоким содержанием ОК и ее аналогов наблюдается диарейное отравление.
Изучение токсинов группы ОК идет в двух направлениях: изучение механизма действия ОК на различные биологические объекты, и изучение качественного и количественного состава токсинов в различных биологических объектах.
Поскольку ОК является ингибитором серин/треониновых фосфатаз, то спектр ее возможных эффектов на клеточном уровне является довольно широким. В этой связи оправдано применение цитологических исследований, нацеленных на выявление этих эффектов: анализ действия на клеточные культуры, локализация ОК с помощью методов иммуно-флуоресценции, методы ДНК-комет, микроядерный тест, проточная цитометрия. Для определения белковых комплексов, вовлеченных в механизмы трансформации и транспорта ОК в организме, применяют методы протеомики [91].
Исследование качественного и количественного состава токсинов группы ОК в различных биологических объектах включает две группы методов: методы биологического тестирования и аналитические инструментальные методы. Биотесты позволяют определить общее содержание токсинов в пробе. Они включают методы с использованием живых организмов, например, мышей, и in vitro методы на основе взаимодействий рецептор-лиганд и иммунологических тестов. К аналитическим методам относят высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) с использованием различных детекторов [19]. Данная глава будет сфокусирована на методах оценки качественного и количественного состава токсинов группы ОК в различных биологических объектах.
Извлечение мягких тканей мидии Грея C. grayanus
Сумму токсинов экстрагировали и подвергали щелочному гидролизу, как для ИФА. После гидролиза 3 мл экстракта переносили в стеклянную пробирку с завинчивающейся крышкой и экстрагировали гексаном (2 х 3,5 мл). К водно-метанольному слою добавляли 0,5 мл воды, 75 мкл концентрированной соляной кислоты, экстрагировали хлороформом (2 х 3,5 мл), и экстракт упаривали досуха под вакуумом при температуре 35С. Остаток растворяли в 100 мкл смеси ацетонитрил/хлороформ (1:9) и переносили в стеклянный флакон объемом 1,5 мл.
Экстракция ДТМ из клеток P. faraminosum 40 мл хорошо перемешанной клеточной суспензии P. foraminosum переносили в полипропиленовую пробирку (50 мл) с завинчивающейся крышкой и подвергали центрифугированию при 4000 g при 20С в течение 30 мин. Супернатант переносили в чистую пробирку для использования в качестве бесклеточной среды. 1,5 мл 80% водного метанола добавляли к клеточному осадку. Клетки подвергали ультразвуковому воздействию на установке (Branson Sonifier 450, США) в течение 5 мин на ледяной бане и интенсивно перемешивали на вортексе (Heidolph REAX top, Германия) в течение 1 мин. Суспензию центрифугировали при 4000 g при 20С 10 мин. Супернатант переносили в стеклянную пробирку с завинчивающейся крышкой. Осадок экстрагировали повторно 1 мл 80% метанола при тех же условиях. Супернатанты объединяли и при необходимости объем доводили до 2,5 мл 80% метанолом.
Экстракция ДТМ из бесклеточной среды P. faraminosum 40 мл среды после культивирования P. faraminosum фильтровали через фильтр-насадку для шприца с диаметром пор 0,22 мкм (Merck Milipore Ltd., Ирландия) для удаления клеток P. fa ramin osu m. Среду пропускали через картридж для твердофазной экстракции заполненный 0,3 мг сорбента для обращенно-фазовой хроматографии (C-18) (Supelco, США) при скорости протока 1 мл/мин. Картридж предварительно промывали 3 мл метанола и 3 мл дистиллированной воды. ДТМ элюировали 2 мл метанола. К экстракту добавляли 500 мкл воды и переносили в стеклянную пробирку с завинчивающейся крышкой для дальнейшей очистки.
