Устойчивость морских макроводорослей к фотоокислительному стрессу в условиях флуктуации температуры Белоциценко Елена Сергеевна

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1. Обзор литературы 16

1.1. Температура - как экологический фактор в жизнедеятельности морских макроводорослей 16

1.2. Понятие «фотоокислительный стресс» 19

1.3. Генерация активных форм кислорода у водных растений под действием температуры 22

1.3.1. Активные формы кислорода: образование и механизмы действия 22

1.3.2. Повреждение фотосинтетического аппарата и продукция активных форм кислорода у водных растений в условиях термостресса 27

1.3.3. Влияние температуры на устойчивость водных растений к фотоокислительному стрессу 33

1.4. Механизмы защиты водных растений от фотоокислительного стресса 35

1.4.1. Механизмы снижения избыточного поглощения и утилизации света 36

1.4.2. Антиоксидантная система защиты 37

1.5. Антиоксидантный статус и эффективность работы

антиоксидантной системы морских макроводорослей 43

ГЛАВА 2. Объекты и методы исследований 53

2.1. Объекты исследования 53

2.2. Физико-географическая характеристика районов исследований

2.2.1 Уссурийский залив, б. Соболь, Японское море 58

2.2.2 Залив Восток, б. Прибойная, Японское море 59

2.2.3 Амурский залив, м. Красный, Японское море

2.3. Сбор материала для экспериментов 61

2.4. Постановка экспериментов з

2.4.1 Изучение устойчивости морских макрофитов к фотоокислительному стрессу в условиях кратковременной флуктуации температуры воды 64

2.4.2 Изучение сезонных изменений фотоокислительных и антиоксидантных процессов макроводорослей 67

2.4.3 Регуляция ферментативной антиоксидантной системы (АОС) водорослей Японского моря в условиях долговременной температурной акклимации и под воздействием высокой освещенности в постакклимационный период 68

2.5. Методы 71

ГЛАВА 3. Результаты 83

3.1 Характеристика антиоксидантного статуса макроводорослей Японского моря 83

3.2 Устойчивость морских макрофитов к фотоокислительному стрессу в условиях кратковременной флуктуации температуры воды 85

3.2.1 Дневные изменения фотосинтетической и антиоксидантной функции макроводорослей литорали 85

3.2.2 Регуляции антиоксидантной системы водорослей в условиях кратковременного повышения температуры воды и комбинированного температурного и светового стресса 94

3.3 Влияние долговременной температурной акклимации на устойчивость водорослей к фотоокислительному стрессу 100

3.3.1 Сезонные изменения фотоокислительных и антиоксидантных процессов макроводорослей 100

3.3.2 Регуляция ферментативной антиоксидантной системы морских макроводорослей в условиях долговременной температурной акклимации и под воздействием высокой освещенности в постакклимационный период 114

ГЛАВА 4. Обсуждение 125

Заключение 145

Выводы 147

Список литературы 149

• Генерация активных форм кислорода у водных растений под действием температуры
• Уссурийский залив, б. Соболь, Японское море
• Устойчивость морских макрофитов к фотоокислительному стрессу в условиях кратковременной флуктуации температуры воды
• Сезонные изменения фотоокислительных и антиоксидантных процессов макроводорослей

Введение к работе

Актуальность темы. На мелководных участках шельфа морей умеренных широт водоросли-макрофиты занимают обширные площади морского дна и являются основными продуцентами первичного органического вещества и кислорода. В силу своего прикрепленного образа жизни эти автотрофные организмы особенно часто подвергаются воздействию неблагоприятных факторов внешней среды, которые могут провоцировать у растений дисбаланс между процессами поглощения и утилизации световой энергии (обзор, Aguilera, Rautenberger, 2012). В этих условиях усиление генерации активных форм кислорода (АФК) в тканях водорослей приводит к развитию фотоокислительного стресса, ФОС (Asada, 1999; Reddy, Raghavendra, 2006), который в свою очередь может вызывать серьезные окислительные повреждения вплоть до гибели организма (обзор, Alscher et al., 1997). Проведенные к настоящему времени многочисленные исследования (обзоры Cosse et al., 2008; Lesser, 2012; Bischof, Rautenberger, 2012) показывают, что устойчивость макроводорослей к ФОС во многом определяется состоянием их антиоксидантных систем (АОС), на эффективность и направленность работы которых часто влияют факторы внешней среды в месте обитания вида.

