Влияние загрязнения антибиотиками на биологические свойства чернозема обыкновенного Акименко Юлия Викторовна

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1. Значение антибиотиков в биоценозах 10

1.1. Биологическая роль антибиотиков в биоценозах 10

1.2. Антибиотики в сельском хозяйстве и их значение

1.2.1. Применение антибиотиков в растениеводстве 15

1.2.2. Применение антибиотиков в животноводстве 20

1.3. Распространение и пути поступления антибиотиков в почву 25

1.3.1. Распространение и пути поступления антибиотиков в почву 25

1.3.2. Влияние антибиотиков на биологические свойства почв 29

Глава 2. Обьекты исследований 31

2.1. Чернозем обыкновенный южно-европейской фации 31

2.1.1. География, генезис и свойства черноземов обыкновенных 31

2.1.2. Биологическая характеристика черноземов обыкновенных 42

2.2. Характеристика используемых антибиотиков 51

Глава 3. Методика и методы исследований 56

3.1. Методика проведения лабораторных модельных исследований 56

3.2. Методика проведения полевых модельных исследований 58

3.3. Лабораторные аналитические методы исследования 60

3.4. Статистическая обработка результатов исследования 64

Глава 4. Результаты лабораторного моделирования загрязнения чернозема антибиотиками 65

4.1. Изменение реакции среды (рн) чернозема при загрязнении антибиотиками 65

4.2. Влияние антибиотков на численность и структуру микробоценоза чернозема

4.2.1. Изменение численности и динамика восстановления основных групп почвенных микроорганизмов в условиях острого загрязнения 67

4.2.2. Изменение численности и динамика восстановления основных групп почвенных микроорганизмов в условиях хронического загрязнения

4.3. Влияние антибиотков на биохимические свойства чернозема 91

4.3.1. Изменение и динамика восстановления биохимических свойств чернозема в условиях острого загрязнения 91

4.3.2. Изменение и динамика восстановления биохимических свойств чернозема в условиях хронического загрязнения 103

4.4. Изменение интегрального показателя биологического состояния чернозема при загрязнении антибиотиками 109

Глава 5. Результаты полевого моделирования загрязнения чернозема антибиотиками 112

5.1. Влияние антибиотиков на численность и структуру микробоценоза чернозема 112

5.2. Влияние антибиотиков на биохимические свойства чернозема 115

5.3. Влияние загрязнения чернозема антибиотиками на рост и развитие гороха 118

5.4. Изменение интегрального показателя биологического состояния чернозема при загрязнении антибиотиками 123

Глава 6. Сопоставление результатов лабораторного и полевого Моделирования загрязнения чернозема антибиотиками 126

Выводы 141

Список литературы

• Применение антибиотиков в животноводстве
• Биологическая характеристика черноземов обыкновенных
• Лабораторные аналитические методы исследования
• Изменение численности и динамика восстановления основных групп почвенных микроорганизмов в условиях хронического загрязнения

Введение к работе

Актуальность исследования. В отличие от пестицидов, которые уже давно используются в сельском хозяйстве, антибиотики, не вызывали интереса как потенциальные загрязнители окружающей среды. Но в связи с интенсификацией их использования во всех сферах сельского хозяйства, в настоящее время проблеме загрязнения природных экосистем антибиотиками уделяется особое внимание.

По мере углубления знаний об антибиотиках, стали накапливаться данные о неблагоприятных последствиях бесконтрольного применения этих препаратов (Тимофеев, 1989; Черкащина и др., 2011). Данные исследовательской компании Research Techart (2013) свидетельствуют о том, что в России ежегодно используется около 3,5 тыс. т антибиотиков, из них 36% в качестве противопаразитарных препаратов, 23% - для лечения и профилактики животных, 19% - как стимуляторы роста, 22% -как профилактические средства.

Центральное ведомство по охране окружающей среды Германии исследовало масштаб применения антибиотиков в странах Евросоюза (ЕС). Оказалось, что основными потребителями антибиотиков являются отрасли животноводства. Одной из первых стран, выступивших с инициативой запрета использования антибиотиков в животноводстве, была Швеция, затем Швейцария, Нидерланды и ряд других европейских стран. В России же кормовые антибиотики не запрещены. В отношении тетра-циклинов и сульфаниламидов в странах ЕС до сих пор нет никаких экологических стандартов. Множество попыток сегодня предпринимается с целью заполнить пробелы в научных знаниях о поведении и распространении антибиотиков в окружающей среде и в соответствии с этим знаниями внести изменения в законодательство (World Health Organization..., 2014).