Синтез флуоресцентных производных ОК
Синтеза и очистку флуоресцентных производных токсинов проводили аналогично способу получения ММК-производных простагландинов, как описано ранее [53] с небольшими изменениями. Рабочие растворы 4-бромометил-7-метоксикумарина (БММК) (15 мг/мл) и 18-краун-6 эфира (100 мг/мл) (ICN Biomedicals Inc., США) в смеси ацетонитрил/хлороформ (1:9) готовили непосредственно перед реакцией. Во флаконе (1,5 мл) смешивали 100 мкл экстракта, полученного на предыдущей стадии, 200 мкл раствора БММК, 50 мкл раствора 18-краун-6 эфира и добавляли 15 мг мелкодисперсного безводного K2CO3. Реакционную смесь инкубировали в закрытом флаконе в атмосфере аргона при 55 С в течение 2 ч. Отчистка БММК производных аналогов ОК
Смесь после реакции дериватизации охлаждали, фильтровали и упаривали досуха, продувая реакционный флакон аргоном. Осадок растворяли в 500 мкл смеси этилацетат/бензол (15:85) и наносили на патрон для твердофазной экстракции Диапак С (БиоХимМак, Россия), содержащий 1 г силикагеля, предварительно промытый 3 мл метанола и 3 мл смеси этилацетат/бензол (15:85). После нанесения продуктов реакции на патрон, его промывали 3 мл смеси этилацетат/бензол (15:85), продукты реакции элюировали 3 мл этилацетата и упаривали досуха под вакуумом при температуре 35С. Остаток растворяли в 350 мкл ацетонитрила для хроматографического анализа.
Синтез флуоресцентного производного ДХК (Fluka, США), который использовали как внутренний стандарт при ВЭЖХ анализе количественного состава ДТМ, проводили, как описано выше. Для реакции брали 20 мг ДХК. Продукты реакции нанесли на стеклянную колонку (10 см х 1 см), заполненную силикагелем (70-230 mesh, Merck Grade 7734, Sigma-Aldrich, США). Колонку промывали 10 мл смеси этилацетат/бензол (15:85) для удаления избытка БММК. Элюцию продуктов реакции проводили этилацетатом. Фракции по 1 мл собирали в отдельные стеклянные пробирки. Контроль присутствия флуоресцентных производных ДХК проводили при помощи тонкослойной хроматографии (ТСХ) на пластинках с силикагелем с УФ-индикатором (Sorbfil, ПТСХ-АФ-В-УФ, Россия) в этилацетате. Обнаружение веществ на ТСХ-пластинке проводили под УФ-светом (360 нм) с последующим опрыскиванием пластинки 5% метанольным раствором серной кислоты и нагревом до 180С. Фракции, содержащие чистое флуоресцентное производное ДХК, объединяли и упаривали под вакуумом. Полученное вещество взвешивали и использовали для приготовления калиброванного раствора. ММК-производное ДХК имеет максимум поглощения при длине волны 325 нм и максимум испускания при длине волны 391 нм. МСВР депротонированного молекулярного иона m/z = 579.3313, C35H47O7 (расчетная 579.3327). Проведение анализа ВЭЖХ-ФД
Анализ проводили на жидкостном хроматографе LC-20A Prominence с флуоресцентным детектором RF-10AXL (Shimadzu, Япония). Разделение смеси осуществляли на колонке YMC C18 (250 мм х 4,6 мм; размер частиц 5 мкм), снабженной предколонкой YMC Pro C18 (10 мм х 4 мм; размер частиц 5 мкм) (YMC Co., Ltd., Япония), при температуре 40С. Регистрация сигнала флуоресценции проводилась при длине волны возбуждения 325 нм и длине волны испускания 391 нм. Объем пробы был 2 мкл при анализе экстрактов пищеварительной железы; 20 мкл – при анализе смесей стандартов. Элюирование проводили со скоростью 1 мл/мин в градиенте ацетонирил/вода (об./об.): 80:20, 2 мин; 100:0, 15 мин; 80:20, 10 мин (промывка и уравновешивание колонки).
Калибровка колонки Получение флуоресцентных производных стандартов ОК, ДФТ-1 и ДФТ-2 проводили на базе ТБМО ФГБУ «Приморская межобластная ветеринарная лаборатория», лицензированной на проведение анализа токсинов морских беспозвоночных. Разработку условий ВЭЖХ анализа, определение времени удерживания производных, построение калибровочных кривых для количественного анализа проводили на растворах флуоресцентных производных аналогов ОК с пониженной концентрацией на базе ФГБУН Институт биологии моря им. А.В. Жирмунского ДВО РАН.
Для определения времени удерживания ММК производных основных токсинов группы окадаевой кислоты (ОК, ДФТ-1 и ДФТ-2) использовали стандартный растворы, приобретенные в Национальном исследовательском совете (Канада). Концентрация растворов составляла: ОК– 17 мкМ; ДФТ-1 – 18,5 мкМ; ДФТ-2 – 9,5 мкМ. Для определения времени удерживания ММК производного внутреннего стандарта использовали раствор ДХК в метаноле с концентрацией 20,3 мкМ.