В умеренных широтах одним из основных факторов, определяющих распространение, выживание и продуктивность морских макроводорослей, является температура (Luning, 1990). В литературе показано (обзор, Hanelt et al., 2003), что устойчивость макроводорослей к изменениям температурного режима обеспечивается адаптивными перестройками на уровне репродукции, роста, фотосинтетических и других метаболических процессов. Сведения о влиянии температурного режима на продукцию АФК и антиоксидантный ответ морских автотрофных организмов ограничены небольшим количеством работ, выполненных, главным образом, на макрофитах Атлантики (Collen, Davison, 1999а, Ь, с; Choo et al., 2004; Lohrmann et al., 2004) и симбиотических микроводорослях тропиков (обзор, Lesser, 2012). Кроме того, вопрос о том, как изменения в антиоксидантном статусе водорослей, вызванные флуктуации температуры воды, участвуют в формировании устойчивости растений к ФОС при дополнительной нагрузке других факторов среды (например, высоких интенсивностей света) до сих пор остается мало изученным. Учитывая тот факт, что в природе влияние абиотических факторов среды взаимосвязано, отсутствие таких сведений препятствует полному пониманию механизмов, вовлеченных в процесс биохимической адаптации морских водорослей в условиях интенсификации окислительных процессов.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы было исследование влияния температуры на устойчивость к фотоокислительному стрессу морских макроводорослей с точки зрения регуляции их систем антиоксидантной защиты. Для выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие конкретные задачи:

1. Оценить состояние антиоксидантных систем морских макроводорослей Японского моря в период их активного вегетативного роста.

2. Изучить характер дневных и сезонных изменений уровня перекисного окисления липидов и активности антиоксидантных систем водорослей; оценить вклад температуры в регуляцию этих процессов.

3. Изучить антиоксидантный статус водорослей, акклимированных к различным
температурам, и сравнить их устойчивость к фотоокислительному стрессу.

Научная новизна. В настоящей работе впервые приводятся количественные данные об активности и содержании компонентов АОС у макроводорослей Японского моря. Показано, что виды, принадлежащие к тропическо-низкобореальной биогеографической группе, характеризуются более высоким антиоксидантным потенциалом по сравнению с бореальными видами. Впервые исследована дневная динамика активности антиоксидантных процессов у морских макроводорослей. Обнаружено, что источником окислительных процессов в тканях растений в середине дня летних месяцев являются высокие концентрации перекиси водорода. Установлено также, что кратковременное повышение температуры в середине дня приводит к активации процессов ресинтеза низкомолекулярных антиоксидантов у видов, принадлежащих к тропическо-низкобореальной группе, и вызывает инактивацию суперок-сиддисмутазы, а также нарушение процессов регенерации аскорбата и глутатиона у видов бореальной группы. Выявлены механизмы долговременной акклимапии ферментативной антиоксидантной системы макрофитов субтропического и бореального генезиса к понижению и повышению температуры воды, а также впервые продемонстрирована их связь с устойчивостью водорослей к фотоокислительному стрессу.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные экспериментальные данные вносят существенный вклад в расширение фундаментальных знаний о механизмах устойчивости и стратегиях биохимической адаптации морских макрофитов к фотоокислительному стрессу в условиях кратковременной и долговременной флуктуации температуры, а также о роли компонентов аскорбат-глутатионового цикла в этих процессах.

Проведенные нами исследования диапазона вариабельности компонентов антиоксидантной системы массовых видов макроводорослей Японского моря представляют несомненный практический интерес. Полученные данные могут оказаться полезными для оценки функционального состояния растительных гидробионтов в биоиндикации и экологическом мониторинге прибрежных водных экосистем умеренных широт. Сведения об условиях инициации, накопления и функционирования компонентов АОС в тканях морских макроводорослей могут быть также востребованы при разработке медицинских препаратов и пищевых добавок, связанных с природными антиоксидантами.

Полученные в процессе выполнения этой работы экспериментальные данные и сделанные на их основе теоретические обобщения могут быть использованы в курсах лекций для студентов биологических факультетов вузов.

Методология и методы диссертационного исследования. В представленной работе для исследования устойчивости водорослей к окислительному стрессу использован комплексный подход, т.е. сочетание методов оценки антиоксидантного потенциала организмов, метаболизма АФК и функциональной активности фотосинтетического аппарата макрофитов. Работа проведена на современном методологическом уровне с применением методов оксиметрии и спектрофотометрии. Кроме того, использованы классические методические подходы к эколого-физиологическому изучению фотосинтеза морских прикрепленных водорослей (Титлянов, 1978) и общепринятые методы химического анализа в гидробиологических исследованиях (Методы, 1979).

Основные сокращения: ФОС - фотоокислительный стресс; АОС - антиоксидантная система; АФК -активные формы кислорода; СОД - супероксиддисмутаза; КАТ - каталаза; АЛО - аскорбатпероксидаза; ГР - глутатионредуктаза; АсК - аскорбат; ГЛ - глутатион; МДА - малоновый деальдегид; ПОЛ -перекисное окисление липидов; Р_мах - скорость потенциального фотосинтеза; Кар - каротиноиды.

