Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Нарушение доиммунных механизмов защиты иммунного статуса при воздействии фосфорорганических соединений (обзор литературы) 12
1.1. Общая характеристика фосфорорганических соединений 12
1.2. Токсикологические свойства диметилдихлорвинилфосфата 15
1.3. Нарушение доиммунных механизмов защиты и иммунного статуса при воздействии фосфорорганических соединений 17
Глава 2. Материал и методы исследований 30
Глава 3. Воздействие ДДВФ на интегральное состояние неспецифической и иммунологической резистентности организма и факторы доиммунной защиты 45
3.1. Изменение антиинфекционной неспецифической и иммунологической резистентности организма при экспериментальном перитоните 45
3.2. Изменение неспецифической и иммунологической резистентности организма при экспериментальной пневмонии 46
3.3. Влияние острого и хронического отравления ДЦВФ на обсеменен-ность селезенки и циркулирующей крови Е. Coli 47
3.4. Сывороточная активность лизоцима при действии ДЦВФ 48
3.5. Сывороточная активность тромбоцитарного катионного белка при действии ДДВФ 49
3.6. Фагоцитарно-метаболическая активность нейтрофилов при интоксикацииДЦВФ 51
Глава 4. Влияние ДЦВФ на перераспределение лимфоцитов между органами системы иммунитета 56
4.1. Изменение лимфоидных индексов тимуса и селезенки 56
4.2. Перераспределение лимфоцитов между органами системы иммунитета и циркулирующей кровью 58
Глава 5. Действие ДЦВФ на гуморальные иммунные реакции 63
5.1. Влияние ДДВФ на тимусзависимый гуморальный иммунный ответ 63
5.2. Действие ДДВФ на Т-независимый гуморальный иммунный ответ 67
Глава 6. Воздействие ДДВФ на клеточные иммунные реакции 72
6.1. Оценка функции Т-лимфоцитов 72
6.2. Изменение функции ТЫ-лимфоцитов 73
6.3. Изучение антителозависимой клеточной цитотоксичности 75
6.4. Влияние ДДВФ на функцию естественных клеток-киллеров 77
Глава 7. Механизмы нарушения иммунного статуса при действии ДЦВФ 82
7.1. Изменение миграции колониеобразующих единиц в селезенку 82
7.2. Влияние ДДВФ на кооперацию Т- и В-клеток 84
7.3. Изменение активности эстераз Т-клеток, моноцитов и макрофагов под влиянием ДДВФ 85
7.4. Роль кортикостероидов в супрессии иммунного ответа при действии ДЦВФ 87
7.5. Действие ДДВФ на показатели перекисного окисления липидов 89
7.6. Роль супрессии функции ТЫ- ТЬ2-лимфоцитов в редукции иммунных реакций ДЦВФ 91
Заключение 95
Выводы 110
Практические рекомевдации 112
Литература 113
- Общая характеристика фосфорорганических соединений
- Материал и методы исследований
- Изменение антиинфекционной неспецифической и иммунологической резистентности организма при экспериментальном перитоните
Введение к работе
1998, 2002; Петров и др., 2004). Изложенное позволяет считать, что отравления ФОС являются серьезной социальной и эколого-токсикологической проблемой. Несомненно, одной из актуальных задач экологии в настоящее время является оценка нарушений показателей системы иммунитета после острого и хронического действия ФОС (Забродский и др., 2001, 2005; Luster et al., 1987; Sullivan, 1989). Учитывая достаточно широкое распространение и использование ФОС, в частности ДДВФ в сельском хозяйстве и быту, возможность аварий при уничтожении токсичных химикатов, относящихся к фосфорорганическим антихолинэстеразным соединениям, высокую смертность при отравлении ими, недостаточно изученные особенности их острого и хронического действия на систему иммунитета представляется актуальным провести комплексное исследование изменения состояния иммунной системы животных под влиянием ФОС на примере ДЦВФ.
Цель исследования: изучение нарушения доиммунных механизмов защиты и иммунного статуса при остром, подостром и хроническом воздействии
ДДВФ.
Задачи исследования.
