Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современные представления о строении, методах выделения и свойствах гуминовых веществ 14
1.1 Общая характеристика гуминовых веществ 14
1.1.1 Элементный анализ гуминовых веществ 18
1.1.2 Структурно-групповой состав гуминовых веществ 19
1.1.3 Инфракрасная спектроскопия гуминовых веществ 22
1.1.4 Молекулярно – массовый состав гуминовых веществ 24
1.1.5 Методы фракционирования природных объектов 26
1.1.6 Конформационные изменения и растворимость гуминовых веществ 28
1.2 Исследование поверхности гуминовых веществ методом сканирующей атомно – силовой микроскопии 30
1.3 Комплексообразующие свойства гуминовых веществ 33
1.4 Адсорбция гуминовых веществ на глинистых минералах 36
1.5 Биологическая активность гуминовых веществ 38
Глава 2. Материалы и методы 42
2.1 Объекты исследования 42
2.2 Выделение и очистка гуминовых веществ 43
2.3 Фракционирование гуминовых веществ 43
2.3.1 Выделение гиматомелановых кислот 43
2.3.2 Фракционирование гуминовых веществ методом дробного осаждения 43
2.3.3 Фракционирование гуминовых веществ методом электрофореза 44
2.3.4 Фракционирование гуминовых веществ методом гель-проникающей хроматографии 45
2.4 Получение модифицированных форм монтмориллонита 46
2.5 Определение физико-химических характеристик гуминовых веществ 46
2.5.1 Элементный анализ гуминовых веществ 46
2.5.2 Электронная спектроскопия гуминовых веществ в ультрафиолетовой и видимой области 47
2.5.3 Инфракрасная (ИК) спектроскопия гуминовых веществ 47
2.5.4 Фотометрический анализ гуминовых веществ 47
2.5.5 Определение критической концентрации мицеллообразования гуминовых веществ 47
2.5.6 Кислотно-основные свойства и содержание основных функциональных групп в составе гуминовых веществ 48
2.6 Определение физико-химических характеристик форм монтмориллонита 49
2.6.1 Рентгеноструктурный анализ 49
2.6.2 Определение рН солевой вытяжки 50
2.7 Исследование комплексообразующих свойств гуминовых веществ по отношению к ионам металлов 50
2.7.1 Исследование образования нерастворимых гуматов Pb2+ и Zn2+ 50
2.7.2 Определение константы устойчивости гуматов металлов 51
2.7.3 Исследование влияния pH среды на комплексообразование гуминовых веществ с ионами металлов 53
2.8 Исследование связывания гуминовых веществ формами монтмориллонита гуминовых веществ 54
2.8.1 Определение влияния pH среды на связывание гуминовых веществ формами монтмориллонита 55
2.8.2 Определение влияния концентрации гуминовых веществ на связывание с формами монтмориллонита 56
2.9 Определение супрамолекулярных особенностей гуминовых веществ и гуматов металлов методом атомно-силовой микроскопии 56
2.10 Определение детоксицирующих свойств гуминовых веществ по отношению к ионам тяжелых металлов методом биотестирования 57
Глава 3. Определение физико-химических характеристик гуминовых веществ и монтмориллонита 62
3.1 Общая характеристика гуминовых веществ 62
3.2 Фракционирование гуминовых веществ 62
3.3 Физико-химические характеристики гуминовых веществ 67
3.4 Физико-химические характеристики форм монтмориллонита 80
Глава 4. Изучение комплексообразующих процессов, протекающих в системах содержащих гуминовые вещества и ионы металлов 85
4.1 Взаимодействие гуминовых веществ с катионами Pb2+ и Zn2+ 87
4.2 Определение содержания металлсвязывающих центров гуминовых веществ 88
4.3 Определение констант устойчивости комплексов гуминовых веществ с катионами Pb2+ и Zn2+ методом конкурентного комплексообразования 92
4.4 Исследование процессов комплексообразования ионов металлов с гуминовыми веществами с учетом влияния рН среды и концентрации катиона металла в растворе 97
4.4.1 Влияния рН среды на связывание ионов металлов гуминовыми веществами 97
4.4.2 Связывание гуминовых веществ с ионами свинца и цинка при фиксированных значениях pH (3,5; 6,5; 9,5) 101
4.5 Оптимизация процесса расчета сорбции 103
4.6 Исследование влияния различных факторов на связывание гуминовых веществ монтмориллонитом 105
4.6.1 Зависимость сорбции гуминовых веществ от концентрации и рН среды на формах монтмориллонита 107
