Внеклеточная низкомолекулярная ДНК крови животных как прогностический признак облучения Васильева, Ирина Николаевна

Введение к работе

Актуальность теми исследования. О позиций экологии ионизирующие излучения наряду с температурными' и климатическими воздействиями относят к абиотическим факторам окружающей среди. Каждая местность имеет свой естественный радиоактивный фон, к которому приспособлены остальные компоненти экосистемы. Однако с развитием научно-технического прогресса воздействие радиации приобрело антропогенный характер. Поскольку оно значительно отличается по величине, интенсивности и продолжительности от су-ществуюзціх в природе уровней, к которым адаптированы биологические системы, то в этом случае может возникнуть серьезная опасность для всего живого.

По сравнению с другими абиотическими антропогенными факторами ионкзируюгаде излучения представляет особую опасность еще и по той причине, что у человека нет соответствующих анализаторов, способных их воспринимать, Поэтому для оценки степени воздействия ионизирующих излучений необходимы чувствительные и надежные биодозиметрические критерии. К показателям, с помощью которых пытаются оценить эффект воздействия ионизирующей радиации на организм, относят прежде всего увеличение числа хромосомных аберраций в радиочувствительных клетках, а также степень лимфопении ( Т.К.Джаракьян, А.И.Воробьев, , Е.В.Гембицкий, В.Г. Владимиров и др.). Оба эти показателя, к сожалению, не отвечают современным требованиям, и в настоящее время предпринимаются попытки поиска новых критериев, которые были бы достаточно информативными уже в ранние сроки после облучения и в то же время приемлемыми для практической медицины.

В последние годы появились сообщения, что при ряде экстремальных воздействий в плазме крови и некоторых других биологических жидкостях человека и животных появляется низкомолекулярная ДНК (А.С.Еелохвостов и др., 1987, Belokhvostov, Zelenkova, 1978, Leon et.al., 1981, Ruroore et.al., 1992). Она обнаружена в бесклеточной части крови больных системной красной волчанкой (Rumore et.al., 1992) и при различных видах раковых заболеваний (Leon et.al., 1981). У животных низкомолекулярная ДНК определяется при экспериментальных опухолях (Belokhvostov, Zelenkova, 1978, Белохвостов А.С, ' 1S84) и после облучения (Vladimlrov ot.al., 1992). Причина появления такой ДШ, как впрочем и ич-

- 4 -точних ее происхождения, в настоящее время неясны. В опитах її vitro показано, что низкомолекулярная ДНК выделяется в среду при культивировании лимфоцитов (Федоров Н.А.,1933, Anker, 1975, Rogers, 1972). Но мнению некоторых авторов (Белохвоетов А.С, Войтенков Б.О., 1983, Васкиии В.И., 1991, taker et.al., 1980) она может нести информацию для других клеток. При лучевой патологии представляется весьма актуальной возможность использования появления ниакомолекулярной ДНК в плазме крови в качестве биоиндикатора и даже в качестве биодозиметрического критерия. С этой точки зрения настоящее исследование представляет интерес не только с позиций молекулярной биологии, но и с точки зрения радиационной экологии.

Изучение первичной структуры ДНК человека и млекопитающих в настоящее время является ключевой проблемой молекулярной биологии. Расшифровка последовательностей нуклеотидов внеклеточной ДНК важна для решения вопросов об источнике и механизмах ее происхождения.

Цель и г.адачи исследования. Целью настоящей работы являлось изучение фракции низкомолекулярной ДНК в плазме крови, появляющейся после облучения животных, исследование ее содержания и структуры, а также возмолшости использования этого феномена в качестве показателя оценки степени тяжести лучевого поражения. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие конкретные задачи:

1. Исследовать содержание низкомолекулярной фракции ДНК в плазме крови у крыс после облучения их ионизирующим излучением в различных дозах (в диапазоне от 8 до 100 Гр).

