Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 15
1.1 Температура как лимитирующий фактор среды 15
1.2 Адаптации гидробионтов к изменению температурного режима 17
1.3 Холодоустойчивость беспозвоночных 21
1.3.1. Постановка проблемы исследования вопроса холодоустойчивости 21
1.3.2 Понятие холодоустойчивости. Стратегии и адаптации 23
1.4 Неспецифические механизмы стресс–адаптации 26
1.4.1 Антиоксидантная система как ключевой механизм неспецифической клеточной стресс резистентности 26
1.5 Энергетический метаболизм гидробионтов в условиях стресса 30
1.5.1 Основы энергетического баланса живых организмов 31
1.5.2 Энергетика и регуляция метаболизма ракообразных 32
1.6 Озеро Байкал и изменения климата. Феномен несмешиваемости фаун 37
2 Объект и методы исследования 40
2.1.1 Систематика и экология изучаемых видов 41
2.1.2 Известные показатели терморезистентности и термопреференции изучаемых видов. 46
2.1.3 Методика сбора и содержания исследуемых видов амфипод 47
2.2 Методы постановки и проведения экспериментов 48
2.2.1 Длительная акклимация амфипод при температурах, отличных от предпочитаемых температур исследуемых видов 49
2.2.2. Длительная акклимация амфипод при температурах, отличных от среднегодовой 50
2.3 Методы биохимического анализа 52
2.3.1 Определение активности ферментов антиоксидантной системы и лактатдегидрогеназы 2.3.1.1 Выделение и пробоподготовка образцов 52
2.3.1.2 Определение активности каталазы 52
2.3.1.3 Определение активности пероксидазы 53
2.3.1.4 Определение активности глутатион S-трансферазы 54
2.3.1.5 Определение активности лактатдегидрогеназы 54
2.3.1.6 Определение концентрации общего белка по методу М. Бредфорд 55
2.3.2 Определение содержания энергетических метаболитов 55
2.3.2.1 Выделение метаболитов и пробоподготовка 55
2.3.2.2 Определение содержания лактата 56
2.3.2.3 Определение содержания глюкозы и гликогена 57
2.3.2.4 Определение содержания аденозинтрифосфорной кислоты 58
2.3.3 Определение активности ферментов аэробного метаболизма 59
2.3.3.1 Выделение и подготовка образцов 59
2.3.3.2 Определение активности цитратсинтазы и цитохромоксидазы 59
2.4 Обсчет и статистическая обработка данных 60
3 Результаты 61
3.1 Оценка выживаемости байкальских и голарктических амфипод в условиях длительной акклимации к температурам, отличным от предпочитаемых 61
3.2 Оценка выживаемости байкальских и голарктических амфипод в условиях длительной акклимации к температурам, отличным от среднегодовой температуры литорали оз. Байкал 63
3.3 Оценка неспецифического стресс-ответа по показателям изменения активности ферментов антиоксидантной системы у амфипод в условиях длительной акклимации к температурам 65
3.3.1 Оценка активности пероксидазы у амфипод в условиях длительной акклимации к температурам, отличным от предпочитаемых 65
3.3.2 Оценка активности каталазы у амфипод в условиях длительной акклимации к температурам, отличным от предпочитаемых 68
3.3.3 Оценка активности глутатион S-трансферазы у амфипод в условиях длительной акклимации к температурам, отличным от предпочитаемых 71
3.4 Оценка неспецифического стресс-ответа по показателям изменения компонентов антиоксидантной системы у амфипод в условиях длительной акклимации к температурам, отличным от среднегодовой температуры литорали оз. Байкал 74
3.4.1 Оценка активности пероксидазы у амфипод в условиях длительной акклимации к температурам, отличным от среднегодовой температуры литорали оз. Байкал 74
3.4.2 Оценка активности каталазы у амфипод в условиях длительной акклимации к температурам, отличным от среднегодовой температуры литорали оз. Байкал 77
3.4.3 Оценка активности глутатион S-трансферазы у амфипод в условиях длительной акклимации к температурам, отличным от среднегодовой температуры литорали оз. Байкал 79
3.5 Оценка аэробного и анаэробного энергетического метаболизма у амфипод в условиях длительной акклимации к температурам, отличным от предпочитаемых 82