Динамика численности Dinophysis spp. в Амурском заливе Японского моря
Вспышки синдрома диарейного отравления моллюсками, которые происходят после употребления в пищу морепродуктов, содержащих токсины группы ОК, являются серьезной проблемой в прибрежных странах. Данная проблема имеет комплексный характер, поскольку включает в себя необходимость мониторинга микроводорослей – потенциальных продуцентов токсинов, контроль содержания токсинов в тканях гидробионтов, использование адекватных методов оценки качественного и количественного состава токсинов и информирование населения об этой проблеме.
В данной работе была предпринята попытка комплексного подхода для ответа на вопрос, насколько серьезной является проблема распространения токсинов группы ОК и каковы источники этих токсинов в заливе Петра Великого Японского моря. Во-первых, была определена вероятная роль двух видов динофлагеллят, как источников токсинов для моллюсков-фильтраторов Во-вторых, был изучен качественный и количественный состав токсинов группы ОК в теле морского двустворчатого моллюска C. grayanus, который является одним из самых распространенных двустворчатых моллюсков в заливе Петра Великого [6; 10; 11]. В-третьих, была исследована сезонная динамика и пространственное распределение токсинов в заливе Петра Великого. В-четвертых, была произведена оптимизация методов анализа токсинов группы ОК в тканях моллюсков и в клетках морских динофлагеллят.
По данным трехлетней годовой динамики за период 2011-2013 годов виды рода Dinophysis присутствовали в сообществе микроводорослей в течение всего года. Среди шести видов, отмеченных в этот период, только D. acuminata и D. fortii достигали высокой численности в период с мая по сентябрь. Эти наблюдения согласуются с предыдущими исследованиями в регионе [86; 101]. В образцах фитопланктона, содержащих D. acuminata, было обнаружено присутствие ДФТ-1 (Табл. 3.1). Известно, что качественный и количественный состав токсинов в популяциях D. acuminata в различных регионах может существенно варьировать [42]. ДФТ-1 был обнаружен в двух природных популяциях D. acuminata в Японии [58] и Новой Зеландии [65]. В других популяциях D. acuminata обнаруживали только ОК в концентрациях от следовых количеств [48; 58] до 50 пг/кл [18; 100]. В сравнительном исследовании пяти клонов D. acuminata из Северной и Южной Америк повышенное разнообразие качественного состава токсинов было обнаружено в изолятах из северных популяций, в то время как в изолятах из южных популяций обнаруживали только один из типов токсинов [42]. Сравнение наших результатов и данных о других популяциях свидетельствует о чрезвычайной вариативности продукции токсинов разными популяциями D. acuminata. Однако, причины этой вариативности остаются малоизученными. Среди наиболее вероятных причин называют изменение кормового объекта Dinophysis [117] и различное физиологическое состояние микроводорослей [89]. Тем не менее, несмотря на различия в составе токсинов разных популяций, виды рода Dinophysis являются вероятными векторами переноса токсинов группы ОК на акватории зал. Петра Великого.
В рамках представленного исследования впервые показано, что P. foraminosum способен продуцировать ДФТ-1 в условиях лабораторного культивирования. Закономерности продукции ДФТ-1 клетками данного вида в естественных условиях являются предметом дальнейших исследований. Поскольку для культур клеток P. foraminosum был установлен факт присутствия токсина, можно говорить о наличие у этого вида токсин-синтезирующего аппарата, который, вероятно, состоит из поликетидсинтаз, с работой которых связывают способность продуцировать токсины [36]. На данный момент остается неизвестным, что запускает механизм синтеза токсинов.
Вид P. foraminosum занимает сходную экологическую нишу с P. lima. В частности, он ведет, в основном, прикрепленный образ жизни и ассоциирован с разветвленными макрофитами. Помимо этого он может обитать в сообществе обрастателей моллюсков и в биссусных нитях [81]. Поскольку P. lima является основным вектором переноса ДТМ к моллюскам в прибрежных водах Канады [57], Великобритании [41] и Новой Зеландии [95]. Клетки P.lima были обнаружены в желудках мидий, обитающих на акватории Черного моря [81] и залива Мэн в США [68]. Таким образом, можно предположить, что P. foraminosum имеет схожий потенциал в передаче токсинов.