2. Изучить структуру внеклеточной низкомолекулярной ДНК, для чего важно било

определить последовательность нуклеотидов, используя для этой цели мотоди клонирования и секвэнирования;

проанализировать нуклеотидный состаЕ, распределение динуклео-тидов, выявить начичие сайтов известных рестриктаз в исследуемой фракции ДНК;

сравнить последовательности нуклеотидов в исследуемой ДНК с известными последовательностями ДНК, представленными в международных банках данных.

Р.. Сопоставит! структуру низкомолекулярной ДНК, выделенной после облучения животных в дозах 9 и 100 1р,

Данное исследование выполнено согласно теме N 4921 "Создание ДНК-зондов для ранней диагностики степени тяжести радиационных поражений.

Научнат новизна работы. Новыми являются дашше по изучению закономерности изменения содержания низкомолекудярной фракции ДНК в плазме крови животных после их облучения в диапазоне доз 8-100 Гр. Установлено, что содержание ДНК изменяется прямопро-порционально в зависимости от дозы облучения в диапазоне доз воздействия от 8 до 20 Гр, а далее (до доги 100 Гр) эта зависимость имеет логарифмический характер. Впервые обнаружено, что эта ДНК состоит из двунитевых молекул линейной формы длиной около 170 пар нуклеотидов с однонитевыми концевыми участками при отсутствии на них 5'фосфата. Разработан метод клонирования таких молекул, включающий обработку их кленовским ферментом и полинуклеотидкиназой. С использованием современных компьютерных программ установлено, что по своему нуклеотидному составу, распределению динуклеотидов, наличию сайтов рестриктаз Alul и EcoRI'I низкомолекулярная ДНК плазмы крови практически не отличается от ДНК генома. Новыми являются данные, согласно которым содержание В/С-пар в низкомолекулярной ДНК выре, чем среднее их содержание в ДНК генома. В составе 18 секвенированных последовательностей обнаружены сигнальные участки Са,М?-зависимой эн-донуклеааы, расщепляющей хроматин до нуклеосом. Впервые применен анализ первичной структуры внеклеточной ДНК с использованием базы данных международного компьютерного байка EMBL. Обнаружено, что низкомолекулярная ДНК содержит фрагменты LINE-элемен-тов, которые располагаются в середине, в районе З'конца и около 5'конца элемента.

Практическая значимость. Исследование дозовой зависимости содержания низкомолекулярной ДНК плавмы крови облученных крыс свидетельствует о принципиальной возможности использовать этот показатель в гачестве диагностического теста в биодозиметрических целях. Обнаружение фрагментов LINE-элементов в составе низкомолекулярной фракции внеклеточной ДНК крови, в особенности фрагмента, принадлежащего к б'кониевому району LINE, может быть использовано для разработки биоиндикаторного теста, обеспечивающего быстрое определение факта облучения.

Основные положения; выносимые на защиту: 1. Появление низкомолекулярной ДНК в плазме крови мсяег быть

- б -

использовано в качестве критерия оценки степени тяжести лучевого воздействия на организм.

2. Низкрмолекуляркая фракция ДНК, появляющаяся в плазме крови после облучения, имеет геномное происхождение.

3. Низкомолекулярной ДНК, выделенная из плазмы после облучения б дозах 8 и 100 Гр, принципиально не различается по структуре и происходит из высокомолекулярного предшественника.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы изложены и обсуждены на конференции "Современные достижения медицинской радиологии" (Санкт-Петербург, 1933), на 1 Всесоюзном радиобиологическом съезде (москва, 1989), II Радиобиологическом съезде (Киев, 1993). на XI симпозиуме "Структура и функции клеточного ядра"(Санкт-Петербург, 1993) и на юбилейной конференции, посвященной 25-летлю со дня основании НИИ военной медицины (Санкт-Петербург, 1994).

Публикации. Материалы диссертации опубликованы в 4 статьях и 6 тезисах докладов.