3.5.1 Оценка содержания глюкозы у амфипод в условиях длительной акклимации к температурам, отличным от предпочитаемых 82
3.5.2 Оценка содержания гликогена у амфипод в условиях длительной акклимации к температурам, отличным от предпочитаемых 84
3.5.3 Оценка содержания АТФ у амфипод в условиях длительной акклимации к температурам, отличным от предпочитаемых 86
3.5.4 Оценка активности цитохромоксидазы у амфипод в условиях длительной акклимации к температурам, отличным от предпочитаемых 88
3.5.5 Оценка активности цитратеинтазы у амфипод в условиях длительной акклимации к температурам, отличным от предпочитаемых 89
3.5.6 Оценка содержания лактата у амфипод в условиях длительной акклимации к температурам, отличным от предпочитаемых 91
3.5.7 Оценка активности лактатдегидрогеназы у амфипод в условиях длительной акклимации к температурам, отличным от предпочитаемых 93
3.6 Оценка аэробного и анаэробного энергетического метаболизма у амфипод в условиях длительной акклимации к температурам, отличным от среднегодовой температуры литорали оз. Байкал 96
3.6.1 Оценка активности цитохромоксидазы у амфипод в условиях длительной акклимации к температурам, отличным от среднегодовой температуры литорали оз. Байкал 96
3.6.2 Оценка активности цитратсинтазы у амфипод в условиях длительной акклимации к температурам, отличным от среднегодовой температуры литорали оз. Байкал 99
3.6.3 Оценка содержания лактата у амфипод в условиях длительной акклимации к температурам, отличным от среднегодовой температуры 101
3.6.4 Оценка активности лактатдегидрогеназы у амфипод в условиях длительной акклимации к температурам, отличным от среднегодовой температуры литорали оз. Байкал 103
Выводы 120
Список используемых сокращений 122
- Адаптации гидробионтов к изменению температурного режима
- Систематика и экология изучаемых видов
- Оценка активности глутатион S-трансферазы у амфипод в условиях длительной акклимации к температурам, отличным от предпочитаемых
- Оценка активности лактатдегидрогеназы у амфипод в условиях длительной акклимации к температурам, отличным от среднегодовой температуры литорали оз. Байкал
Адаптации гидробионтов к изменению температурного режима
Адаптация - это структурные и функциональные приспособления организмов, повышающие их шансы на выживание в условиях постоянно изменяющейся окружающей среды (Чернова, Былова, 2004). Способность к адаптации является одним из важнейших свойств живых организмов.
Для всех живых организмов адаптационные уровни делятся на: этологические (поведенческие), то есть примеры безусловных рефлексов; морфо-анатомические - изменение особенностей строения и формы тела, связанных с жизнедеятельностью организма; физиологические - совокупность физиологических реакций, позволяющих организму адаптироваться к изменению условий среды, а также поддерживать внутренний гомеостаз; биохимические и молекулярные, проявляющиеся на уровне внутриклеточных процессов (Константинов, 1986; Чернова, Былова, 2004).
У гидробионтов выделяют два направления адаптивных реакций к изменению температуры среды: выбор места обитания, характеризующегося устойчивыми температурами или условиями, позволяющими организмам избегать воздействий критических температур, при помощи поведенческих реакций (Певз-Хоке, 2005; Степановских, 2003) и выработка различных физиологических и биохимических адаптивных реакций (Степановских, 2005). Одной из наиболее распространенных поведенческих реакций является реакция избегания, когда организм стремится покинуть зону стрессового фактора. Большинство гидробионтов обладает развитыми поведенческими способами регуляции теплообмена. Поведенческие адаптационные реакции к флуктуациям температуры многообразны и встречаются в различных группах организмов (Elliot, Mitchell, 1973; Hall et al., 1978; Siemien, Stauffer, 1989).