4.6.2 Зависимость сорбции гуминовых веществ на формах монтмориллонита при фиксированных значениях рН среды 110
Глава 5. Изучение супрамолекулярных особенностей гуминовых веществ методом атомно-силовой микроскопии 115
Глава 6. Определение детоксицирующей способности гуминовых веществ методом биотестирования 122
6.1 Выбор и культивирование тест-объектов 122
6.2 Определение диапазона токсичности ионов Pb2+ 124
6.3 Определение диапазона токсичности ионов Zn2+ 125
6.4 Определение детоксицирующей способности гуминовых веществ по отношению к катионам Pb2+ и Zn2+ 126
6.5 Определение детоксицирующей способности фракций гуминовых веществ по отношению к катионам Pb2+ и Zn2+ 131
Заключение 137
Литература 140
- Структурно-групповой состав гуминовых веществ
- Фракционирование гуминовых веществ
- Влияния рН среды на связывание ионов металлов гуминовыми веществами
- Определение детоксицирующей способности фракций гуминовых веществ по отношению к катионам Pb2+ и Zn2+
Введение к работе
Актуальность темы
Гуминовые вещества (ГВ) являются наиболее реакционноспособным классом природных соединений, входящих в состав органического вещества почв, природных вод и каустобиолитов (торф, сапропель и бурый уголь). Макромолекулы ГВ полифункциональны, что обеспечивает образование устойчивых комплексов с экотоксикантами различной природы, тем самым уменьшая их миграционную способность и контролируя аккумуляцию (Genc-Fuhrman, 2016). Гиматомелановые кислоты (ГМК), фракция ГВ, проявляют значительную биологическую активность по отношению к микроорганизмам, однако их связывающая способность с ионами тяжелых металлов недостаточно освещена в литературе, вследствие чего они являются наиболее перспективными объектами для исследования. Моделирование биогеохимических циклов ионов тяжелых металлов, соответствующих реальным процессам, невозможно без учета влияния ГВ и минеральных компонентов почв. Связывание ГВ на поверхности глинистых минералов приводит к дополнительной активации металлсвязывающих центров гуминовых веществ. Актуальным является разработка сорбционных моделей «гуминовые вещества – ионы тяжелых металлов», учитывающих pH среды, гетерогенность структуры гуминовых веществ и влияние различных факторов на их комплексообразующую способность.
Основным направлением исследований является комплексное изучение физико-химических процессов связывания ионов тяжелых металлов с гуминовыми веществами и установление количественной взаимосвязи между структурой ГВ и их комплексообразующей и детоксицирующей способностью по отношению к токсикантам, а также разработка эффективных природных и полусинтетических сорбентов для очистки вод.
Степень разработанности темы исследования. Отечественные и зарубежные ученые (И.В. Перминова, Н.Ю. Гречищева, F.J. Stevenson, E.M. Murphy и др.) показали, что ГВ способны взаимодействовать с различными классами экотоксикантов, уменьшая их биодоступность, миграцию и токсичность. Однако открытым остается вопрос о механизмах взаимодействия ГВ с токсикантами и влиянии минеральных компонентов почвы на связывающую способность ГВ, а также нет достаточно полного описания структуры гуматов металлов и до конца не ясны конформационные изменения ГВ, протекающие при связывании с ионами металлов. Сложившаяся ситуация определяет актуальность выбранной темы исследования.
Работа выполнена при поддержке субсидии на выполнение Государственного задания в сфере научной деятельности в рамках проектной части по теме № 5.241.2014/K «Поглощение микроэлементов органо-минеральными системами, включающими гуминовые вещества различного происхождения и глинистые минералы с расширяющейся структурной ячейкой» в Естественнонаучном институте ФГБОУ ВО «Тульский государственный университет».
Цель работы: выявление закономерностей связывания нативных и фракционированных гуминовых веществ торфов с тяжелыми металлами (на примере ионов свинца и цинка), формами монтмориллонита в зависимости от концентрации и pH среды и определение детоксицирующих свойств гуминовых веществ по отношению к ионам тяжелых металлов.