Положения, выносимые на защиту.

1. Активность и содержание основных компонентов АОС защиты массовых видов
макроводорослей Японского моря определяются их таксономической и биогеографической
принадлежностью.

2. Устойчивость морских макроводорослей к ФОС в середине солнечного дня летних месяцев связана с их широтным распространением и определяется динамикой активности и содержания антиоксидантных компонентов аскорбат-глутатионового цикла в тканях макрофитов. В этот период реакция на кратковременное повышение температуры воды процессов рециклирования и регенерации низкомолекулярных антиоксидантов у макроводорослей субтропического и бореального генезиса различна.

3. Накопление каротиноидов-антиоксидантов и повышение активности антиоксидантных ферментов является одним из механизмов акклиматизации макроводорослей умеренных широт к понижению температуры воды до 5-10С. Такие перестройки способствуют устойчивости макрофитов к ФОС в холодное время года в условиях умеренной освещенности и не влияют на стресс-устойчивость видов при дополнительной нагрузке света высокой интенсивности.

4. Снижение содержания каротиноидов и инактивация пероксид-детоксипирующих ферментов в тканях морских макрофитов в условиях длительного воздействия высоких температур (выше 20С для бореальных видов и выше 25С для тропическо-низкобореальных видов) повышают чувствительность водорослей к ФОС при дополнительной нагрузке высокой освещенности.

Степень достоверности результатов. Достоверность результатов обеспечена применением стандартных методик сбора водорослей, объемом фактического материала (2499 образцов для оценки физиологического состояния водорослей и 2347 образцов для биохимического анализа), собранного в ходе многолетних (2009-2011 гг.) исследований. Особое внимание уделено также выбору наиболее однородного материала, многократности в повторах экспериментов и статистической обработке оригинальных данных. Результаты исследований подтверждены табличными данными и графическими изображениями.

Апробация работы. Результаты исследований и материалы диссертационной работы были представлены на: XII Всероссийской молодежной школе-конференции по актуальным проблемам химии и биологии (Владивосток, 2009); IX Региональной конференции студентов, аспирантов вузов и научных организаций ДВ России (Владивосток, 2010); Всероссийском симпозиуме «Растение и стресс» (Москва, 2010); II Asia Pacific Coral Reef Symposium «Collaboration for Coral Reef Conservation in a changing climate» (Phuket, 2010); Международной конференции «Физиология растений - фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий» (Нижний Новгород, 2011); Всероссийской конференции с международным участием «Физиологические, биохимические и молекулярно-генетические механизмы адаптации гидробионтов» (Борок, 2012); ежегодных научных конференциях Института биологии моря им. А.В. Жирмунского (2010 - 2013 гг.; 2015 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ, в том числе 2 - в изданиях, рекомендованных ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов работы, результатов, обсуждения, выводов и списка литературы,

включающего 420 источников, из которых 381 на иностранном языке, а также приложения. Работа изложена на 205 страницах, иллюстрирована 1 схемой, 24 рисунками и 19 таблицами.

Личный вклад автора. Работа выполнена в лаборатории физиологии автотрофных организмов Института биологии моря имени А.В. Жирмунского ДВО РАН и является продолжением многолетних исследований лаборатории по изучению процессов устойчивости и адаптации морских макрофитов (Титлянов и др., 1975, 1987; Ли, Титлянов, 1978; Ядыкин, Титлянов, 1980;Titlyanov et al., 1992а, b; Yakovleva, Titlyanov, 2001 и др.) и симбиотических кораллов (Титлянов и др., 1988, 2002; Titlyanov et al., 2002, 2004; Yakovleva et al., 2009 и др.) к колебанию факторов окружающей среды (главным образом освещенности и температуры). В основу настоящей работы положены результаты экспериментальных исследований, проведенных автором на акваториях залива Петра Великого Японского моря в течение 2009-2011 гг. Экспериментальная работа, анализ полученных данных и их обобщение и сопоставление с литературными источниками проведены лично автором.

Благодарности. Автор выражает глубокую признательность проф., д.б.н. Э.А. Титлянову и к.б.н. И.М. Яковлевой за помощь на всех этапах планирования, выполнения и написания работы. Особую благодарность выражаю И.М. Яковлевой за практическую помощь в освоении методик, ценные методологически консультации, а также к.б.н. Ю.В. Набивайло за действенную помощь в проведении экспериментов.