Определить действие ДДВФ на интегральное состояние иммунологической резистентности организма и основные показатели доиммунных механизмов его защиты;
Изучить влияние ДДВФ на состав лимфоцитов тимуса и селезенки, процессы их пролиферации и миграции в органы иммунной системы, перераспределение этих клеток между органами системы иммунитета;
Исследовать изменения Т-зависимого и Т-независисмого иммунного ответа на фоне действия ДЦВФ;
Оценить нарушения клеточных иммунных реакций, обусловленных функцией Thl-лимфоцитов, после действия ДЦВФ;
5. Определить действие ДДВФ на механизмы формирования постинтоксикационного иммунодефититного состояния: поражение ТЫ- и Тп2-лимфоцитов, миграцию колониеобразующих единиц из костного мозга в селезенку, активность эстераз в Т-клетках, моноцитах и макрофагах, функцию коры надпочечников, перекисное окисление липидов.
Научная новизна. Впервые показано на примере ДДВФ, что ФОС при остром и хроническом воздействии приводят к снижению интегрального состояния антиинфекционной неспецифической и иммунологической резистентности организма. Установлено увеличение летальности от экспериментальной инфекции, вызванной Escherichia coli и Proteus vulgaris. Экспериментально показано, что под влиянием острого и хронического действия ДДВФ происходит дозозависи-
*
мое снижение показателей доиммунной биологической резистентности организма к инфекции. Острое воздействие токсиканта снижает лимфоидный индекс тимуса и селезенки, содержание лимфоцитов в них, изменяет миграцию имму-ноцитов из органов системы иммунитета.
Установлено дозозависимое снижение Т-зависимого антителообразования при острой интоксикации ДДВФ, преимущественно в продуктивную фазу анти-телогенеза. При хроническом воздействии ДДВФ (0.01 LD50 в течение 30 сут) отмечалось сопоставимое изменение показателей, как и при остром их действии в дозе 0.75 LD50. Выявлено, что под влиянием острой интоксикации ДДВФ происходит дозозависимое снижение синтеза IgM, IgG и функции ТЫ- и Th2-лимфоцитов. Впервые показано, что хроническое отравление ДДВФ вызывает супрессию синтеза IgM и IgG сответственно в 1.6 и 1.4 раза. Действие ДДВФ in vitro вызывает прямо связанное с концентрацией (106,105иЮ4М) снижение кооперации Т- и В-лимфоцитов, вследствие преимущественного нарушения функции Т-клеток. Доказано, что супрессия иммунных реакций при действии токсиканта может быть связана с увеличением функции коры надпочечников и повышением в крови концентрации кортикостерона, а также ингибированием эстераз Т-лимфоцитов, моноцитов и макрофагов и инициацией перекисного окисления липидов. Впервые установлено, что подострое и острое отравления ДДВФ вызывают редукцию иммунных реакций, обусловленных активностью Thl-лимфоцитов, в большей степени по сравнению с иммунным ответом, свя-
занным с функцией Тп2-клеток. На организменном, клеточном и субклеточном уровнях доказано формирование вторичного иммунодефицитного состояния при действии ДЦВФ на организм животных.
Научно-практическая значимость. Установлены наиболее информативные показатели в экспериментах на животных для оценки иммуносупрессивного действия ДЦВФ: содержание лимфоцитов в тимусе и селезенке, активность естественных клеток-киллеров, тимусзависимый гуморальный иммунный ответ в продуктивной фазе антителогенеза, функция ТЫ-клеток в реакции гиперчувствительности замедленного типа. Для исследования хронического эффекта ДЦВФ (в условиях экологического неблагополучия) могут быть использованы показатели иммунных реакции, полученных при остром отравлении токсикантом в дозе 0.75 ЛДзо.
Материалы диссертации внедрены в учебный процесс кафедр охраны окружающей среды и экологической безопасности процессов хранения и уничтожения химического оружия и токсичных веществ и технологий уничтожения химического оружия и токсичных веществ Саратовского военного института радиационной, химической и биологической защиты, кафедры токсикологии и медицинской защиты ГОУ ВПО "Саратовский военно-медицинский институт", кафедры морфологии и экологии животных ГОУ ВПО "Саратовский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского". Материалы работы использованы в плановых НИР Саратовского военного института радиационной, химической и биологической защиты.