В данной работе установлено, что ОК и ее производные присутствуют в мягких тканях C. grayanus из Японского моря как в активной форме – ОК, ДФТ-1 и ДФТ-2, так и в неактивной форме – ДФТ-3 (Рисунок 3.5, 3.6). ДТФ-3 составляет более 80% от суммы токсинов и содержится преимущественно вне пищеварительной железы C. grayanus. Ранее, подобное распределение наблюдали для австралийского двустворчатого моллюска P. fumatus [67] и для португальского вида C. edule [127].
Весьма вероятно, что распределение аналогов ОК в органах некоторых видов двустворчатых моллюсков и исследованной мидии C. grayanus имеет общие черты. В пищеварительной железе C. grayanus концентрация аналогов ОК значительно выше, чем в окружающих тканях, однако доля ДФТ-3 среди аналогов ОК не превышает 40%. Вклад пищеварительной железы в общее количество ДФТ-3 из всех тканей моллюска составляет менее 4%. В съедобных тканях суммарная концентрация аналогов ОК ниже, чем в пищеварительной железе, однако более 95% токсинов находится в форме неактивных сложных эфиров (ДТФ-3).
Такое распределение аналогов ОК по тканям моллюсков может быть связано с особенностями биосинтеза и транспорта ДФТ-3. С нашей точки зрения возможен следующий динамический механизм трансформации токсинов в теле мидии. Высокий уровень аналогов ОК в пищеварительной железе поддерживается за счет высокого уровня токсинов в микроводорослях, непрерывно поступающих с пищей в период активного цветения этих микроводорослей. Активные формы токсинов могут превращаться в неактивную липофильную форму непосредственно в пищеварительной железе [109]. После ацилирования может происходить либо расщепление ДФТ-3 в пищеварительной железе за счет собственных пищеварительных ферментов [66], либо перенос ДФТ-3 в окружающие ткани [29]. В обоих случая параллельно происходят процессы детоксикации [138] и элиминации данных веществ из тела моллюска. Тем не менее, при высокой скорости поступления токсинов в организм мидии, механизмы детоксикации насыщаются, что приводит к смещению равновесия в пользу временного накопления токсинов в форме ДФТ-3 вне пищеварительной железы. Известно, что в клетках пищеварительной железы мидии Perna canaliculus (Gmelin, 1791) обнаружили фермент, относящийся к классу сериновых эстераз, способный расщеплять 7-О-ацил производные ДФТ-1 и, таким образом, препятствовать накоплению ДФТ-3 в пищеварительной железе [66]. Кроме того, ОК в клетках пищеварительной железы мидии M. galloprovincialis связана с молекулами с массой более 30 кДа, напоминающими по структуре липопротеины млекопитающих [98]. Известно, что липопротеины участвуют в транспорте низкомолекулярных липофильных соединений. Поэтому, нельзя исключать роль аналогов липопротеинов у моллюсков в переносе липофильного ДТФ-3 из пищеварительной железы в другие органы моллюсков. Накапливаясь вне пищеварительной железы ДФТ-3 не оказывает токсического действия на организм моллюска [75]. При сезонном уменьшении количества токсических микроводорослей в фитопланктоне, процесс накопления ДФТ-3 останавливается, эта форма токсина, по-видимому, удаляется из организма моллюска. В пользу этого предположения говорит, тот факт что при кормлении моллюсков, содержащих высокие концентрации ДТМ, набором микроводорослей, не способных продуцировать ДМТ, концентрация ДТМ в моллюсках быстро снижалась [69].
Оптимизация методов анализа токсинов группы ОК в тканях моллюсков и в клетках морских динофлагеллят
В настоящей работе проведена сравнительная оценка возможностей метода ИФА и ВЭЖХ при анализе токсинов группы ОК в тканях морских моллюсков. Исследовали динамику содержания токсинов в мягких тканях мидии C. grayanus, собранной в 2011-2012 годах, при этом сравнили результаты стандартного метода ИФА без применения щелочного гидролиза и результаты ВЭЖХ-МС (Рисунок. 3.7). Выявили, что в 42% случаев ИФА дает некорректный результат в результате занижения (17%) или завышения (35%) концентрации ДТМ.