Задачи исследования
1. Выделить гуминовые вещества из торфов различного генезиса
(черноольховый низинный и сфагновый переходный); получить модифицированные
формы глинистого минерала на основе монтмориллонита и определить физико-химические характеристики анализируемых образцов.
-
Установить закономерности протекания процессов сорбции, осаждения и комплексообразования в системах, содержащих гуминовые вещества и ионы тяжелых металлов (Pb2+, Zn2+), в зависимости от pH и концентрации катионов металла.
-
Оптимизировать процесс расчета параметров сорбции в системе, содержащей гуминовые вещества и ионы тяжелых металлов, и построить трехмерные модели изотерм связывания с учетом концентрации ионов металла и pH среды.
-
Выявить особенности поглощения гуминовых веществ природным монтмориллонитом и его модифицированными формами с расширяющейся структурной ячейкой при разных значениях рН и концентрации гуминовых веществ; рассчитать параметры сорбционных процессов в системе «гуминовые вещества -форма монтмориллонита».
-
Выявить особенности адсорбционного слоя гуминовых веществ на гидрофильной слюде и влияние ионов тяжелых металлов на конформационные изменения гуминовых веществ методом атомно-силовой микроскопии (АСМ).
6. Получить количественные характеристики детоксицирующей
способности гуминовых веществ и их фракций (коэффициенты и константы
детоксикации) по отношению к ионам Pb2+, Zn2+, используя тест-объекты, ранее
неиспользованные в качестве биоиндикаторов с ГВ, дрожжи Debaryomyces hansenii.
Научная новизна:
Впервые для гуминовых веществ черноольхового низинного и сфагнового переходного торфов и фракций гуминовых веществ рассчитано содержание свинец- и цинксвязывающих центров; определены константы устойчивости нерастворимых комплексов «гуминовые вещества - ион металла».
На основании токсикологических экспериментов с ранее неиспользованными (Debaryomyces hansenii) и стандартными {Escherichia coli) микроорганизмами, выбранными в качестве тест-объектов, впервые количественно определена детоксицирующая способность гуминовых веществ торфов различного генезиса и их фракций по отношению к ионам РЬ2+ и Zn2+.
Впервые получены диаграммы распределения гуминовых веществ торфов различного генезиса и гиматомелановых кислот на исходной и алюминиевой формах монтмориллонита и установлена количественная взаимосвязь между сорбцией гуминовых веществ и размером структурной ячейки монтмориллонита с учетом pH сорбционной среды.
Теоретическая и практическая значимость.
Результаты работы могут быть использованы для разработки технологий получения природных сорбентов на основе гуминовых веществ торфов и их применения при рекультивации загрязненных почв и очистке вод (питьевой, промышленной, грунтовой) от тяжелых металлов.
Полученная модель трехмерной изотермы сорбции является характеристикой сорбции катионов металлов на гуминовых веществах и их фракциях. Моделирование процессов может быть использовано в гидрохимических расчетах при оценке экологического риска загрязнения водоемов тяжелыми металлами (РЬ2+, Zn2+), а также для мониторинга поведения тяжелых металлов в природных средах.
Полученные данные по влиянию гуминовых веществ торфов и фракций на микроорганизмы, способность связывать ионы тяжелых металлов (Pb2+, Zn2+) в
нерастворимые комплексы, и тем самым проявлять детоксицирующий эффект, могут быть использованы для прогноза развития токсикологической ситуации в экосистемах, загрязненных катионами свинца и цинка.
Предложены эффективные природные и полусинтетические сорбенты на
основе гуминовых веществ и модифицированной формы монтмориллонита, обладающие повышенной сорбционной емкостью по отношению к ионам тяжелых металлов (патент на изобретение «Способ получения низкомолекулярной фракции гуминовых веществ черноольхового низинного торфа с молекулярной массой 98 кДа» № 2611525 от 27.02.2017; охранные документы об отнесении информации к категории коммерческая тайна (Ноу-Хау) - приказ от 09.12.16 № 1892 «Способ получения углеродосодержащего сорбента на основе гиматомелановых кислот сфагнового переходного торфа для инактивации тяжелых металлов в воде»; приказ от 21.10.2016 № 1609 «Метод получения гумино-минерального сорбента на основе алюминий-интеркалированной формы бентонитовой глины».