Апробация работы. Результаты исследований были доложены на Всероссийской конференции молодых ученых "Иммунитет и аллергия: от эксперимента к клинике" (Москва, 2005), V Всемирном конгрессе по иммунопатологии и аллергии (Москва, 2007 г.), заседаниях секции прикладных проблем безопасности хранения и уничтожения химического оружия Поволжского отделения АВН (2005-2007 гг.), научных конференциях кафедры токсикологии и медицинской защиты ГОУ ВПО "Саратовский военно-медицинский институт" (2006, 2007 гг.), кафедрах охраны окружающей среды и экологической безопасности процессов хранения и уничтожения химического оружия и токсичных веществ
и технологий уничтожения химического оружия и токсичных веществ "Саратовский военный институт радиационной, химической и биологической защиты" (2007 г.), кафедры морфологии и экологии животных ГОУ ВПО "Саратовский государственный университет им. Н.Г.Чернышевского" (2005, 2007 гг.).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 работ, 3 из которых в изданиях перечня ВАК РФ.
Объем и структура диссертации. Работа изложена на 135 страницах, состоит из введения, 7 глав, заключения, выводов и практических рекомендаций. Работа иллюстрирована 38 таблицами и 2 рисунками. Библиографический указатель включает 209 источников отечественной и зарубежной литературы.
Основные положения, выносимые на защиту
Воздействие ДЦВФ в условиях экологического неблагополучия сопровождается снижением доиммунных механизмов защиты организма, что проявляется в уменьшении его устойчивости к инфекциям.
После действия ДЦВФ происходит преимущественно редукция иммунных реакций, связанных с функцией ТЫ-лимфоцитов, по сравнению с гуморальными иммунными реакциями, обусловленными функцией Т1і2-лимфоцитов и В-клеток.
Супрессия показателей иммунного статуса при интоксикации ДЦВФ обусловлена снижением миграции клеток в органы системы иммунитета из костного мозга, редукцией кооперации Т- и В-лимфоцитов, ингибированием эстераз Т-лимфоцитов, моноцитов и макрофагов, увеличением кортикостерона в крови и инициацией перекисного окисления липидов.
Общая характеристика фосфорорганических соединений
В 1902 г. А.Е. Арбузов открыл новый путь получения эфиров алкилфос-финовых кислот, получивших название "перегруппировки Арбузова". Это позволило в 1931 г. А.Е. Арбузову и Б.А. Арбузову впервые получить эфиры пи-рофосфористой, а также моно- и дитиопирофосфорных кислот и вьщелить в чистом виде этиловый эфир пирофосфорной кислоты. В 1932 г. W. Lange и G. Kruger синтезировали ряд алкиловых эфиров фторфосфорной кислоты, получивших название "эфиров Ланге". Было установлено, что эти соединения ядовиты. Начиная с 1950 г., синтез новых ФОС принял широкий размах (Голиков, 1968). В настоящее время производство ФОС в мире составляет сотни тысяч тонн (Каган, 1977; Лужников, Костомарова, 2000).
ФОС составляют обширную группу вешеств, широко использующихся в сельском хозяйстве в качестве пестицидов: инсектицитов - для уничтожения насекомых, акарицидов - клещей, нематоцидов - червей, зооцидов и ротентицидов - грызунов, лимацидов - моллюсков, ларвицидов - личинок насекомых, ово-цидов - яиц насекомых, фунгицидов - грибков, гербицидов - сорняков, дефолиантов (препаратов, вызывающих опадение листьев и облегчающих уборку некоторых культур), десикантов (препаратов, способствующих подсушиванию растений). В промышленности ФОС используются для синтеза различных веществ, обладающих избирательным действием в отношении определенных видов животных и другими целями. В быту ФОС применяются преимущественно в качестве инсектицидов.