Важным экологическим последствием безрассудного применения антибиотиков в сельском хозяйстве является увеличение их фоновых концентраций. В основном антибиотики попадают в почву благодаря применению навоза (Golet et al., 2003; Kemper, 2008) и сточных вод (Thiele-Bruhn, 2003; Renew, Huang, 2004) на сельскохозяйственных землях в качестве удобрения. С каждым годом, все чаще разные концентрации антибиотиков обнаруживаются в сточных водах, почвах, грунтовой и питьевой воде (Schwartz et al., 2003; Radjenovic' et al., 2009; Rosal et al., 2010; Yang et al., 2011; Zhou et al., 2011). Локально в почвах обнаруживаются антибиотики группы тет-рациклинов в концентрациях 1-900 мг/кг (Winckler, Grafe, 2001; Pawelzick et al., 2004), группы макролидов 1-800 мг/кг (Hamscher et al., 2002; Hoper et al., 2002).

В настоящее время работников сельскохозяйственной сферы обвиняют в том, что антибиотики из сельскохозяйственных угодий попадают в близлежащие водоемы и затем в почвы. Муниципальные системы очистки воды не в состоянии отфильтровывать антибиотики. В связи с вышесказанным важно изучить, как загрязнение антибиотиками влияет на состояние и функционирование экосистем и почвенного покрова, в частности.

Цель работы - исследовать закономерности влияния антибиотиков на биологические свойства чернозема обыкновенного в лабораторных и полевых условиях.

Задачи исследования:

1. Установить закономерности воздействия антибиотиков и их сочетаний на биологические свойства чернозема, а так же оценить степень их изменения в зависимости от природы антибиотика, его концентрации и продолжительности воздействия.

2. Ранжировать показатели биологической активности чернозема по их чувствительности к антибиотикам.

3. Изучить динамику восстановления биологических свойств чернозема после загрязнения антибиотиками.

4. Сопоставить между собой результаты лабораторных и полевых модельных исследований загрязнения чернозема антибиотиками.

Основные положения, выносимые на защиту:

5. Степень воздействия разных антибиотиков определяется их природой, концентрацией и продолжительностью воздействия. Снижение большинства биологических показателей чернозема происходит при концентрации антибиотиков 100 мг/кг почвы. По степени ингибирования биологических свойств чернозема антибиотики образуют следующий ряд: ампициллин > бензилпенициллин > стрептомицин > окситетрацик-лин > тилозин > фармазин > нистатин > тромексин > ализерил.

6. Биологические показатели в разной степени реагируют на загрязнение антибиотиками. По степени устойчивости к антибиотикам микроорганизмы чернозема образуют следующий ряд: бактерии p. Azotobacter > микромицеты > амилолитические бактерии > аммонифицирующие бактерии. По степени устойчивости ферменты образуют следующий ряд: пероксидаза > полифенолоксидаза > каталаза > дегидрогеназа > инвертаза > фосфатаза.

7. Воздействие антибиотиков на биологические свойства чернозема носит пролонгированный характер. Динамика восстановления, как численности микроорганизмов, так и ферментативной активности носит нелинейный характер.

8. Степень снижения биологических показателей при загрязнении антибиотиками более выражена в лабораторных условиях, чем в поле. Скорость восстановления биологической активности чернозема после загрязнения антибиотиками в полевых условиях выше в 2 раза.

Научная новизна. Впервые проведено комплексное исследование влияния антибиотиков на биологические свойства чернозема обыкновенного как в лабораторных, так и в полевых условиях. Впервые установлены закономерности влияния антибиотиков на биологические свойства чернозема обыкновенного. Показана степень изменения биологических свойств чернозема в зависимости от природы антибиотика, его концентрации и продолжительности воздействия. Дана оценка влияния смесей разных антибиотиков на биологические свойства чернозема. Ранжированы показатели биологической активности по их чувствительности к антибиотикам. Проведено сопоставление результатов лабораторного и полевого моделирования загрязнения чернозема антибиотиками и показана корректность переноса результатов, полученных в лаборатории, непосредственно в полевые условия.