На примере амфипод показано активное избегание зон с неблагоприятными температурными (Тимофеева 2000; Паномарева, 1976), волновыми (Hellou et al, 2005) или гидрохимическими (Roberts et al, 2008) условиями. К поведенческим адаптивным реакциям также относят и миграции водных организмов. Показано, что байкальские эндемичные амфиподы Eulimnogammarus verrucosus мигрируют на глубину в летний сезон, когда литораль озера прогревается (Jakob et al., 2016). Некоторые организмы способны также совершать вертикальные миграции для поиска условий с оптимальными температурами (Тахтеев и др., 2004; Lindstrom, 1991; Tsubokura et al., 1997).
В случае, если организму не удается избежать прямого воздействия температуры, для нейтрализации стрессового воздействия подключаются адаптационные механизмы, основанные на физиологических и молекулярно-биохимических компенсаторных механизмах. Так, в работах Kinne (1964) на примере антомедузы Cordylophora caspia показаны изменения размера и формы тела, числа, длины и диаметра щупалец, изменение размеров клеток, количества клеток полипов, а также изменение размеров ядер и нематоцистов в ходе экспериментальной акклимации к длительным изменениям температурного режима. При длительном влиянии повышенной температуры у дафний наблюдали перестройки в частоте сердцебиения. Также отмечали изменение потребления кислорода у рыб Crenichthys и продукции углекислого газа у Anemia salina (Kinne, 1964). У ракообразных изменение температуры вызывает фенотипические изменения цвета, связанные с различиями либо в количестве пигмента в клетке, либо в плотности хроматофоров на единицу площади клетки (Brown, 1934). Биохимическая адаптация играет важную роль при длительном и интенсивном влиянии стрессовых факторов. Этот вид адаптации охватывает все процессы, протекающие в клетках, от эффективности которых зависит нейтрализация стрессового воздействия и восстановление функционального состояния организма (Хочачка, Сомеро, 1988). Рядом исследований выявлено, что у многоклеточных организмов биохимические механизмы адаптации являются видоспецифичными и формируются уже на ранних этапах эмбриогенеза (Feder et al., 1995; Hard, 1996; Feder, Hofmann, 1999).
Согласно А. С. Степановских (2003), «биохимическая адаптация живых организмов к температуре проявляется прежде всего в изменении физико-химического состояния веществ, содержащихся в клетках и тканях». Состояние метаболической активности организмов напрямую зависит от таких макромолекул, как нуклеиновые кислоты и ферменты, поэтому процессы адаптации направлены на сохранение их эффективного функционирования (Stillman, Somero, 1996; Radman et al, 2000 и др.). В ходе биохимической адаптации функциональная активность макромолекул может регулироваться посредством изменения их активности или концентрации, что ведет к нарастанию метаболических реакций, и, как результат, получению организмом продуктов и веществ, незаменимых для поддержания гомеостаза (Горкин, 2006). Так, например, при повышении температуры воды до 11-13 С у видаіі. verrucosus показано увеличение активности ферментов антиоксидантной системы, которые отвечают за утилизацию активных форм кислорода (Axenov-Gribanov et al., 2016). У некоторых видов амфипод при температурном стрессе изменяется ионная регуляция. Например, у видов Е. verrucosus и G. lacustris при повышении температуры среды уменьшается содержание ионов магния - одного из важнейших компонентов регуляторных процессов, связанных с метаболизмом и ростом (Axenov-Gribanov et al., 2016; Jakob et al., 2016).
Температура может оказывать значительный эффект на процессы пероксидации липидов в мембранах клеток, влияя на структуру и функцианальность клетох и их компонентов (Ozturk, Gumuslu, 2004; Lushchak, Bagnyukova, 2006; Dutra et al., 2007). Одним из значительных механизмов воздействия температуры на молекулярном уровне считается ее влияние на вторичную структуру ДНК и РНК. В условиях температурного стресса третичная структура тРНК может потерять способность выполнять свои функции при синтезе белков (Armbraster, 2001; Dionello et al., 2001). Ранее показано, что воздействие критических температур может снижать точность и скорость трансляции (Stephen et al., 2004).