Острые и хронические интоксикации ФОС, как правило, происходят при нарушении техники безопасности в процессе использования данных соединений по назначению, а также при употреблении их с суицидальной целью или в качестве суррогатов алкоголя. В связи с реализацией программы, предусматривающей широкомасштабную утилизацию токсичных химикатов, существенная часть которых является ФОС, не исключена вероятность массовых острых и хронических отравлений при авариях и нарушениях техники безопасности. Возможно использование ФОС в качестве отравляющих веществ при осуществлении террористических актов (например, использование в 1975 г. зарина в метро Токио сектой "Аум Синрике" (Masuda et al., 1995). По своему химическому строению большинство ФОС относятся к следующим группам: эфиры тиофосфорной кислоты (тиофос, метафос, метилнитрофос, меркаптофос, тир-хлорметафос-3), эфиры дитиофосфорной кислоты (карбофос, фосфамид), амиды пирофосфорной кислоты (октаметил), эфиры алкилфосфорных кислот (хлорофос, ДЦВФ) (Голиков, 1968).
В отечественной литературе Ф,ОС по токсичности разделяют на 4 группы: сильнодействующие токсичные вещества - тиофос, меркаптофос, метилэ-тилтиофос; высокотоксичные вещества - метилмеркаптофос, фосфамид, ДЦВФ, базудин, антио, цидеал, фталофос, бензофосфат - (ЛД50 - 50-200 мг/кг); соединения средней токсичности - хлорофос, метилнитрофос, карбофос, три-хлорметафос-3, сайфос - (ЛД50 - 200-1000 мг/кг); вещества малой токсичности - винилфосфат, бромофос, абат, цианокс, валексон, демуфос - (ЛД50 - более 1000 мг/кг) (Медведь и др., 1968; Каган, 1977; Лужников, Костомарова, 2000).
ФОС представляют собой большую группу ТХВ, обладающих антихо-линэстеразным эффектом, с реализацией которого связана характерная картина острой интоксикации (Саватеев, 1978; Лужников, 1982; Лудевиг, Лос,1983;
Могуш, 1984; Лужников, Костомарова, 1989, 2000; Бадюгин и др., 1992; Маркова и др, 1998).
Основной механизм действия ФОС на системы и органы организма - ин-гибирование ацетилхолинэстеразы. Это вызывает накопление ацетилхолина в центральной нервной системе, мозговом веществе надпочечников, ганглиях вегетативной нервной системы, а также в синаптической щели нервных окончаний парасимпатического отдела нервной системы, подходящим к м-холинорецепторам внутренних органов. Кроме того, ацетилхолин выделяется из пресинаптической мембраны нервных окончаний симпатической нервной системы, иннервирующей потовые железы, и соматической нервной системы (синапсы скелетных мышц). В результате действия ацетилхолина реализуется мускариноподобное, никотиноподобное и центральное действие ФОВ (Луде-виг, Лос, 1983; Могуш, 1984; Лужников, Костомарова, 1989, 2000). Неантихо-линэстеразным механизмом действия ФОС (Прозоровский, Саватеев, 1976) является их способность фосфорилировать некоторые белки, действовать на м- и н-холинорецепторы (курареподобный эффект), взаимодействовать с протеоли-тическими ферментами, оказывать воздействие на адренергические структуры, способствующее увеличению секреции ацетилхолина из нервных окончаний (Прозоровский, Саватеев, 1976; Саватеев, 1978; Виноградов и др., 1985; Лужников, Костомарова, 1989,2000).
Материал и методы исследований
Объекты исследования и применяемые препараты. Исследования проводились на 776 неинбредных крысах и 78 мышах обоего пола. Масса крыс и мышей составляла соответственно 180-240 и 18-22 г. Эксперименты на животных проводили в соответствии с требованиями Женевской конвенции "International Guiding Principles for Biomedical Research Inroling Animals" (Geneva, 1990).