Практическая значимость. Результаты, полученные в исследовании, могут использоваться при биомониторинге, биоиндикации и биодиагностике почв, загрязненных химическими веществами, при оценке воздействия на окружающую среду, разработке нормативов использования антибиотиков в сельском хозяйстве, а также в других природоохранных мероприятиях. Результаты, полученные в исследовании, используются в учебном процессе при преподавании таких дисциплин как: экология и природопользование, охрана окружающей среды, экологический мониторинг, почвоведение, экологическая экспертиза и других в Южном федеральном университете и могут быть использованы в учебном процессе в других ВУЗах.

Личный вклад автора. Тема, цель, задачи, объекты, методы и план исследования определены автором совместно с научным руководителем. Модельные лабораторные и полевые анализы выполнены лично автором. Анализ полученных результатов, их обобщение, а так же формулировка основных выводов и защищаемых положений сделаны лично автором при корректирующем и направляющем участии научного руководителя. По результатам исследований автором или научным коллективом с участием автора опубликован ряд научных работ объемом 42,53 п. л. с долей участия автора - 36,20 п.л.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на ряде конференций, симпозиумов, форумов, съездов, основные из которых: International Multidisciplinary Scientific GeoConference SGEM (Albena, Bulgaria, 2015), V и VI всероссийский съезд Общества почвоведов им. В.В. Докучаева (Ростов-на-Дону, 2008; Петрозаводск, 2012), IV научно-практическая конференция «Экологические проблемы. Взгляд в будущее» (Ростов-на-Дону, 2008, 2015), международная научно-практическая конференция «Экология речных бассейнов» (Владимир, 2013), II Ростовский молодёжный научно-практический форум «Молодёжная инициатива - 2011» (Ростов-на-Дону, 2011), международная конференция с элементами научной школы для молодёжи «Экокультура и фитобиотехнологии улучшения качества жизни Каспия» (2010), международная научная конференция «Современное состояние черноземов» (Ростов-на-Дону, 2013), всероссийская молодёжная научная школа «Эффективная работа над диссертацией» (Ростов-на-Дону, 2012), международная научно-практическая конференция «Экологические проблемы природных и урбанизированных территорий» (Астрахань, 2010), международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2011, 2012, 2013, 2014, 2015), научная конференция сотрудников, студентов и аспирантов кафедры экологии и природопользования Южного федерального университета «Актуальные вопросы экологии и природопользования» (Ростов-на-Дону, 2012, 2013, 2014, 2015), научно-практическая конференция, посвященная 100-летию выпуска первого мелиоратора в России (Новочеркасск, 2014), международная научная конференция «Роль Ботанических садов в сохранении и мониторинге биоразнообразия» (Ростов-на-Дону, 2015), международная научная конференция «Проблемы природоохранной организации ландшафтов» (Новочеркасск, 2015) и др.

Публикации. Основные положения диссертационной работы изложены в 85 публикациях, из них 23 статьи в изданиях из перечня ВАК (среди них 5 - в базе данных Web of Science, 7 - в базе данных Scopus), 2 монографии.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, 6 глав, выводов и списка использованной литературы. Работа изложена на 170 страницах машинописного текста, содержит 15 таблиц, 65 рисунков. Список использованной литературы включает 310 источников, в том числе 112 на иностранных языках.

Конкурсная поддержка работы. Исследование выполнено при финансовой поддержке Президента РФ (гранты НШ-2449.2014.4; НШ-5316.2010.4), Министерства образования и науки Российской Федерации (6.345.2014/К), ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы (государственные контракты П169, П1298, П322, 16.740.11.0528, 14.740.11.1029, соглашения 14.А18.21.0187, 14.А18.21.1269, 5.5160.2011), ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям научно-технологического комплекса России» на 2007-2013 годы (государственный контракт 14.515.11.0055), Программы развития Южного федерального университета (213.01-24/2013-85; 213.01-24/2013-44).

Благодарности. Автор глубоко признателен за неоценимую помощь в работе своему научному руководителю - доктору географических наук, профессору К.Ш. Казееву; за ценные рекомендации на всех этапах исследования - доктору сельскохозяйственных наук, профессору СИ. Колесникову; за помощь при подготовке диссертации - доктору биологических наук, профессору Т.В. Денисовой. За постоянную помощь и поддержку - преподавателям и сотрудникам кафедры экологии и природопользования Южного федерального университета.

Применение антибиотиков в животноводстве

Согласно ГОСТ 21507-81 (СТ СЭВ 1740-79): «Антибиотик - это вещество микробного, животного или растительного происхождения, способное подавлять рост определенных микроорганизмов или вызывать их гибель».