Методологию и методы исследования. Основными методами исследований являлись современные физико-химические методы анализа: атомно-абсорбционная спектрометрия с электротермической атомизацией, ИК-спектроскопия, потенциометрия.
Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность результатов исследований обеспечивается значительным объемом обработанного материала лабораторных исследований, подтверждается публикациями в рецензируемых журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией при Министерстве образования и науки Российской Федерации (ВАК РФ). Экспериментальные исследования выполнены с использованием современного оборудования и средств измерения, методик количественного и качественного химического анализа с применением высокочувствительных инструментальных методов. Результаты экспериментов получены в результате многократных измерений и последующей обработки с применением методов математической статистики (n=6, Р=0,95). Воспроизводимость результатов не выходит за пределы допустимых погрешностей.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Закономерности сорбционных процессов тяжелых металлов (Pb2+, Zn2+) на гуминовых веществах торфов различного происхождения и их фракциях.
-
Биологическая активность и детоксицирующая способность гуминовых веществ торфов и их фракций.
-
Особенности адсорбционного слоя гуминовых веществ на поверхности гидрофильной слюды. Закономерности связывания гуминовых веществ и их фракций на поверхности природного монтмориллонита и его модифицированных формах с расширяющейся структурной ячейкой.
Апробация работы
Результаты диссертационной работы были доложены на Всероссийской конференции с элементами научной школы для молодежи «Экотоксикология» (Тула, 2013, 2014, 2015) (диплом победителя конкурса); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Биодиагностика состояния природных и природно-техногенных систем» (Киров, 2014); The 15th European Meeting on Environmental Chemistry (EMEC15) (Brno, Czech Republic, 2014); International Symposium of the German Priority Programme SPP 1315 Biogeochemical Interfaces in Soil
on: Biogeochemical Interfaces in Soil - Towards a Comprehensive and Mechanistic Understanding of Soil Functions (Leipzig, 2014); Международной научной конференции XVIII Докучаевские молодежные чтения «Деградация почв и продовольственная безопасность России» (Санкт-Петербург, 2015); Международной заочной научно-практической конференции молодых учёных «Фундаментальные и прикладные исследования в современной химии» (Нежин, 2015); IX Региональной молодёжной научно-практической конференции Тульского государственного университета «Молодёжные инновации» (Тула, 2015); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием "Экология родного края: проблемы и пути решения" (Киров, 2016); Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2017); Всероссийской научной конференции «Фундаментальные науки - специалисту нового века» (студенческая научная школа-конференция «Дни науки в ИГХТУ») (Иваново, 2018).
Автор работы является победителем конкурса Программы «Участник молодежного научно-инновационного конкурса», реализуемой Фондом содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере (2013), обладателем гранта совместной программы Минобрнауки РФ и Германской службы академических обменов DAAD «Михаил Ломоносов» (2015).
Публикации. По материалам исследования опубликовано 18 работ, из них 8 -в изданиях, рекомендованных ВАК РФ, 1 - индексируемая в базе данных Web of Science; получен патент на изобретение № 2611525 от 27.02.2017, зарегистрировано 2 Ноу-Хау.
Личный вклад автора состоял в постановке цели и задач диссертационной работы, в самостоятельном выполнении экспериментальных исследований, обработке результатов, их интерпретации и практической апробации.
Структура и объем работы. Работа состоит из введения, литературного обзора, экспериментальной части, четырех глав с результатами и их обсуждением, заключения, списка цитируемой литературы из 149 источников. Работа представлена на 156 страницах печатного текста, содержит 55 рисунков и 21 таблицу.
Структурно-групповой состав гуминовых веществ
Основные свойства гуминовых веществ, такие как растворимость, зависимость от рН среды, комплексообразование с ионами металлов, биостимулирующие и детоксицирующие свойства, связаны с их структурой и функционально-групповым составом [55, 56].
В структуре ГВ присутствуют различные кислород-, азот- и серосодержащие функциональные группы: карбоксильные, фенольные, гидроксильные, карбонильные, хинойдные, сложноэфирные, тиольные и др. [3, 7]. Кислородсодержащие группы присутствуют как в каркасной, так и периферийной части молекулы гуминовых веществ. Основными кислородсодержащими группами являются: карбоксильные (18–61%), фенольные (9–38%), гидроксильные и карбонильные (14–25%) таблица 1.2 [3, 41, 47]. Сумма фенольных и карбоксильных групп (общая кислотность) обуславливает кислотные свойства гуминовых веществ. Азотсодержащие группы входят в состав каркасной и периферийной частей. Азот входит в состав аминокислотных остатков (20–45%), аминосахаров (2–8%) и в виде солей аммония (8–15%). В каркасной части молекулы гуминовых веществ, азот находится в виде гетероциклических конденсированных ароматических соединений (индол, пиррол), а также NH2– групп, связанных с ароматическими кольцами.