В качестве вещества, моделирующего острое и хроническое действие ФОС (моделирование действие ФОС в условиях экологического загрязнения), применяли ДДВФ. Токсикант вводили подкожно в дозах 0.2; 0.5 и 0.75 LD50 (LD5o для крыс и для мышей составляла 70.0±4.5 и 58.5±6.3 мг/кг соответственно), а также в дозе 0.01 LD50 в течение 30 сут.
Опыты на мышах, в связи с особенностями экспериментальной модели, проводили при исследовании КОЕ из костного мозга в селезенку и оценке нарушения кооперации Т- и В-клеток под влиянием ДДВФ. Роль супрессии функции ТЫ- Тп2-лимфоцитов в редукции иммунных реакций при действии ФОС изучали при подостром отравлении ДДВФ. При этом токсикант вводили белым крысам в дозе 1/7 DL50 ежедневно подкожно в течение 6 сут. Эксперименты проводили в светлое время сут (с 9,00. до 15.00 ч), характеризующееся минимальным содержанием КС в плазме крови крыс (Dhabhar et al, 1985). Кровь для исследования титра антител получали из подъязычной вены животных. Лимфо-идные органы извлекали у животных после цервикальной дислокации в различные сроки после интоксикации.
Исследование интегрального состояния антиинфекционной НИРО при действии ФОС. Интегральное состояние антиинфекционной НИРО определяли по показателям течения экспериментальной инфекции, вызванной внутрибрю-шинным введением крысам суспензии суточной культуры Е. Coli в дозах 4.5; 6.0; 8.0 млрд. микробных тел. Кроме того, моделировалась экспериментальная пневмония путем введением крысам суспензии суточной культуры P. vulgaris в дозах 3.5; 5.0; 6.5 млрд. микробных тел в ткань легкого. Микроорганизмы вводили через 4 сут после иммунизации ими в дозе 106 микробных тел. Данные культуры использовались в связи с тем, что роль условнопатогенной флоры в возникновении различных инфекционных осложнений при острых и хронических отравлениях весьма значительна (Бельцкий, Снастина, 1985; За-бродский, 2002).
Антиинфекционную НИРО определяли по летальности крыс в течении 48 ч от экспериментальной инфекции по среднелетальной дозе Е. Coli и P. vulgaris (LD50) и среднеэффективному времени жизни животных (Et5o) в опытной и контрольной группах, расчитанных методом пробит-анализа (Беленький, 1963). Введение условно-патогенных микроорганизмов производили через 24 ч и через 30 сут после острой и хронической интоксикации. При хроническом воздействии иммунизацию проводили на 25 сут. Иммунизацию осуществляли одновременно с введением ДДВФ.
Обсемененность крови и селезенки бактериями является одним из параметров, характеризующим состояние неспецифической и иммунологической резистентности организма после воздействия ксенобиотиков (Забродский, 1998; Германчук, 2000). Влияние ФОС на обсемененность селезенки и циркулирующей крови E.Coli проводили общепринятыми методами (Ремезов, Башмаков, 1976). Суточную культуру E.Coli в дозе 1.5-109 микробных тел вводили через 30 мин после воздействия ФОС.
Сывороточная активность лизоцима. Лизоцим (мурамидаза) - один из важных факторов доиммунной защиты организма. Он был открыт в 1909 г. П.К.Лащенковым и изучен в 1922 г. А.Флемингом. Источником лизоцима являются нейтрофильные гранулоциты и моноциты. (Бухарин, Васильев, 1974; Гембицкий и др., 1987). Использование показателя лизоцимной активности для оценки неблагоприятного действия химических факторов на организм свидетельствуют о высокой чувствительности данного теста (Измеров и др., 1977; Генес и др., 1981; Бухарин и др., 1985; Забродский, 1998; Германчук, 2000). Как правило, химические соединения вызывают снижение лизоцимной активности сыворотки крови (Забродский, 1998, 2002). Однако свидетельством отрицательного воздействия ксенобиотиков на организм может являться также и повышение содержания лизоцима в крови. Некоторые иммунологические реакции связаны с активностью лизоцима. Так, комплекс "IgA-антиген" проявляет антибактериальную и нейтрализующую активность после активации комплементом только в присутствии мурамидазы (Nouragargh, Holt, 1986).