Антибиотики являются большой группой биологически активных веществ, которые имеют практическое значение. По объему промышленного производства и экономическим показателям антибактериальные препараты занимают первое место в объемах всей фармацевтической продукции. Антибиотики - специфические продукты жизнедеятельности организмов, обладающие высокой активностью по отношению к определенным микроорганизмам, вирусам, задерживая их рост или полностью подавляя их развитие (Хоменко, 2002).

Наука об антибиотиках и их практическое применение внесли свой определенный вклад в экологическую обстановку (Sarmah et al., 2006). Влияние антибиотиков на окружающую среду можно проследить по следующим направлениям: их практическое использование и промышленное получение. Серьезные экологические последствия возникают в процессе промышленного производства антибиотиков, связанные с защитой водоемов от сточных вод, которые образуются в большом объеме при технологическом процессе. Наиболее загрязненными сточными водами в ходе биотехнологического процесса получения антибиотиков оказываются отработанные нативные растворы, которые содержат различные высоко - и низкомолекулярные органические и синтетические неорганические соединения. Одной из важнейших задач защиты окружающей среды в процессе промышленного производства антибиотиков является сокращение выбросов вредных веществ в атмосферу. Решение ее связано, в первую очередь, с глубокой очисткой дымовых газов и исключением рассеивания конечного продукта в атмосфере (Ни et al., 2010). Широкое применение в медицинской практике, сельском хозяйстве и пищевой промышленности разнообразных по химической природе и спектру действия антибиотиков сопровождается нарушением микробного экологического равновесия в различных экосистемах. Это может привести к нарушению микробного равновесия. Такого рода нарушения могут быть связаны с тем, что антибиотики подавляют развитие лишь чувствительных к ним форм микроорганизмов; а так же с тем, что, массовое практическое использование антибиотиков приводит к распространению и возникновению в природе атипичных штаммов микроорганизмов (Watkinson et al., 2009; Ни et al., 2010; Maron et al., 2013). Все чаще в практику вводят новые антибиотические препараты для борьбы с возникающими резистентными к антибиотикам формами микроорганизмов, что, в свою очередь, приводит к появлению устойчивых форм микроорганизмов. Такое широкое практическое использование антибиотических веществ, распространение в природе ксенобиотиков и огромного числа химически синтезированных веществ, применяемых в сельском хозяйстве, вызывает значительные изменения экологического фона уже известных антибиотиков.

О биологической роли и значении антибиотиков в природе не существует единой точки зрения (Aminov, 2009). Это свидетельствует о том, что данный вопрос представляет собой не простое явление. В настоящее время существует две противоположные точки зрения о биологической роли антибиотических веществ в природе.

Первая точка зрения, рассматривает образование антибиотиков как специфическую особенность обмена веществ организмов, которая возникает и закрепляется у них в процессе эволюции. Образование и выделение в окружающую среду антибиотиков в процессе жизнедеятельности живых организмов является важнейшим фактором в борьбе за существование. Такую точку зрения поддерживают ведущие российские и зарубежные специалисты, такие как Н.А. Красильников (1961), Г.Ф. Гаузе (1953) и многие другие ученые. Синтез антибиотиков, является наследственной особенностью организмов, которая проявляется в том, что каждый штамм микроорганизмов образует один или несколько определенных для него антибиотиков. Однако, так же известно, что одни и те же антибиотики могут образовываться разными видами микроорганизмов. Этот факт не противоречит мысли о закрепленной наследственно способности микроорганизмов продуцировать определенные виды антибиотиков (Звягинцев, 1996).

Выявление возможности образовывать антибиотики в процессе жизнедеятельности связано, прежде всего, с условиями культивации микроорганизмов. При одних условиях культивирования организм будет образовывать антибиотик, при других тот же организм, несмотря на внешние условия, не будет обладать способностью к образованию данный антибиотика. Такие явления зачастую наблюдаются в лабораторных условиях при культивировании изучаемого микроорганизма, в условиях широкого выбора источников питания (Покровский, 1990).

Вторая точка зрения исходит из того, что антибиотики, образуемые разными видами микроорганизмов, носят случайный характер, который зависит только от условий среды. По мнению Ваксмана (1964), образование антибиотиков не является закрепленным свойством организма, которое проявляется только при его развитии в специфической среде и при особых условиях внешней среды. Именно поэтому образование антибиотиков не связано с эволюцией микроорганизмов, и они не имеют для микроорганизмов приспособительного значения.