Генерация активных форм кислорода у водных растений под действием температуры

Существование водных растений как фотоавтотрофов неразрывно связано с поглощением и утилизацией солнечной энергии и окислительно-восстановительными превращениями молекулярного кислорода в процессе фотосинтеза. Поскольку макроводоросли являются прикрепленными организмами, воздействие света они испытывают постоянно. Поэтому макроводоросли функционируют в среде, которая содержит высокие локальные концентрации кислорода, образующиеся в результате фотоокисления воды в хлоропластах. Такой феномен отмечен у большинства литоральных водорослей (Henley et al, 1991, Henley, 1992; Sagert et al, 1997; Abdala-Diaz et al, 2006; Varela et al., 2006), водорослей литоральных ванн (Hanelt et al., 1993, 1997; Ganzon-Fortes, 1999; Guenther, 2011; Gillis, 2014), а также водорослей верхней сублиторали в периоды их максимальной фотосинтетической продуктивности (Кпоор, Bate, 1988; Hader et al, 1997; Gomez et al, 1997; Hanelt et al., 1997). Принимая во внимание, что световое насыщение фотосинтеза большинства литоральных видов макроводорослей умеренных широт проис-ходит при интенсивности света, не превышающей 200-400 мкЕ/м сек в зависимости от их систематического положения (Johansson, Snoeijs, 2002), то даже при относительно невысокой освещенности лишь часть световой энергии, поглощенной пигментами, может быть использована в фотохимических реакциях (см. обзор, Hanelt et al., 2003). При возникновении дисбаланса между процессами поглощения и утилизации световой энергии увеличивается количество возбужденных форм фотосинтетических пигментов и быстро нарастает генерация потенциально токсичных активных форм кислорода (АФК): синглетного кислорода Ог), супероксидного анион-радикала (02,_), пероксида водорода (Н2Ог), гидроксильного радикала (НО ) и др. (см. обзоры: Reddy, Raghavendra, 2006; Bischof, Rautenberger, 2012). Эти формы кислорода обладают высокой реакционной способностью и могут окислять практически все классы биологических молекул - белки, липиды мембран, нуклеиновые кислоты (см. обзор, Sharma et al., 2012). При оптимальных условиях произрастания водные растения способны поддерживать внутриклеточную концентрацию АФК на определенном стационарном уровне благодаря работе защитных антиоксидантных систем, которые играют ключевую роль в предотвращении повреждений окислительного характера (см. обзор, Bischof, Rautenberger, 2012). Однако при нарушениях работы фотосинтетического аппарата, ведущих к инактивации фотосинтеза, феномену известному как фотоингибирование (Hanelt et al., 2003), у водных растений, несмотря на функционирование антиоксидантов, наблюдается усиление генерации АФК (см. обзор, Aguilera, Rautenberger, 2012). Так, например, у водорослей из рода Ulva, обитающих в тропических и субтропических широтах, показано, что в не стрессовом состоянии концентрация Н202 в их тканях не превышает 200-300 нмоль/г сыр. веса (Lu et al, 2006; Pereira et al., 2009; Gonzalez et al., 2010). Однако летом в период отливов содержание этой АФК может возрастать до 3-4 мкмоль/г сыр. веса (Collen et al, 1995; Sung et al, 2009). Аналогичный феномен отмечен также для ряда макроводорослей Балтийского моря при повышении температуры воды (Abrahamsson et al., 2003; Choo et al., 2004) и макрофитов субтропических широт при действии высоких интенсивностей света (Collen et al., 1995; Shiu, Lee, 2005; Lee, Shiu, 2009). Из литературы известно, что повышение продукции АФК в процессе фотосинтеза ведёт к развитию, так называемого, фотоокислительного стресса (Foyer et al, 1994а, b; Apel, Hirt, 2004; Reddy, Raghavendra, 2006). В физиологические исследования этот термин введен в 1994 году С. X. Фоером с сотр. (Foyer et al., 1994а). По мнению этих авторов, «фотоокислительный стресс» (ФОС) - это светозависимое усиление генерации АФК в клетках фотоавто-трофов, которое ведёт к нарушению баланса между про- и антиоксидантами и интенсификации окислительных процессов в тканях. Следует отметить, что развитие ФОС у водных растений происходит не только при действии высоких интенсивностей света, как было показано на ряде макроводорослей субтропических (Collen, Pedersen, 1996; Bischof et al., 2003; Reis et al., 2011), арктических (Aguilera et al, 2002a; Dummermuth et al, 2003) и умеренных широт (Collen et al, 1995; Sampath-Wiley et al., 2008; Li et al, 2010), но и при достаточно низкой освещенности в результате действия любых неблагоприятных факторов среды, которые провоцируют дисбаланс между процессами поглощения и утилизацией световой энергии (см. обзоры: Aguilera, Rautenberger, 2012; Bischof, Rautenberger, 2012). Одним из таких факторов является температура воды, флуктуации которой значительно влияют на активность фотосинтеза у водных растений, особенно у обитающих в умеренных широтах (Davison, Davison, 1987; Davison, 1991). Ряд работ последних лет убедительно показывает, что флуктуации температуры могут оказывать неблагоприятное действие на фотосинтетические процессы и метаболизм реактивного кислорода у морских макрофитов (Collen, Davison, 2001; Choo et al, 2004; Cruces et al., 2012a). Кроме того, не исключено, что по аналогии с высшими растениями (Mishra et al, 1993; Hasanuzzaman et al., 2013) температурные условия обитания водорослей способны существенно модулировать их про-антиоксидантный отклик на действие дополнительных стрессовых факторов. К сожалению, сведения об индукции АФК и функционировании антиоксидантов у морских макроводорослей умеренных широт в условиях колебания температурного режима немногочисленны. А вопрос о том, как температура влияет на формирование механизмов устойчивости макрофитов к ФОС остается открытым.