Согласно литературным данным, серосодержащие группы входят в состав аминокислот (3–6%), присутствуют в виде эфиров серной кислоты (4–19%), тиолов (54–70%), гетероциклов и алифатических сульфидов (3–23%) [58].
В состав карбоксильных и фенольных гидроксильных групп входит более 50% кислорода. Высокое содержание этих групп определяет кислотно–основные и комплексообразующие свойства гуминовых веществ, которые представляют огромный интерес [59].
Наличие в составе гуминовых веществ хинойдных и семихинойдных фрагментов создает возможность протекания реакций по свободнорадикальному механизму и определяет способность ГВ вступать в окислительно-восстановительные реакции, как в качестве окислителя, так и в восстановителя. Хиноны (электроноакцепторные группы) отвечают за производство активной формы кислорода (АФК) [60]. Гуминовые вещества, выделенные из природных вод, по сравнению с другим сырьем, имеют в своем составе высокое содержание электронодонорных групп.
В связи с вышеизложенным можно предположить, что высокая реакционная способность ГВ по отношению к тяжелым металлам обусловлена присутствием кислородсодержащих функциональных групп (-OH и -COOH). Вследствие этого определение содержания кислородсодержащих групп необходимо для оценки количества металлсвязывающих центров в составе ГВ [61]. Поскольку взаимодействие ГВ с различными классами соединений зависит от рН среды, то для описания этих взаимодействий необходимо учитывать протолитические свойства гуминовых веществ и их фракций, а именно значения констант диссоциации и количество кислородсодержащих функциональных групп.
Кислородсодержащие функциональные группы (карбоксильные и фенольные) определяют различными методами: титриметрическим методом, органическим функциональным анализом, ИК- и ЯМР-спектроскопей и др. [41, 47, 62-64]. Ряд аналитических методов был предложен для определения кислородсодержащих функциональных групп в составе гуминовых веществ. Кислотно-основное потенциометрическое титрование (кальциево-ацетатный, баритовый методы и рК-спектроскопия) является основным аналитическим методом для количественного определения содержания кислородсодержащих групп [65-67]. Наиболее широко используется способ обратного титрования с гидроксидом бария, который первоначально был разработан для угля, а затем адаптирован к гуминовым веществам, недостатком которого являются заниженные результаты. Гуминовые вещества вступают в реакции со щелочноземельными металлами с образованием малорастворимых солей, данное свойство является основой метода определения кислотных групп в составе ГВ по реакциям с Ba(OH)2 и Са(СН3СОО)2. Содержание функциональных групп в ГВ выражают в миллимоль или миллиэквивалент на единицу массы, как правило – на грамм вещества (ммоль/г) [3, 41].
Для описания значений констант диссоциации исследуют кривые кислотно-основного потенциометрического титрования, что является сложной задачей, так как они не содержат явных перегибов вследствие наличия нескольких кислотных групп. Для описания протолитических свойств макромолекул ГВ пользуются величиной, называемой кажущейся константой диссоциации [3, 68].
Фракционирование гуминовых веществ
Фракционирование гуминовых веществ после предварительной очистки проводили по методике, изложенной в пункте 2.3.1. Результаты представлены в таблице 3.1.
В результате фракционирования получено 3 фракции гуминовых веществ (ЧНТ) и 4 фракции гуминовых веществ (СПТ). Для гуминовых веществ торфов установлены границы высаливающего агента: 20–40%. Анализ результатов фракционирования позволил заключить, что чем старше отложение и чем выше степень его трансформации и гумификации, тем меньшее количество фракций входит в состав ассоциатов гуминовых веществ.
Методом гель-хроматографии получены фракции макромолекул гуминовых веществ и гиматомелановых кислот с определенным значением молекулярных масс. Использование 7 М раствора мочевины при фракционировании приводит к разрыву водородных связей и разрушает макромолекулярные ассоциаты. Кривые элюирования ГВ и ГМК, полученные по методике, описанной в пункте 2.3.4, представлены на рисунке 3.1.