Как пишет Ваксман (1964), антибиотики являются "лабораторными продуктами, образуемыми растущими чистыми культурами микроорганизмов в условиях богатой питательными веществами среды при хорошей аэрации, но они не обнаруживаются в почве".

Биологическая характеристика черноземов обыкновенных

Микроорганизмы обнаруживаются в окружающей природной среде практически повсеместно. Даже в экстремальных условиях высотных слоев тропосферы, на многокилометровых глубинах океанов, в ледниках земных полюсов и высокогорий, песках пустынь и кипящих термальных источниках микроорганизмы насчитываются в значительных количествах. Однако больше всего их обитает в верхнем слое почвы, в 1 г которой может содержаться до нескольких миллиардов микробов (Громыко, 1974; Аристовская, 1988; Бабьева, Зенова, 1989; Умаров, 1998).

Микробному сообществу принадлежит значительная роль в формировании «здоровья почвы», именно оно выполняет основную работу по поддержанию процессов, происходящих в биосфере (Виноградский, 1952; Красиль-ников, 1958; Звягинцев, Голимбет, 1983; Звягинцев, 1987; Заварзин, 2003; Кожевин, 2006). Микробоценоз является основным компонентом почвенной биоты и выполняют многообразные функции в круговороте веществ, в т.ч. самоочищение от различных ксенобиотиков и поллютантов. Микробное сообщество является важнейшим объектом агроэкологического мониторинга, а так же объективным экологическим индикатором состояния почвенного биоценоза, и в том числе отклика на его загрязнение разными поллютантами (Мишустин, 1984, 19846; Умаров, 1986; Гузев, Левин, 1991; Круглов, 1991; Марфенина, 1994; Добровольская, 2002; Терехова, 2007). Устойчивость к антибиотикам возникает в ответ не только на антибиотический пресс, но и в результате других воздействий, включая загрязнение окружающей среды тяжелыми металлами. Возможно, что рост антибиотикоустойчивости в ответ на антропогенные нарушения представляет собой реакцию микробных сообществ с признаками целеполагания для возврата к необходимому режиму функционирования экосистемы. В этом смысле быстрое увеличение и широкое распространение резистентности к антибиотикам является индикатором неблагополучия микробных сообществ. Данные по географическому расселению разных групп микроорганизмов в основных почвах СНГ отражены в отечественной литературе (Мишу-стин, 1956, 1984; Мишустин и др., 1966; Звягинцев и др., 1996). Показано, что разных природно-климатических зонах находятся разные сообщества микроорганизмов. Каждой природной зоне свойственны не только определенные группы высших растений, но и определенные сочетания микробных сообществ и высших растений. Е.Н. Мишустин (1966) установил, что содержание бактерий, особенно спороносных форм, с севера на юг бывшего СССР увеличивается. Содержание грибов возрастает в зональных типах почв с юга на север, а содержание актиномицетов меняется в противоположном направлении.

В составе почвенной микрофлоры принято выделять основные физиологические группы микроорганизмов, участвующих в разных процессах и на разных этапах разложения органических соединений (Германов, 1967; Добровольская, 2002).

Аммонифицирующие бактерии являются гнилостными микроорганизмами, вызывающими гниение остатков растений, трупов животных и разложение мочевины. В почве, в процессах гниения принимают участие такие аэробные бактерии как: бактерии p. Proteus, Bacillus Subtilis, Bacillus Mesentericus, грибы p. Mucor, Aspergillus и др. (Германов, 1967; Добровольская, 2002).

Бактерии нитрификаторы исключительно специфичны и обладают авто-трофными свойствами. Благодаря их деятельности азотистая кислота окисляется до азотной и преобразуется в нитраты.

Азотфиксирующие бактерии обладают способностью усваивать атмосферный азот из воздуха и в процессе своей жизнедеятельности образовывать из молекулярного азота органические соединения, которые могут усваиваться растениями.

В почвенной среде находятся так же бактерии, расщепляющие клетчатку, вызывающие различные виды брожений. Такие процессы, наблюдаются при разложении микроорганизмами органических соединений углерода (мо-лочно-кислое, спиртовое, масляно-кислое, уксусное, пропионовое). Так же в почве присутствуют бактерии, участвующие в круговороте основных элементов, таких как сера, железо, фосфор и других элементов. Процессы окисления и восстановления этих соединений в природе осуществляют серобактерии, железобактерии, разнообразные виды других бактерий.