Как известно фотосинтезирующие организмы, осуществляющие оксигенный фотосинтез (как высшие растения, так и водоросли) существуют в условиях высоких концентраций молекулярного кислорода, образующегося в процессе фотоокисления воды в водоокисляющем комплексе ФС П. Сам по себе кислород не является особо реакционно способной молекулой (Gill, Tuteja, 2010), однако, при возбуждении атомов кислорода или на пути своего одноэлектронного восстановления он приобретает дополнительный электрон и становится активным окислителем, образуя промежуточные соединения, обладающие высокой реакционной способностью - так называемые активные формы кислорода, АФК (см. обзор, Полесская, 2007). Предполагается, что около 1% образованного в клетках растений кислорода преобразовывается в АФК в таких клеточных компартментах, как хлоропласты, митохондрии и пероксисомы (Asada, Takahashi, 1987).

Следует отметить, что поскольку водоросли являются фотоавтотро-фами, образование АФК является неотъемлемой характеристикой их фотосинтеза, а процессы генерации АФК аналогичны таковым, отмеченным у высших растений (Gill, Tuteja, 2010). К наиболее токсичным АФК для растений относят: синглентный кислород 102, супероксидный анион-радикал 02\ перекись водорода Н202, и гидроксил-радикал НО", а также его реактивные производные (Колупаев, 2007).

Уссурийский залив, б. Соболь, Японское море

Опыты по изучению влияния долговременной температурной акклимации (в диапазоне 5-30С) и ее опосредованного воздействия на устойчивость двух видов морских красных водорослей A. flabelliformis и С. pinnulatus к искусственным высоким интенсивностям видимой радиации проводили в апреле-мае 2009 и 2010 гг.

Средних размеров талломы водорослей помещали в сосуды (V= 4 л) с фильтрованной морской водой с добавлением среды Provazoli (PES). Сосуды переносили в термостатированные камеры, в которых поддерживалась постоянная температура 5С, 10С, 15С, 20С, 25С или 30С. Таким образом, экспериментальные варианты были разделены на 6 групп. В каждом температурной группе экспонировали по 16 талломов каждого вида водорослей. Водоросли культивировали 3 недели в заданных температурных условиях при постоянной аэрации и интенсивности света 190-200 мкЕ/(м сек), которая являлась насыщающей, но не ингибирующей фотосинтетические процессы водорослей. Фотопериод составлял 12 ч света: 12 ч темноты. Воду меняли каждые 3 дня. По окончанию периода акклимации по четыре таллома А. flabelliformis и С. pinnulatus каждой температурной группы были проанализированы на активность антиоксидантных ферментов. Дополнительно проводили оценку интенсивности перекисного окисления липидов (ПОЛ), фотосинтетической продукции и содержания фотосинтетических пигментов. Для анализа выше указанных параметров использовали талломы весом 300-600 мг. У оставшихся талломов водорослей каждой экспериментальной группы (5С, 10С, 15С, 20С, 25С и 30С) отбирали верхушечные части талломов площадью 20-30 мм и помещали в открытые стеклянные кюветы, диаметром 30 см с культуральной средой PES при постоянной аэрации (рис. 6). В каждом температурном варианте экспонировали по 48 фрагментов водорослей, слой среды над фрагментами варьировали от 4 до 5 см. Перед проведением экспериментов объекты оставляли на ночь при соответствующих температурах для восстановления после возможного повреждения.

На следующий день кюветы с экспериментальным материалом экспонировали на ярком свету в течение 4 часов (с 11 до 15 ч). Источником света служили лампы белого света ДРЛ-700 (Россия), световой поток которых по спектральному составу соответствовал ФАР (400-720 нм). Интенсивность падающего света была постоянна и составляла 900 мкЕ/(м сек). Интенсивность ФАР соответствовала таковой в природе, в полдень типичного летнего дня в Амурском заливе Японского моря.

Установка по культивированию водорослей в экспериментах по изучению действия температуры на устойчивость растений к высоким интенсивностям видимого света. 1 - кюветы для объектов; 2 -термостатируемая камера.