Неоднократно показана температурно-индуцированная регуляция активности генов. В процесс регуляции экспрессии генов включен ряд взаимодействий между белками и нуклеиновыми кислотами со слабыми связями, таким образом, температура может оказывать влияние на регуляцию тех или иных генов. Подобные процессы регуляции могут оказывать как положительный, так и отрицательный адаптивный эффект (Hiining et al, 2013; Michael, 2016).
Температурные флуктуации способны влиять на нормальные регуляторные механизмы, которые участвуют в контроле экспрессии генов, например, препятствовать включению или выключению определенного гена. С другой стороны, это ведет к процессу прямой температурно-индуцируемой активации генов, кодирующих специфические белки или РНК, необходимые клетке при изменившейся температуре (Gabriel et al., 1996; Armbraster, 2001).
В заключение следует отметить, что возникающие в ходе изменения среды негативные последствия и механизмы, позволяющие избежать такие последствия, зависят от скорости изменения параметров внешней среды. Скорость изменения факторов напрямую коррелирует с воздействием на организмы. Если изменение происходит в пределах секунд или минут, организм может не успеть среагировать даже на поведенческом уровне. Постепенное изменение внешних факторов в пределах недель, месяцев или поколений может быть достаточным для формирования адаптации на физиологическом уровне. Таким образом, чем больше времени у организма для адаптации, тем более эффективно происходит перестройка фундаментальных биохимических механизмов, или подключение поведенческих реакций избегания стрессового воздействия.
Систематика и экология изучаемых видов
РОД: EULIMNOGAMMARUS Вazikalova, 1945
Подрод: Eulimnogammarus
Вид: Eulimnogammarus verrucosus (Gerstfeld, 1858)
Вид распространен по всему Байкалу и встречается повсеместно под камнями, начиная с верхней литорали (глубина несколько сантиметров) до глубины 15 метров. Длина тела Е. verrucosus достигает 36 мм. Окраска тела темно зеленая с темными поперечными полосами по заднему краю сегментов (Рис. 2А). Данному виду пресущ осенне-зимний период размножения. Самки с яйцами начинают появляться во второй половине октября, когда температура достигает 6 С. Репродуктивный период заканчивается в июле при температурах 5-6 С. Согласно времени репродуктивного периода, данный вид считается стенотермним, холодолюбивым, размножение которого протекает при 0-5 (6) С, то есть в период времени наиболее низких температур воды в Байкале (Базикалова, 1941; Гаврилов, 1949; Бекман, Деньгина, 1969; Тимофеев, 2010).
Пик выхода молоди начинается примерно в конце мая, а заканчивается во второй половине июля. С начала этого периода молодь встречается у уреза воды и несколько глубже под камнями, где обитает молодь других видов байкальских амфипод. Данному виду характерны высокие темпы роста, так особи достигают значительных размеров уже на первом году жизни. Самки Е. verrucosus откладывают яйца впервые на втором году жизни. Согласно исследованию Говорухиной Е. Б. продолжительность жизни представителей данного вида более двух лет. В летний период особи Е. verrucosus мигрируют на большие глубины (Говорухина, 2005). Летние миграции, по мнению И. В. Вейнберг (1995), возможно, связаны с повышением температуры в верхней литорали. Таким образом, вид избегает влияния изменения температурного режима. Вид распространен за далеко пределы Байкала по р. Ангара на 432 км (Говорухина, 2005).