Грибы представляют собой чрезвычайно обширную группу. Почвенные грибы имеют вегетативное тело в виде мицелия. Делятся на две большие группы - низших и высших. Многие почвенные грибы относятся к сапрото-фам и усваивают различные органические вещества. Большинство грибов усваивают сахара, меньше - крахмал, жиры, клетчатку, лигнин, воск, парафин и т.д. (Бабьева, Зенова, 1989).

Почвенные водоросли также являются специфичным и неотъемлемым компонентом почв. Почвенные водоросли являются пионерами, заселяющими горные породы, различные обнажения, отвалы горных пород и т.д. и образуют самостоятельные сообщества - альгоценозы. По данным Э.А. Штины (1976) в почвах России всего найдено около 1195 видов водорослей, в том числе более чем один раз - 730 видов. По отделам они распределены так: зеленых 528 (310), сине-зеленых 295 (191), желто-зеленых 172 (130), диатомовых 183 (95), других отделов 18 (3). Флора почвенных водорослей специфична и отличается от водной флоры. При сельскохозяйственном освоении и загрязнении почв состав водорослей изменяется и становится более однообразным в разных по генезису почвах.

Приводимые в литературе сведения о численности бактерий, актиноми-цетов и грибов в почвах в большинстве случаев получены при посевах на агаризованные среды. Согласно этим данным число бактерий в одном грамме колеблется в пределах от нескольких десятков и сотен тысяч до многих миллионов, в зависимости от состава почвы и питательности среды (Gray, Thornton, 1928; Clark, 1940; Мишустин, 1956). Черноземы характеризуются высокой численностью, разнообразием микроорганизмов и их высокой активностью (Мишустин и др. 1966; Громыко и др., 1974). Показано, что с уменьшением содержания органического вещества с глубиной, общая численность микроорганизмов убывает. Но не всегда наблюдается прямая корреляция между содержанием гумуса и общей численностью микроорганизмов (Мишустин и др., 1966; Громыко, 1974; Ка-зеев и др., 2004).

Лабораторные аналитические методы исследования

Методом люминесцентной микроскопии установили снижение общей численности бактерий при загрязнении чернозема антибиотиками (табл. 7). Между концентрацией антибиотиков и численностью бактерий установлена тесная корреляция (г= -0,85). Наибольшее снижение обшей численности бактерий происходит в первые 10 суток от момента загрязнения. На дальнейших сроках наблюдается тенденция восстановления. Но, несмотря на наблюдаемую тенденцию, и на 120 сутки после загрязнения снижение численности бактерий составляет 23% от контроля (концентрация 1000 мг/кг (р 0,01). При загрязнении чернозема тилозином в концентрации 10 мг/кг статистически достоверного изменения в численности бактерий не установлено.

Результаты лабораторного моделирования хронического загрязнения антибиотиками на численность основных групп микроорганизмов представлены на рисунках 28-33.

Аммонифицирующие бактерии, так же как и в рамках лабораторного острого опыта, оказались наиболее чувствительными к вносимым антибиотиками, нежели амилолитики и микромицеты. Динамика численности аммо-нификаторов при хроническом воздействии антибиотиков представлена на рисунке 28.

При моделировании хронического воздействия с постепенным увеличением концентрации (от 1 до 1000 мг/кг) установили, что на первых сроках (1 сут. после внесения) концентрация 1 мг/кг не приводит к статистически достоверному изменению численности данной группы бактерий. На 50 сут., когда концентрация вносимых антибиотиков уже составляла 500 мг/кг, численность аммонификаторов достоверно отличалась от контроля (снижение на 26% - тилозин, 30%-смесь тилозин+нистатин, соответственно). Нистатин не оказывает подавляющего воздействия на численность аммонификаторов, что связано с его природой и химическим строением, его действие направлено на ингибирование микроскопических грибов. В дальнейшем, несмотря на последующее увеличение концентрации, достоверной разницы в численности бактерий на 50 сут. и 100 сут. не установлено, даже наблюдается незначительное увеличение численности бактерий. Полученные результаты, свидетельствуют о том, что бактерии способны приспосабливаться и приобретать устойчивость к вносимым антибиотикам и дальнейшее увеличение концентрации не будет отражаться на численности бактерий. Показано, что внесение в почву сульфахлоропиридазина, на первых сроках исследования, приводит к ингибированию численности микроорганизмов, последующее же увеличение концентрации антибиотика вызывает развитие устойчивости у микроорганизмов (Schmitt et al., 2004). Однако даже на 100 сутки численность бактерий значительно снижена (24% - тилозин, 19%-смесь антибиотиков).