Изменение антиинфекционной неспецифической и иммунологической резистентности организма при экспериментальном перитоните
Исследования показали (табл. 3.1), что острое (0.75 LD5o) и хроническое отравление ДДВФ приводит к увеличению летальности крыс от экспериментальной инфекции (перитонита). Так, по сравнению с контролем, составляющим 12.5+5.1%, этот показатель увеличивался после острой интоксикации ДДВФ и его хронического действия (0.01 ЛД50 в течение 30 сут) соответственно на 17.5 и 25.0% (р 0.05).
Увеличение летальности животных от экспериментальной инфекции было сопряжено с уменьшением ЛД50-Е. Coli и Et5o- Это вполне закономерно, так как показатель летальности ЛД50 Е. Coli и Etso находятся в обратном соотношении. После острого и хронического действия ДДВФ ЛД50 Е. Coli уменьшалась соответственно в 1.5 и 1.6 раза (р 0.05), a Et5o - в 1.4 и 1.5 раза (р 0.05) соответственно.
Таким образом, после острого и хронического действия ДДВФ происходит увеличение летальности животных от экспериментального перитонита после предварительной иммунизации, снижение ЛД5о Е- Coli и среднеэф-фективного времени жизни животных, что свидетельствует о редукции под влиянием ДДВФ неспецифической и иммунологической резистентности организма. Степень редукции показателей при остром действии ДДВФ (0.75 LD5o) приблизительно соответствует снижению параметров при хроническом эффекте (0.01 LD5o в течение 30 сут).
Проведенные эксперименты на крысах показали (табл. 3.2), что острое (0.75 LD50) и хроническое отравление ДДВФ приводит к увеличению летальности крыс от экспериментальной пневмонии, вызванной P. vulgaris. Так, по сравнению с контролем, составляющим 23.3+7.7%, этот показатель увеличивался после острого и хронического действия ДДВФ соответственно на 24.7 и 29.8% (р 0.05).
Увеличение летальности животных от экспериментальной инфекции закономерно сопровождалось уменьшением ЛД50 P. vulgaris и Et5o. При остром и хроническом действии ДДФВ ЛД50 Р- vulgaris уменьшалась в 1,5 и 1,6 раза (р 0.05), a Et50 - в 1.4 и 1.6 раза соответственно (р 0.05). Полученные результаты свидетельствуют о том, что острое и хроническое действие вызывает приблизительно одинаковое снижение неспецифической и иммунологической резистентности организма.
НРО определяется факторами доиммунной защиты организма, к основ-ным из которых относятся рецепторы для патогенов PRR и Toll, система ком племента, белки острой фазы, сывороточная активность ТКБ ф-лизина), лизоцима, интерфероны и фагоцитоз. (Горизонтов, 1981а, б; Петров, 1987; Забродский, 2002; Хаитов и др., 2002).
Таким образом, после острого и хронического действия ДЦВФ происходит увеличение летальности животных.от экспериментальной пневмонии после предварительной иммунизации, снижение HJS aP.vulgaris и среднеэффективного времени жизни животных, что свидетельствует о редукции под влиянием токсиканта неспецифической и иммунологической резистентности организма.
При исследовании числа микробных тел Е. Coli в крови и селезенке беспородных крыс при остром (0.75 LD50) и хроническом действии ДЦВФ (0.75 LD50) через 1 сут после введения микроорганизмов установлено (табл. 3.3), что после остром и хроническом действии токсиканта количество микробных тел E.Coli в крови статистически значимо возрастало в 2.3 и 2.5 раза соответственно (р 0.05), а в и селезенке - в 4.5 и 3.5 раза (р 0.05) соответственно.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что острое и хроническое действие ДДВФ вызывает приблизительно одинаковую обсемененность E.Coli селезенки и крови.
Таким образом, при остром и хроническом отравлении ДДВФ происходит увеличение содержания числа микробных тел Е. СоН в циркулирующей крови и селезенке крыс после их введения по сравнению с контролем, что свидетельствует о снижении неспецифической и иммунологической резистентности организма.