Показано, что амфиподы вида Е. verrucosus являются термочувствительными. В ранее опубликованных исследованиях гибель данного вида при 25 С составила 50 и 100 % особей через 1,8 и 9 часов, соответственно (Timofeyev et al., 2001). Исследование термопреферендума Е. verrucosus показало, что представители вида отдавали предпочтение зоне, где температура составляла 5-6 С, там концентрировалось до 30 % рачков (Тимофеев, 2000, 2010). Подрод: Philolimnogammarus
Вид: Eulimnogammarus (P.) cyaneus (Dybowsky, 1874)
Длина тела взрослых особей Е. cyaneus достигает 11-15 мм. Окрас данного вида варьирует от оранжевого до темно-голубого (Рис. 2Б). Вид распространен по всей береговой линии озера Байкал, предпочитает каменистый субстрат. Е. cyaneus обитает на глубинах от 0 до 20 метров. Особенностью данного вида является его распространение в узкой зоне в полосе прибоя (где сосредоточено около 90% популяции) (Вейнберг и др., 1994). Половой зрелости Е. cyaneus достигает спустя год жизни. Вид относится к летнему комплексу размножения (Говорухина, 2005). Самки с яйцами начинают появляються в мае, при температуре воды у берегов около 2-3 С. Окончание размножения приходится на период, когда температура достигает 8 С. Продолжительность жизни данного вида составляет 1,5 года.
Вид распространен за пределами Байкала по р. Ангаре на расстояние до 600 км(Базикалова, 1941, 1957;Бекман, Деньгина, 1969). Согласно экспериментальным данным, Е. cyaneus относится к видам с высокой терморезистентностью. Показано, что при 30 С отмечали гибель 100 % особей только через 2,5 часа. Тогда как при температуре 25 С смертность представителей данного вида в течение 10 часов не превышала и 10 %. Далее наблюдали заметное повышение числа погибших особей, так, на период 24 и 48-часового эксперимента, количество погибших особей возростало почти в три раза (Тимофеев, 2000, 2010). В ходе эксперимента показано, что особи Е. cyaneus предпочитают температуру около 11-12 С. Наибольшее количество представителей вида (30 %) концентрировалось в этой зоне (Timofeyev et al., 2001). РОД: GAMMARUS FABRICIUS, 1775
ВИД: Gammarus lacustris Sars, 1863
G. lacustris распространен повсеместно по всей Голарктике. Данный вид обитает преимущественно в стоячих водоемах и способен выживать в условиях изменения широкого спектра абиотических факторов, таких как температура, минерализация и насыщенность воды кислородом (Бирштейн, 1940; Дедю, 1980; Островский, 1990; Сафронов, 1993; Barnard, Barnard, 1983; Karaman, 1984; Vereshchagina et al., 2016). Окраска G. lacustris варьирует от грязно-голубой до коричнево-оранжевой (Рис. 2В). Согласно Г. П. Сафронову (1993) в Байкальском регионе амфиподы G. lacustris населяют водоемы с диапазоном рН от 6,2 до 9,2. Представители вида способны обитать в заморных водоемах благодаря устойчивости к дефициту содержания кислорода, особенно при низких температурах (Бекман, 1954; Кухарев, 2008). Ареал данного вида охватывает Азию от Ирана до низовьев р. Лена, от Урала до Амура. Вид встречается в Карелии, на Кавказе, а также в других районах Западной и Восточной Европы (Коломин, 2014; Макаренко, 2014).
G. lacustris обладает широким и разнообразным спектром питания. Представители данного вида всеядны, но в благоприятных условиях предпочитают детрит и растительную пищу (Бекман, 1954). Репродуктивный период вида G. lacustris приходится на летнее время и может включать несколько пометов. Примечательно, что динамика и сроки размножения меняются в широких пределах, что связано с конкретными условиями водоемов (Бекман, 1954; Нестерович, Рощин, 1988; Нестерович, 1990).
Температура среды имеет важное значение для данного вида амфипод. Например, развитие яиц G. lacustris может протекать в уловиях низких температур (примерно 3-4 C и ниже), тогда как для роста и развития молоди критически важна температура не ниже 8-10 C. Созревание яиц у G. lacustris происходит круглогодично, но под влиянием определенной сезонной динамики (Бекман, 1954).