Другими модельными исследованиями было показано, что почвенные микроорганизмы проявляют способность к восстановлению исходных характеристик после прекращения селективного действия антибиотика (Rysz, Alvarez, 2004). В частности, при имитации загрязнения почв сточными водами с антибиотиком в почвенной колонке (концентрация тетрациклина 50 мг/л, 300 сут.) отмечено значительное уменьшение общего количества аборигенных гетеротрофов и резкое увеличение почвенных бактерий, устойчивых к тетрациклину. После прекращения его подачи выявлена тенденция восстановления исходных характеристик микроорганизмов: уже через месяц доля устойчивых к тетрациклину бактерий снижается с 25 до 1%. С постепенным увеличением концентрации от 1 до 1000 мг/кг

Динамика численности амилолитических бактерий в условиях хронического загрязнения антибиотиками, % от контроля

При исследовании хронического воздействия на численность амилолитических бактерий установлены те же тенденции, что и с аммонифицирующими бактериями. Однако амилолитики проявляют большую устойчивость по отношению к антибиотикам, нежели аммонификаторы.

Изменение численности микромицетов чернозема обыкновенного при хроническом воздействии антибиотиков показано на рисунке 30. Антибактериальный антибиотик - тилозин, не вызвал статистически достоверных изменений численности микромицетов, в отличие от его комплексов с нистатином. При моделировании хронического воздействия с постепенным увеличением концентрации (от Ідо 1000 мг/кг) установили, что на первых сроках (1 сут. после внесения) концентрация 1 мг/кг не приводит к статистически достоверному изменению численности микромицетов. На 50 сут., когда концентрация вносимых антибиотиков уже составляла 500 мг/кг, численность микромицетов достоверно отличалась от контроля (снижение на 24% -нистатин, 26%-смесь тилозин+нистатин, соответственно). В дальнейшем, несмотря на последующее увеличение концентрации, достоверной разницы в численности микромицетов на 50 и 100 сутки не установлено, даже наблюдается незначительное увеличение их численности.

При моделировании хронического воздействия с постепенным уменьшением концентрации (от 1000 до 1 мг/кг) установили, что на первые сут. после внесения антибиотиков в концентрации 1000 мг/кг происходит значительное снижение численности микромицетов, за исключением тило-зина (на 73%-нистатин, на 63%-смесь антибиотиков). При дальнейшем уменьшении концентрации происходит восстановление микромицетов, на 100 сут. исследования разница по сравнению с контролем составляет по 18% для нистатина и его смеси тилозином.

Изменение численности и динамика восстановления основных групп почвенных микроорганизмов в условиях хронического загрязнения

Внесение антибиотиков в почву в полевых условиях приводило к изменению численности основных групп почвенных микроорганизмов, наблюдалась тенденция снижения их численности на всех сроках экспозиции. Исследованные группы микроорганизмов отличались по их устойчивости к вносимым антибиотикам. Результаты представлены на рисунках 49-51.

Наибольшее подавляющее воздействие на численность аммонифицирующих бактерий (на 20-60% от контроля, р 0,05, п=6) оказал окситетра-циклин на всех исследуемых сроках исследования. Статистически достоверных различий в численности аммонифицирующих бактерий на 3 и 30 сут. опыта не выявлено. Восстановление численности данной группы бактерий не наблюдается и на 60 сут. опыта.

Пролонгированный характер воздействия антибиотиков на почвенные микроорганизмы свидетельствует об их относительной устойчивости в почве. J.J. Stone et al. (2010) обнаруживали активные метаболиты тилозина на 150 сутки после его внесения в почву. M.L. Loke et al. (2002) показали, что при рН ниже 7,4 образуются сильные ионные связи между протонированным тилозином и анионными компонентами почвы, что свидетельствует о высокой сорбции тилозина в почве. Установлена положительная корреляция сорбции тилозина и окситетрациклина с содержанием гумуса, рН и емкостью катионного обмена почв (Oliveira et al., 2002). Высокая способность к сорбции тилозина наблюдается в почвах, богатых гумусом, нежели песчаных почвах (Rabolle et al., 2000; Ingerslev et al., 2001).