Температура среды в кюветах в течение световой экспозиции поддерживалась соответственно температурам приакклимации. После проведения световых экспозиций кюветы с водорослями возвращали в исходные условия культивирования согласно температурным вариантам. В течение эксперимента контрольные образцы A. flabelliformis и С. pinnulatus культивировали при соответствующих температурах и интенсивности света 190-200 мкЕ/(м сек). Контрольные и экспериментальные пробы отбирали до и после световой экспозиции, а также через 20 ч постстрессового периода. Анализировали активность антиоксидантных ферментов, содержания Н2Ог в тканях, интенсивность ПОЛ, содержание фотосинтетических пигментов и скорость нетто-фотосинтеза макрофитов. Все эксперименты выполнены в трех повторностях.

Хлорофиллы и каротиноиды экстрагировали по методу Д.И. Сапож-никова и сотр. (1964). Для анализа отбирали только вегетативные части, средних по величине и не имеющих повреждений, талломов. Для анализа отбирали наиболее активно растущие части средних по величине и не имеющих внешних повреждений талломов: у красных водорослей (апикальный рост) пробы площадью 40-50 мм без базальной части; у зеленых водорослей (диффузный рост) - высечки из средней части талломов диаметром 2-2.5 см (Титлянов, 1978). Величина навески для анализа колебалась от 200 до 500 мг. В каждую пробу материала, взятого для анализа, отбирали 1-2 растения. Количество проб для анализа 4-5.

Свежие водоросли растирали со стеклянным песком в холодном 90% ацетоне при добавлении гидрокарбоната и сульфата натрия для нейтрализации клеточного сока. Полученные экстракты центрифугировали при 8000 об/мин в течение 10 мин при температуре 4С. Спектры поглощения экстрактов регистрировали на спектрофотометре UV- 2101 PS (Shimadzu, Япония).

Устойчивость морских макрофитов к фотоокислительному стрессу в условиях кратковременной флуктуации температуры воды

Статистически значимых отличий (Р 0.05) в содержании маркеров окислительного стресса (МДА и Н202) у A. flabelliformis от показателей контрольных растений после 3-х часового воздействия повышенной температуры воды не найдено (рис. 13 Б, В). Напротив, у С. pinnulatus после экспозиции в аналогичных условиях наблюдали 1.5-кратное повышение уровня МДА и 2-х кратное увеличение содержания Н202 по сравнению с контрольными образцами (рис. 13 Б, В). По окончанию комбинированной стрессовой экспозиции в тканях обеих водорослей отмечали более интенсивную продукцию МДА и Н202: у A. flabelliformis эти показатели превышали контрольные значения соответственно в 1.5 и 2 раза, а у С pinnulatus - соответственно в 2.5 и 3 раза. В постстрессовый период у облученных образцов A. flabelliformis наблюдали снижение содержания МДА и Н202 до уровня контрольных растений, тогда как у облученного С. pinnulatus содержание этих маркеров оставалось на уровне постэкспозиционных показателей.

После воздействия термостресса статистически значимых (Р 0.05) отличий активности антиоксидантных ферментов по отношению к контрольным растениям в тканях A. flabelliformis не выявлено (рис. 14 А-В). У С. pinnulatus термостресс вызывал 2.5, 2-х и 4-х кратное повышение (Р 0.05) активности СОД, КАТ и АЛО, соответственно. Аналогичное повышение активности КАТ и АЛО было зарегистрировано у этой водоросли после действия комбинированного стресса (рис. 14 Б, В), тогда как в активности СОД было отмечено 2-х кратное снижение (Р 0.05) по сравнению с контрольными растениями (рис. 14 А). У A. flabelliformis комбинированный стресс вызвал 2-3-х кратное увеличение активности всех исследованных ферментов. По окончании постстрессового периода активности СОД и КАТ в тканях облученных образцов A. flabelliformis и С. pinnulatus оставались на уровне постэкспозиционных значений (рис. 14 А, Б). При этом активность АПО в тканях исследованных водорослей снижалась и в конце эксперимента не отличалась (Р 0.05) от уровня контроля для A. flabelliformis, однако, была в 2 раза ниже (Р 0.05), чем в контрольных растениях для С. pinnulatus (рис. 14 В).