Вид G. lacustris отличается достаточно широкой приспособленностью к существованию в водоемах с разной минерализацией. В исследовании А. Я. Блабановой (1949) отмечено, что G. lacustris широко распространен в группе Западно-Сибирской низменности и способен обитать в водоемах с соленостью, приближающейся к 10 . Н. К. Дексбахом (1951) данный вид амфипод охарактеризован как эвригалинный.
G. lacustris широко распространен в Байкальском регионе в многочисленных мелководных водоемах, окружающих озеро Байкал (Бекман, Базикалова, 1951). В самом озере данный встречается только в некоторых закрытых заливах и сорах, таких как Посольский, Ангарский и Истокский соры, заливы Чивыркуйский и Провал, губа Крутая и Крохалинная (Сафронов, 1984). Нахождение и распределение G. lacustris в прибрежно-соровой зоне, бухтах и заливах Байкала главным образом зависит от степени их связи с открытым Байкалом, определяющей их гидрологический, химический и температурный режимы, а также от возможности проникновения байкальской фауны амфипод. Так, в прибрежно-соровой зоне Северного Байкала и хорошо изолированном мелководном (до 5 м) Северобайкальском соре G. lacustris обитает в массовом количестве (Черепанов и др., 1977). В Посольском, Истокском сорах и заливе Провал, соединяющихся с Байкалом широкими прорвами, данный вид встречается значительно реже, чем байкальские виды (Снимщиков, 1977).
Представители G. lacustris не встречаются воткрытом Байкале. Некоторыми исследователями это отмечено в контексте изучения феномена несмешиваемости байкальской и общесибирской фаун. Вероятнее всего, главными и определяющими факторами этого являются низкая температура воды в Байкале, особенности гидрохимического состава, а также конкуренция с фауной эндемичных видов. Однако некоторые вопросы остаются нерешенным и по сей день. Почему G. lacustris широко распространен в оз. Хубсугул, хотя его температурный режим близок с режимом оз. Байкал (Сафронов и др., 1986, Сафронов 1996). Что мешает обитать данному виду в заливах водохранилищ Ангары, хотя они соответствуют всем требованиям данного вида по температурным условиям. Влияние конкуренции со стороны байкальских эндемиков, также довольно ограничено, в связи с тем, что практически во всех соровых и заливах оз. Байкал, G. lacustris способен существовать совместно с эндемичными амфиподами (Снимщиков, 1977; Черепанов и др., 1977). В литературе описаны случаи обитания G. lacustris совместно с эндемичными видами (Сафронов, 1993), так и случаи вытеснения данного вида байкальским реликтовым G. fasciatus в ряде прибалтийских озер (Скальская, 1994, 1996, 1998, 2008; Timm, Timm, 1993).
Оценка активности глутатион S-трансферазы у амфипод в условиях длительной акклимации к температурам, отличным от предпочитаемых
По результатам оценки влияния экспериментальной длительной акклимации к пониженным и повышенным температурам (относительно предпочитаемой для каждого вида) байкальских и голарктических амфипод получены результаты, представленные на рисунке 5. Установлено, что длительная акклимация байкальского эндемичного вида Е. verrucosus при температуре 12 С приводила к снижению активности глутатион S-трансферазы (4,698±0,555 нКат/мг белка) относительно контроля (6,969±0,832 нКат/мг белка). В то же время, для байкальского Е. cyaneus наблюдали противоположную ситуацию - возрастание активности глутатион S-трансферазы при всех экспериментальных температурах -1,5 С (10,223±0,552 нКат/мг белка), 6 С (10,387±0,967 нКат/мг белка) и 15 С(11,041±0,542 нКат/мг белка) относительно контроля (9,194±0,729 нКат/мг белка). Согласно полученным данным, длительная экспозиция голарктических амфипод G. lacustris к температурам, отличным от предпочитаемой, приводила к повышению активности глутатион S-трансферазы. Так, наблюдали повышение активности данного фермента при экспозиции к температуре 1,5 С (7,695±0,423 нКат/мг белка), 6 С (8,149±0,380 нКат/мг белка), 12 С (8,693±0,654 нКат/мг белка) относительно контроля (6,743±0,387 нКат/мг белка). Стоит отметить, для G. lacustris также показано значимое отличие активности начального контроля от группы временного контроля (8,287±0,804 нКат/мг белка), что не было отмечено для байкальских видов.