О&ъем и структура. Работа изложена на 146 страницах машинописного текста, состоит из введения, 4 глав, выводов, списка литературы и приложения, содержащего 44 схемы. Диссертация иллюстрирована 11 рисунками, 10 таблицами и 2 схемами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Опыты поставлены на белых крысах-самцах массой 180-250 г.Животных подвергали воздействию г-квантами ¹³⁷Cs на аппарате ИГУР в дозах 9, 20, 50 и 100 Гр (при мощности дозы 1,6 Гр/мин). Через 5 ч после облучения животных забивали декапитацией. Кровь собирали в полиэтиленовые чашечки, куда предварительно добавляли 76 мкл О,Б М ЭДТА (рН V.3) в соотношении 70:1. Для анализа брали кровь от 6 животных. Клеточные элементы крови тщательно удаляли последовательным центрифугированием при 900 є, а затем при 2200 g. Нуклеиновые кислоты из плазмы выделяли фенольным методом (Рязанцева И.П., 1S69). Для этого к полученной плазме крови немедленно добавляли ингибиторы нуклеаз, детергенты и фенол (из расчета на !0 мл плазмы 10 мкл О,IX поливинилсульфата калия, 10 мм ЗІ суспензии бентонита, 1 мл 10Z раствора додецилсульфата натрия и 330 мкл 3 М Na-ацетатного буфера рН 5,75), после перемешивания к смеси прнликиш 10 мл водоиасыщениого фонола. Полу-чоннуга смесь покачивали п течение Ю мин на ротационной качалке

в "мягком" режиме, избегая деградации молекул ДНК. После добавления 1 мл хлороформа эту процедуру повторяли. Далее пробы центрифугировали в течение 15 мин при 12000 g и 4С. К полученной водной фазе приливали половинный объем 80% фенола, взбалтывали и вновь покачивали 10 мин при комнатной температуре, после чего на холоду подвергали центрифугированию в течение 10 мин при 1Р000 g. Депротеинизацию водной фазы с фенолом повторяли триады, а затем из водной фазы с помощью этанола, охлажденного до -20С, осаждали нуклеиновые югслоты. Пробы выдерживали 12 ч при -20^оС и вновь центрифугировали при 12000 g. Полученной осадок подсушивали в вакууме и растворяли в 10-20 мкл буфера (10 мМ трис-НС1 рН 8,0 1 Мм ЭДТА). Полученный препарат подвергали электрофорезу е градиенте (2/16%) полиакриламида в 0,04 М трис-ацетатном с добавлением 0,01 Н ЭДТА буфере (рН 7,7). Из соответствующего участка геля элюировали низкомолекулярную фракцию ДНК с помощью 1 М раствора ацетата аммония (рН 8,0) (Maniatls et.al., 1982). Полученную ДНК очищали и клонировали В клетках E.coll (штаммы TG1 и XL1), используя плззмиду BLUESCRIPT М13+ (фирмы Stratagene, США). Для создания ДНК линейной формы с двухцепо-чечными (тупыми) концами ее обрабатывали рестриктазой Smal. Чтобы избежать самолигирования .в последующих процедурах, 5'-концы ДИК плазмиды обрабатывали бактериальной щелочной фос-фатазой (из расчета 0,5 ед. на 10 мкг) (Maniatls et.al., 1982). Поскольку концевые участки отдельных молекул клонируемой ДНК могли оказаться одиоцепочечными, с помощью кленовского фрагмента ДНК-полкмеразы осуществляли достраивание второй цепи. Поврежденные 5'-концы ДНК обрабатывали полинуклеотидкиназой (из расчета 50 ед. активности на 100 яг ДНК).

Клонируемую низкомолекулярную ДНК дотировали с векторной (плазмидной) ДНК. Полученную рекомбинанткую ДНК использовали для трансформации компетентных клеток E.coll. Выделение реком-бинантных плазмид и секвеиирование по Сенгеру проводили стандартами приемами (Sanger et.al. 1977, Chen, Seeburg, 1985).

Компьютерный анализ результатов секвенирования и сопоставление с известными последовательностями.ДНК выполняли по программам DNAStS, DNASTAR и PCGENE с привлечением банка EMBL (ФЙ\ версия 26).

Все эксперименты и исследования выполнены автором самосто-ятельно.

- є -