Активность антиоксидантных ферментов: СОД (А), КАТ (Б) и АПО (В) в тканях A. flabelliformis и С. pinnulatus после З-ч термостресса (26С) или З-ч комбинированного стресса (действие высоких интенсивностей солнечной радиации при 26С) с последующим восстановлением на слабом свету при 22С. Обозначения как на рис. 13 Содержание аскорбата (АсК) в тканях A. flabelliformis и С. pinnulatus за 3 ч термостресса существенно (Р 0.05) возрастало и к концу экспозиции превышало значения контрольных образцов в 2 и 1.5 раза, соответственно (рис. 15 А). Изменения в содержании глутатиона (ГЛ), зарегистрированные у исследованных водорослей после экспозиции в аналогичных условиях, были различны. У A. flabelliformis уровень ГЛ не отличался от контрольных значений, тогда как у С. pinnulatus содержание этого антиоксиданта превышало таковое контрольных растений в 1.5 раза (рис. 15 Б). По окончанию комбинированного стресса в тканях A. flabelliformis наблюдали увеличение содержания АсК и ГЛ в 1.8 и 1.5 раза по отношению к контролю. У С. pinnulatus облучение в условиях повышенной температуры воды вызывало незначительное, но статистически значимое (Р 0.05) снижение содержания АсК (рис. 15 А) и 2-х кратное увеличение содержания ГЛ (рис. 15 Б) по сравнению с уровнем, зарегистрированным в контрольных растениях. По окончанию постстрессового периода содержание ГЛ в тканях облученных образцов обеих водорослей восстановилось до уровня контроля (рис. 15 Б). Аналогичные результаты были получены для АсК у A. flabelliformis (рис. 15 А). В тоже время содержание АсК у С. pinnulatus составляло лишь треть от количества, зарегистрированного в контрольных растениях. A. flabelliformis

Факторы среды. В целом, динамика абиотических факторов среды в местах обитания исследованных водорослей была одинаковой за исключением освещенности в весенний период. В прибрежном мелководье б. Соболь, характеризующемся отсутствием ледостава, суммарный поток фотосинтетически активной радиации, падающей на поверхность воды у (ФАРп), был максимальным в марте-апреле (35-40 моль/м сут) и июле-сентябре (38-45 моль/м2 сут) (рис. 18 А). Максимальная интенсивность ФАРп у с апреля по сентябрь составляла 1800-1900 мкЕ/м сек. На мелководье м. Красный Амурского залива максимальная суточная доза ФАР в месте произрастания водорослей была отмечена после таянья льда во второй и у третьей декадах апреля (31 моль/м сут) , а также в августе-сентябре (29-38 моль/м сут) (табл. 5). Высокая суммарная доза ФАРп весной, по всей вероятности, связаны с повышением солнечной активности в этот период года. Летний максимум суммарной солнечной радиации объясняется завершением во второй половине лета периода высокой повторяемости пасмурных и дождливых дней, характерного для дальневосточного региона с мая по первую декаду июля, а также повышением прозрачности атмосферного воздуха в конце августа-сентябре. Температура воды, увеличиваясь к лету, поднималась в августе до 24.0-25.0С, затем постепенно снижаясь, принимала отрицательные значения в декабре и держалась на этом уровне до конца февраля в б. Соболь (рис. 18 Б) и до конца марта в Амурском заливе (табл. 5). На основании сезонной динамики температуры в месте произрастания исследованных водорослей были выделены два условных периода в течение вегетационного цикла растений: холодные месяцы, когда среднемесячная температура воды составляла менее 7С (ноябрь-апрель), и теплые месяцы, когда среднемесячная температура воды равнялась или была выше 11 С (июнь-сентябрь). Соленость варьировала незначительно и составляла в среднем 32%о (не показано).

Изменения фотосинтетически активной радиации на поверхности воды (ФАРп) (А) и температуры воды (Б) в б. Соболь (Уссурийский залив, Японское море) с октября 2005 г. по октябрь 2006 г., и с января по декабрь 2010 г. ФАРп представлена как интегрированные суточные дозы, рассчитанные на основе интенсивностеи света, падающих на поверхность воды ежедневно от рассвета до заката в течение исследуемого периода.

Сезонные изменения фотоокислительных и антиоксидантных процессов макроводорослей

Таким образом, снижение функциональной активности ФА водорослей в середине дня в летние месяцы обусловлено повышением концентрации АФК и накоплением продуктов ПОЛ в тканях растений. Способность к поддержанию стабильно-высоких активностей ключевых антиоксидантных ферментов и содержания антиоксидантов аскорбат-глутатионового цикла в середине летнего солнечного дня является важным защитным механизмом против фотоокислительного стресса при адаптации водорослей умеренных широт к условиям литорали.

Лабораторные эксперименты по изучению влияния кратковременного светового или температурного стрессов, а также их комбинированного воздействия на окислительные и антиоксидантные процессы водорослей верхней сублиторали Японского моря (тропическо-низкобореального Ahnfeltiopsis flabelliformis и низкобореального Chondrus pinnulatus) позволили оценить вклад температуры в их регуляцию. Нами установлено, что при кратковременном (4 ч) воздействии высоких интенсивностей света (что соответствует освещению в природе в середине солнечного дня на мелководье Амурского залива) в условиях комфортных для видов температурах (20С для А. flabelliformis и 15С для С. pinnulatus) оба исследованных вида проявляют высокую устойчивость к ФОС. Об этом свидетельствует отсутствие достоверных изменений в уровне МДА и Н2Ог в тканях A. flabelliformis и С. pinnulatus по окончании стрессовой световой экспозиции (рис. 23).