Амилолитические бактерии оказались более устойчивы к исследуемым антибиотикам, нежели бактерии - аммонификаторы. На 3 сут. исследования наблюдали максимальное снижение численности бактерий (60 % от контроля, р 0,001). Аналогично с аммонификаторами, наибольшее ингибирующее воздействие оказал окситетрациклин. На дальнейших сроках экспозиции не выявлено достоверных изменений численности амилолитических бактерий, наблюдается тенденция восстановления численности до контрольных значений.

В рамках полевого моделирования антибиотики практически не оказали влияния на численность микромицетов чернозема обыкновенного. Что связано с природой используемых антибиотиков, тилозин и окситетрациклин эффективны только в отношении бактерий. На 30 и 60 сут. опыта не выявлено изменений в численности микромицетов.

Изменение в обилии бактерий p. Azotobacter наблюдалось только на 3 сут. исследования (снижение на 30-40% от контроля при воздействии тило-зина, и на 50-60%, при воздействии окситетрациклина, соответственно), на остальных сроках не наблюдали достоверных изменений в обилии бактерий. При этом азотфиксирующие бактерии были чувствительнее к загрязнению другими видами загрязнителей (тяжелыми металлами, нефтью, ионизирующему излучению), чем другие группы бактерий (Мазанко и др., 2013; Колесников и др., 2006).

Таким образом, по степени устойчивости к антибиотикам, исследованные микроорганизмы образовали ряд: микромицеты бактерии p. Azotobacter бактерии-амилолитики бактерии-аммонификаторы. Восстановление микробиологических показателей носит нелинейный характер. По скорости восстановления микроорганизмы чернозема обыкновенного образовали ряд: бактерии p. Azotobacter микромицеты бактерии-амилолитики бактерии-аммонификаторы.

Изучено влияние антибиотиков на активность ферментов класса оксидо-редуктаз (каталаза, дегидрогеназа, пероксидаза и полифенолоксидаза) и гид-ролаз (фосфатаза, инвертаза). Результаты исследования по влиянию антибиотиков на ферментативную активность чернозема в полевых условиях представлены в таблицах 13, 14 и рисунке 52.

Внесение антибиотиков (тилозина, окситетрациклина) в почву, в концентрации 500 мг/кг приводит к изменению ферментативной активности.

Антибиотики привели к наибольшему ингибированию активности ферментов класса гидролаз. Активность каталазы изменяется в наименьшей степени по сравнению с дегидрогеназой. Максимальное снижение активности каталазы установлено на 3 сут. исследования (на 18% от контроля). В дальнейшем наблюдается тенденция к восстановлению активности фермента. Аналогично, многими исследованиями показано незначительное изменение активности данного фермента при загрязнении антибиотиками (Burrows, Edwards 2004; Sousa et al., 2004). В большей степени на активность каталазы повлиял ветеринарный антибиотик тилозин.

Что касается активности дегидрогеназы, то более сильное снижение активности фермента наблюдается на 3 сут. исследования (на 25% от контроля). На остальных сроках, активность фермента незначительно повышается, но так и не восстанавливается полностью и на 60-е сут. исследования. В исследованиях B.L. Guo et al. (2009) так же установлено, что внесение в почву антибиотиков из класса сульфонамидов приводит к значительному снижению активности дегидрогеназы.

В рамках полевого моделирования установили, что внесение в почву антибиотиков не приводит к ингибированию активности пероксидазы и поли-фенолокидазы, а наоборот наблюдается тенденция увеличения активности Динамика изменения ферментативной активности чернозема после загрязнения антибиотиками в полевых условиях (500 мг/кг) данных ферментов на всех сроках исследования. Установлена отрицательная корреляция между этими ферментами с численностью аммонифицирующих бактерий (г= -0,82) и положительная корреляция с микромицетами (г=0,75). Ферменты класса гидролаз (фосфатаза, инвертаза) в рамках полевого моделирования оказались менее устойчивы к внесению антибиотиков. Наибольшее снижение активности данных ферментов наблюдали на 3 сутки исследования, на дальнейших сроках активность данных ферментов увеличивается. Корреляционный анализ полученных данных выявил положительную корреляцию дегидрогеназы и инвертазы с численностью микромицетов (г=0,67, г=0,64, соответственно), каталазы с аммонифицирующими бактериями (г=0,63) и обратную корреляцию фосфатазы с амилолитическими бактериями (г= -0,70).