При сравнительном анализе уровней активности начальных контролей глутатион S-трансферазы показаны значимые различия между байкальскими эндемичными видами Е. verrucosus и Е. cyaneus, а также между байкальским Е. cyaneus и голарктическим G. lacustris (Таблица 5).
Оценка активности лактатдегидрогеназы у амфипод в условиях длительной акклимации к температурам, отличным от среднегодовой температуры литорали оз. Байкал
По результатам влияния экспериментальной длительной акклимации к пониженным и повышенным температурам (среднегодовой температуры литорали оз. Байкал) байкальских и голарктических амфипод получены результаты, представленные на рисунке 19. Так, происходило статистически значимое повышение активности лактатдегидрогеназы в 4,6 раза (1203,52±219,82 нКат/мг белка) относительно контроля (257,99±115,81нКат/мг белка) у байкальского эндемичного Е. verrucosus при акклимации к температуре 15 C. Напротив, длительная акклимация байкальского Е. cyaneus при температурах 12 C и 1,5 C приводила к снижению активности лактатдегидрогеназы (188,465±145,523 и 253,919±193,823 нКат/мг белка соответственно) относительно контрольного уровня (546,100± 152,603 нКат/мг белка). Для голарктического G. lacustris показана схожая картина - наблюдали значимое снижение активности лактатдегидрогеназы при длительной акклимации к температурам ниже среднегодовой - 1,5 C (36,040±17,449нКат/мг белка), 12 C (55,371±27,143 нКат/мг белка) и 15 C (30,250±16,461 нКат/мг белка) относительно контроля (243,928±79,514 нКат/мг белка).
При сравнительном анализе уровней активности лактатдегидрогеназы в начальных контролях показаны значимые различия как между байкальскими эндемичными Е. cyaneus и Е. verrucosus, так и между байкальским Е. cyaneus и голарктическим G. lacustris (Таблица 19).
Обобщая полученные данные, представленные в главе 3.3, можно выделить следующие основные результаты:
Базовые уровни активности пероксидазы и глутатион S-трансферазы байкальского Е. cyaneus выше, чем у голарктического G. lacustris. Базовые уровни активности пероксидазы и каталазы байкальского Е. verrucosus выше, чем у голарктического G. lacustris;
Акклимация к температурам ниже предпочитаемой приводила к изменению активности ферментов АОС у G. lacustris и Е. cyaneus, тогда как у холодолюбивого Е. verrucosus изменений не отмечали;
Акклимация к температурам выше предпочитаемых приводит к изменению активности ферментов АОС у байкальских эндемичных амфипод;
У исследованных видов амфипод имеются видоспецифичные механизмы регуляции работы АОС в условиях изменения температуры среды.
В процессе жизнедеятельности у аэробных организмов непрерывно происходит генерация эндогенных активных форм кислорода (АФК) (Di Guilio et al., 1989), что приводит к развитию окислительного стресса. АФК могут негативно влиять на макромолекулы, такие как белки, углеводы, нуклеиновые кислоты и липиды (Finkel, Holbrook, 2000; Zheng et al., 2002).
Содержание АФК на уровне, совместимом с нормальной жизнедеятельностью клетки, поддерживается многокомпонентной системой антиоксидантной защиты. АОС включает в себя комплекс из ряда ферментов, таких как каталаза, глутатион S-трансфераза, пероксидаза, супероксиддисмутаза, глутатионпероксидаза и др. (Матейкович, 2016), а также неферментные антиоксиданты, такие как жирорастворимые витамины (например, -каротин (провитамин А) и -токоферол (витамин Е)) и низкомолекулярные водорастворимые (например, глутатион и аскорбиновая кислота). Защищая клетки от окислительного стресса посредством удаления излишков АФК, АОС играет важную роль в поддержании гомеостаза организмов (Winston, 1991; Livingstone et al., 1992; Kong et al., 2008).