На кривых элюирования гуминовых веществ отчетливо видны четыре пика (рисунок 3.1 а), на кривой элюирования гиматомелановых кислот - один пик (рисунок 3.1 б), что является доказательством полидисперсности гуминовых веществ, и мономолекулярного состава гиматомелановых кислот.
Независимо от происхождения, гуминовые вещества содержат в своем составе 4 фракции, различающиеся по молекулярной массе, в случае ГМК - одна фракция. Относительное содержание фракций ГВ рассчитывали по площадям пиков программой Mathcad 15 (таблица 3.2). Значения молекулярных масс ГВ рассчитывали по формуле 2.1, результаты представлены в таблице 3.2.
Методом эксклюзионной хроматографии установлено, что гуминовые вещества ЧНТ содержат фракции с молекулярными массами от 3 до 56 кДа, гуминовые вещества СПТ – от 2 до 23 кДа. Гиматомелановые кислоты монодисперсны, состоят из одной фракции, значение которой коррелирует с молекулярной массой фракций №I гуминовых веществ. Молекулярная масса ГМК (ЧНТ) составляет 56 кДа, ГМК (СПТ) – 23 кДа.
Молекулярные массы фракций ГВ ЧНТ, торфа со степенью гумификации 35–40% отличаются более высокими значениями, что связано с исходным биоматериалом и со степенью его разложения. В составе ГВ черноольхового низинного торфа, состоящего преимущественно из лиственных пород, содержится большое количество лигнина, еще не окисленного до перехода в нерастворимый в щелочах остаток гуминовых веществ – гумин, поэтому они отличаются большим значением молекулярных масс. В торфе по мере его разложения содержание лигнина возрастает, содержание целлюлозы падает, что указывает на разрушение последней. При трансформации торфа количество растворимых в щелочах гуминовых веществ сначала возрастает из-за продолжающегося окисления лигнина, а затем уменьшается вследствие его полного окисления и перехода в гумин [55, 72].
Гуминовые вещества представляют собой полиэлектролиты, содержащие в своем составе фракции с различной электрофоретической подвижностью, для разделения которых используют электрофоретические методы [115].
Гуминовые вещества (ЧНТ) и (СПТ) фракционировали электрофорезом в полиакриламидном геле (ПААГ), варьируя величину сетки: концентрации ПААГ 10, 12 и 15%. В качестве денатурирующих агентов в буфер добавляли 7М мочевину и ДДС-Na. В 10%-ном геле ПААГ молекулы ГВ «проскакивали» через сетку геля без деления на фракции, можно предположить, что молекулярные массы фракций менее 100 кДа. В 12%-ном ПААГ ГВ разделились на 3 электрофоретические зоны, но полученные полосы были размыты – величина сетки геля велика для полного разделения ГВ. Таким образом, наиболее оптимальной концентрацией полиакриламидного геля для максимального разделения анализируемых образцов гуминовых веществ является 15%.
Гуминовые вещества разделились на три яркие естественно окрашенные электрофоретические зоны: А – стартовая зона, не проникшая в поры 15%-ного геля, С – широкая зона в средней части геля, Е – узкая зона в нижней части геля (рисунок 3.2).
Методом электрофореза в ПААГ показано, что гуминовые вещества, независимо от генезиса торфа, имеют полимодальное распределение: фракция А имеет ММ более 100 кДа, фракции В, С, Д имеют ММ от 30 до 100 кДа, фракция Е - от 5 до 30 кДа. На электрофореграммах отмечено значительное количество высокомолекулярной фракции А (свыше 100 кДа).
Результаты гель-проникающей хроматографии и электрофореза в полиакриламидном геле коррелируют между собой. На основании проведенных экспериментов по изучению молекулярно-массового распределения (ММР) можно сделать вывод, что гуминовые вещества полидисперсны (содержат фракции с различными молекулярными массами), гиматомелановые кислоты имеют мономодальное распределение и представляют собой фракцию в составе гуминовых веществ.