Занижение концентрации может быть связано с тем, что для ИФА используются антитела, имеющие 100% реактивность к ОК и 50% реактивность к ДФТ-1 и ДФТ-2. По данным ВЭЖХ-МС превалирующим токсином в пробах был ДФТ-1 (Рисунок. 3.7). По-видимому, по причине сниженной реактивности антител к ДФТ-1 в процессе ИФА не все молекулы ДФТ-1 имеют возможность полноценно связаться с антителами и не участвуют в анализе. Непрямые методы анализа ДТМ приводят к получению ложных результатов, при условии преобладания ДФТ-1 или ДФТ-2 в образцах [56]. Было обнаружено, что при исследовании образцов, содержащих только ОК, с помощью ИФА и ВЭЖХ-МС наблюдается строгая корреляция полученных результатов [83; 125]. Причинами завышенных результатов ИФА может являться наличие в пробах компонентов, которые имитируют структуру эпитопа ОК. Поскольку используемый метод основан на принципе конкурентного взаимодействия свободного токсина ОК и конъюгатов ОК с ферментом пероксидазой, измерение концентрации токсина происходит по измерению концентрации продуктов реакции пероксидазы с субстратом. Неспецифическое блокирование сайтов связывание конъюгатов ОК и пероксидазы с антителами захвата может приводить к получению неспецифического положительного сигнала.
Тем не менее, метод ИФА подходит для анализов, в которых влияние неспецифических компонентов, способных реагировать с антителами остается без изменений. В анализе для определения соотношения ДФТ-3 и свободных форм токсинов в тканях гидробионтов в достаточной мере выполняется это условие. В данном анализе для сравнения используют аналогичные пробы. Отличие проб состоит только в проведение щелочного гидролиза в процессе их подготовки. Подобный подход так же был применен в других работах и полученные результаты коррелировали с данными ВЭЖХ-МС/МС [56].
Сезонную динамику содержания токсинов в мягких тканях мидии C. grayanus в 2013 г., определили двумя независимыми методами: ИФА и ВЭЖХ-ФД. При сравнении данных, полученных этими методами, наблюдали значительные отличия. ИФА с применением щелочного гидролиза выявляет в пробах, собранных в период с января по июнь 2013 г., чрезвычайно высокие концентрации ДТМ (Рисунок. 3.8). В период с июня по декабрь 2013 г. происходит резкое снижение средней концентрации ДТМ в пищеварительной железе мидии. Подобная динамика не наблюдается при исследовании аналогичных проб методом ВЭЖХ-ФД. По данным ВЭЖХ-ФД максимальная концентрация токсинов наблюдается в период с марта по октябрь 2013 года (Рисунок. 3.9). Данная динамика подтверждает теорию о том, что основным источником токсинов в моллюсках-фильтраторах являются микроводоросли, максимальное развитие которых происходит в теплое время года с мая по сентябрь. Получение завышенных результатов с помощью ИФА в данном случае может быть объяснено реакцией неизвестного неспецифического компонента из пищеварительной железы C. grayanus, концентрация которого также носит сезонный характер и резко снижается во второй половине года. Тем не менее, для достоверного ответа на данный вопрос требуется проведение дополнительных исследований.
Таким образом, проведенное исследование показало, что использование ИФА для оценки годовой динамики может приводить к получению данных, не отражающих реальную концентрацию ДТМ в тканях гидробионтов. К подобному выводу также пришли исследователи в США, которые обнаружили, что ИФА дает 22% ложноположительных результатов по сравнению с ВЭЖХ-МС при анализе мягких тканей мидий M. edulis [40].
Оптимизированный в процессе выполнения работы метод анализа ДТМ в виде флуоресцентных производных с использованием ВЭЖХ-ФД имеет ряд преимуществ по сравнению c ИФА. Во-первых, данный метод является прямым методом анализа токсинов, что позволяет избежать получения ложных результатов, вызванных неспецифической реакцией. Во-вторых, с помощью этого метода можно измерять концентрацию каждого из токсинов группы ОК при наличии стандарта соответствующего токсина.
При ВЭЖХ-ФД анализе ДТМ применяют различные флуоресцентные производные. Для получения производных чаще всего используют 9-антрилдиазометан [59], реже применяют 4-бромометил-7-метоксикумарин (БММК) [54], несмотря на то, что это вещество обладает рядом преимуществ по сравнению с 9-антрилдиазометаном. Во-первых, БММК не требует особых условий хранения и транспортировки, и его флуоресцентные производные могут хранится при +4С в течение, как минимум, 7 дней. Во-вторых, БММК дешевле 9-антрилдиазометана, что немаловажно при массовом анализе. С нашей точки зрения, БММК является перспективным реагентом для получения флуоресцентных производных при ВЭЖХ анализе ДТМ. Наше мнение подтверждает рекомендацию к применению этого вещества Европейской комиссией [63].