Согласно сравнительному анализу базовых уровней активности ферментов АОС, при предварительной акклимации к предпочитаемым температурам у голарктического G. lacustris активность ниже, чем у байкальских эндемиков. Обитание байкальских эндемичных видов при постоянных низких температурах и высоком содержании кислорода может объяснять данный факт. Так, в работе Abele, Puntarulo (2004) показано, что базовые уровни активности супероксиддисмутазы полярных моллюсков выше, чем у обитающих в умеренных широтах (Regoli et al., 1997). Повышенная генерация АФК в клетках эктотермов может происходить из-за более высокой растворимости кислорода в холодной воде и биологических жидкостях (Wells, 1986; Viarengo et al., 1995, 1998; Ansaldo et al., 2000; Camus, 2005).
Если сравнивать между собой два исследованных байкальских вида, можно отметить более высокую активность пероксидазы и глутатион S-трансферазы у термоустойчивого Е. суапеш, что может являться адаптацией к большей частоте температурных колебаний в зоне обитания данного вида (верхняя литораль). Ранее было показано, что Е. суапеш обладает повышенной емкостью систем неспецифического стресс-ответа, выражающейся в более высоком уровне белков теплового шока в клетках, по сравнению с Е. verrucosus (Bedulina et al., 2017).
Таким образом, результаты экспериментального исследования согласуются с нашей гипотезой о наличии специфических адаптации байкальских эндемиков к повышенному содержанию растворенного кислорода в воде Байкала, что может вызывать усиленное образование АФК (Axenov-Gribanov et al., 2016).
По результатам исследования показано, что длительная акклимация к повышенным и пониженным температурам (относительно предпочитаемой для каждого вида) приводит к изменению активности ферментов АОС у всех исследованных видов амфипод. Согласно результатам исследования, у байкальского Е. суапеш происходило значимое снижение активности пероксидазы и каталазы в условиях длительной акклимации при температурах ниже предпочитаемых - 6 и 1,5 С. Уменьшение активности данных двух ферментов может служить индикатором воздействия высоких уровней АФК на организм, что приводит к окислительным повреждениям основных клеточных компонентов, таких как липиды, белки и ДНК (Halliwell, 2007).
Напротив, длительная акклимация к 15 С приводила к повышению активности пероксидазы у Е. cyaneus. Повышение активности пероксидазы и каталазы направлено на предотвращение свободнорадикального окисления в условиях повышенной температуры (Lushchak, 2011), что неоднократно показано в исследованиях с байкальскими эндемичными амфиподами (Timofeyev et al., 2009; Shatilina et al., 2011).
У голарктического G. lacustris также наблюдали снижение активности пероксидазы при акклимации к 6 С и повышение активности каталазы при 1,5 С (Axenov-Gribanov et al., 2016). Снижение активности ферментов может также указывать на снижение скорости протекания реакций на фоне общего угнетения метаболизма в условиях низких температур, так как оптимальной для данных видов является температура 12 С и 15 С, соответственно. Повышение активности каталазы было показано у млекопитающих и амфибий в условиях повышенных концентраций кислорода в холодной воде (Chance et al., 1979; Barja de Quiroga et al., 1989) и показано, что каталаза выступает в данном случае как фермент, участвующий в адаптации к высоким концентрациям кислорода (Chance et al., 1979) для редукции усиления процессов перекисного окисления липидов (Barja de Quiroga et al., 1989). В работе Abele et al. (2002) также показано, что изменение температурного режима среды обитания (с 18 до 25 С) моллюсков Mya arenaria приводило к значимому повышению активности каталазы. Стоит отметить, что температура 25 С не является критической для данного вида, что может говорить о мобилизации АОС для подавления эффектов оксидативного стресса.