Влияния рН среды на связывание ионов металлов гуминовыми веществами
Установлена зависимость между долей гуминовых веществ в растворе и рН при начальной концентрации гуминовых веществ 250 мг/л в отсутствие и в присутствии ионов металлов (Pb2+ и Zn2+) (рисунки 4.11, 4.12), при pH от 2 до 10 и концентрации ионов металлов от 5 до 50 мкм/дм3.
В отсутствие ионов металлов в растворе, при понижении рН до 5 происходит плавное уменьшение растворимости гуминовых веществ. Дальнейшее понижение рН резко снижает растворимость ГВ, полное осаждение гуминовых веществ наблюдается при рН = 3 ± 1. Изменение рН раствора от 10 до 2 приводит к постепенным пространственным и конформационным переходам гуминовых веществ «линейная молекула-клубок-глобула» (рисунок 4.13) [55].
При понижении рН функциональные группы ГВ и ГМК протонируются и эффекты отталкивания сведены к минимуму. На этой стадии гидрофобные участки расположены во внутренней части структуры, а гидрофильные находятся в контакте с водной средой, что связано с мицеллообразованием и уменьшением поверхностного натяжения. При понижении рН до 5 ± 1 происходит плавное уменьшение растворимости ГВ. Повышение концентраций ионов водорода вызывает протонирование карбоксильных групп ГВ, что в конечном итоге ведет к осаждению макромолекул ГВ при рН = 3 ± 1; осаждение молекул ГМК происходит при рН = 7 ± 1.
В присутствии ионов металлов (рисунки 4.11, 4.12) содержание гуминовых веществ и гиматомелановых кислот в растворе уменьшается за счет образования комплексов «гуминовые вещества – ионы металла». Максимальное связывание катионов металлов с гуминовыми веществами черноольхового низинного торфа при рН 4 – 7, сфагнового переходного торфа - при 3,5–4. Растворимость гуминовых веществ зависит от начальной концентрации ионов металлов в растворе. Минимальная растворимость гуминовых веществ – при максимальной концентрации ионов металла. Максимальное связывание Pb2+ и Zn2+ в растворе с гуминовыми веществами ЧНТ при рН 4–7, с гуминовыми веществами (СПТ) – 3,5–4. При рН = 3,5–4 увеличивается растворимость гуминовых веществ, являющихся потенциальными лигандами, и происходит депротонирование карбоксильных групп, способных связывать ионы металлов. При рН 5–7,5 депротонируются фенольные группы, что приводит к возрастанию комплексообразующей способности гуминовых веществ по отношению к ионам металлов.
Для выявления стадий процесса связывания ионов металлов с гуминовыми веществами при pH от 2 до 9 определено удельное связывание ионов Pb2+ и Zn2+ в фазе раствора и в фазе осадка при начальной концентрации ионов металла 50 мкм/дм3. Удельное связывание металла с данной фазой рассчитывали как отношение количества металла, поглощенных гуминовых веществ в данной фазе (в растворе или осадке) к массе гуминовых веществ в растворе и осадке соответственно (рисунки 4.14, 4.15). 1,2 1,0
В системе, содержащей ионы свинца, связывание гуминовых веществ с ионами РЬ2+ происходит в осадке, раствор обеднен катионами свинца, что связано с выпадением в осадок нерастворимых гуматов свинца. Связывание ионов свинца с гиматомелановыми кислотами выше, чем с гуминовыми веществами. В данном случае помимо замещения ионов водорода карбоксильных групп на ионы металла, расположенные на поверхности молекулы гуминовых веществ, происходит связывание ионов металла уже на образовавшемся нерастворимом гумате (вторичная сорбция).
Связывание катионов цинка с гуминовыми веществами происходит преимущественно в растворе с образованием растворимых гуматов, осадок обеднен металлом. Для гуминовых веществ сорбция Zn2+ в фазе раствора не зависит от изменения pH (связывание происходит в кислой области). Можно предположить, что ионы цинка связываются как с катионной, так и с анионной частью полиосновных гуминовых веществ. Углеводные части молекулы ГВ способствуют псевдохелатированию через взаимодействие боковых цепей [107] при этом связывание ионов цинка с простыми кислородсодержащими функциональными группами можно отнести к ионно-обменному и ионно-ковалентному механизму. Связывание ионов Zn2+ с гиматомелановыми кислотами в фазе раствора возрастает с увеличением рН, что связано с дополнительным депротонированием фенольных групп. Для гиматомелановых кислот связывание ионов цинка происходит только в кислой области. Данная зависимость, может быть связана со способностью катионов цинка образовывать хелаты (внутрикомплексные циклические соединения) с доступными фенольными и карбоксильными группами ГМК с образованием четырех членных циклов [107].