Устойчивость исследованных видов к действию высоких интенсивностей света обеспечивается повышением активности антиоксидантных ферментов (рис. 24). Аналогичный механизм защиты от светового стресса отмечали ранее у красных макроводорослей Арктики (Aguilera et al, 2002b), тропической бурой водоросли Dictyota dichotoma (Davison et al., 2000), субтропической зеленой водоросли Ulva rotundata (Bischof et al., 2003) и красной водоросли Gracilariopsis tenuifrons, культивируемой в лабораторных условиях (Rossa et al, 2002).

Из литературы известно, что эффективными защитными механизмами стресс-адаптации морских литоральных макроводорослей к действию высоких интенсивностей света также являются: диссипация излишней световой энергии фотосинтетическим аппаратом (Demmig-Adams, 2003; Adams et al, 2006); накопление каротиноидов, предотвращающих фотодеструкцию хлорофилла (Anderson, Robertson, 1960; Britton, 1995; Frank, Cogdell, 1996) и функционирующих в роли антиоксидантов (Shimidzu et al., 1996; Woodall et al, 1997) и динамическое фотоингибирование фотосинтеза (Franklin, Larkum, 1997; Figueroa, Gomez, 2001). Подобный феномен наблюдали ранее в многочисленных исследованиях литоральных водорослей из умеренных широт при повышении уровня инсоляции в месте обитания (Hanelt et al., 1992, 1993; Hanelt, 1998; Hader et al., 1997; Figueroa et al., 1997 и др.). Нами он зарегистрирован у низкобореального С. pinnulatus в условиях светового стресса (рис. 21 Б). Следует отметить, что важная роль в процессах фотозащиты у красных водорослей может принадлежать микоспорин-подобным аминокислотам, накопление которых показано в условиях светового стресса у таких видов, как Plocamium cartilagineum (Hoyer et al., 2002) и Chondrus crispus (Karsten et al., 2009a).

Таким образом, в условиях температурного оптимума как низкобо-реальные, так и тропическо-низкобореальные виды водорослей Японского моря устойчивы к световому стрессу. Подобный феномен может быть обусловлен тем, что при совместном произрастании на небольших глубинах (1.5-2 м) эти виды в процессе своего онтогенетического развития адаптировались к высоким интенсивностям падающего света благодаря способности к эффективной диссипации излишней световой энергии, накоплению соединений-фотопротекторов, а также адаптивной активации АОС.

В условиях комбинированного стресса (кратковременное действие высоких интенсивностей солнечной радиации при температуре 26С) для анфельтиопсиса и хондруса характерно снижение Рмах и накопление в тканях маркёров окислительного стресса (рис. 13 А-В). Следует отметить, что у тропическо-низкобореального A. flabelliformis после периода восстановления на слабом свету уровень Рмях, МДА и Н2Ог соответствует контрольным значениям. Подобное снижение уровня маркёров окислительного стресса у этого вида в постстрессовый период может быть обусловлено 2-3-х кратным повышением активности антиоксидантных ферментов и накоплением низкомолекулярных антиоксидантов в тканях анфелтиопсиса при действии комбинированного стресса. У низкобореального С. pinnulatus снижение фотосинтетической активности и интенсификация окислительных процессов носят необратимый характер, так как в постстрессовый период у облученных образцов восстановления показателей Рмах, МДА и Н2Ог до уровня контроля не происходит (рис. 13 А-В). Низкая устойчивость бореального вида к комбинированному стрессу обусловлена негативным действием повышенной температуры воды на функционирование его ФА в условиях высоких интенсивностей света. Схожие результаты получены для бурой водоросли Saccharina latissima из Арктики в условиях совместного действия светового и температурного стресса (Heinrich et al, 2012). Подобный эффект может быть обусловлен тем, что субоптимально высокие температуры усугубляют ингибирующее действие высоких интенсивностей света на фотосинтетические процессы, вызывая появление триплетных форм Хл в ФС II, а также нарушение процессов транспорта электронов на уровне обеих фотосистем (Ludlow, 1987; Becker, 2010). Это, в свою очередь, приводит к повышению уровня продукции АФК в фотосинтезе и повреждению ими фотосинтетических пигментов и мембран, ферментов темновых реакций, а также белка D 1 в ФСП (см. обзоры, Asada, Takahashi, 1987; Davison, Pearson, 1996; Lesser, 2006).