Определение детоксицирующей способности фракций гуминовых веществ по отношению к катионам Pb2+ и Zn2+
Отличительной особенностью гуминовых веществ является полидисперсность. За отдельные экологические функции, в том числе и за детоксицирующую способность, могут отвечать отдельные фракции, входящие в их состав [148]. В связи с этим актуально проанализировать детоксицирующую способность отдельных фракций гуминовых веществ торфов.
Биологическую активность фракций гуминовых веществ на клетки микроорганизмов исследовали в диапазоне концентраций 25-150 мг/л. Контроль осуществляли по выходу сырой биомассы микроорганизмов (дрожжей Debaryomyces hansenii ВКМ Y-2482) (рисунок 6.7).
При концентрации 50 мг/л фракции ГВ (СПТ) в культуральной среде наблюдается максимальный выход биомассы выбранного штамма (в 1,5 раза относительно контроля). Действие фракции ГВ на выбранный штамм при концентрации выше 100 мг/л приводит к угнетению роста микроорганизмов, прирост биомассы дрожжей ниже контроля. Максимальное увеличение выхода биомассы (в 1,3 раза относительно контроля) наблюдалось при концентрации в культуральной среде 50 мг/л фракции гуминовых веществ независимо от их происхождения. Фракции гуминовых веществ оказывают стимулирующий эффект на рост штамма дрожжей в диапазоне концентраций 25–50 мг/л, что выражается в увеличении биомассы микроорганизмов по сравнению с контролем. Подобный эффект можно объяснить тем, что фракции ГВ, полученные методом дробного осаждения, имеют меньшие молекулярные массы и размер, по сравнению с ГВ, поэтому они способны легче проникать через поры клеточных мембран и выступать в качестве дополнительных субстратов, тем самым непосредственно влиять на клеточный метаболизм [145, 149].
Детоксицирующее действие фракций ГВ (ЧНТ и СПТ) исследовали в присутствии ионов Pb2+ и Zn2+ и оценивали по приросту биомассы клеток микроорганизмов (рисунок 6.8).
Наибольшей детоксицирующей способностью по отношению к ионам Pb2+ обладает фракция ГВ (СПТ) (рисунок 6.8-а). Нечувствительность микроорганизмов к высокой концентрации ионов Pb2+ в культуральной среде и высокий выход биомассы дрожжей (в 1,5–3 раза выше по сравнению с контролем) можно объяснить стресс-метаболизмом. Присутствие фракции ГВ (ЧНТ) при концентрации 150 мг/л в культуральной среде приводит к выходу биомассы дрожжей сопоставимого с контрольным значением (рисунок 6.8-а). Увеличение выхода биомассы связано с образованием комплекса фракции ГВ с ионами Pb2+, что приводит к уменьшению биодоступности ионов металлов из раствора и одновременному улучшению поступления питательных веществ в клетки дрожжей (обогащению среды необходимыми для роста веществами).
Фракции ГВ (ЧНТ и СПТ) при концентрациях 25–50 мг/л оказывают минимальное действие на рост биомассы микроорганизмов в присутствии ионов Zn2+ (рисунок 6.8-б). Установлено, что увеличение биомассы наблюдается при концентрации фракций ГВ 100 и 125 мг/л. Уменьшение биомассы дрожжей при концентрации 150 мг/л можно объяснить тем, что фракции образуют на поверхности клеток полимолекулярный слой, который блокирует нормальный обмен веществ и препятствует поступлению питательных веществ в клетку.
Для количественной оценки детоксицирующего действия фракций гуминовых веществ в присутствии ионов Zn2+ и Pb2+ рассчитывали коэффициенты детоксикации D (таблица 6.4) по уравнению 2.12 (пункт 2.10.8).
Фракция гуминовых веществ сфагнового переходного торфа по отношению к ионам Pb2+ обладает наибольшей детоксицирующей способностью -коэффициент детоксикации равен 1,9 ± 0,1. Зависимость коэффициента детоксикации от концентрации фракций гуминовых веществ изменяется линейно, что дает возможность рассчитать константу детоксикации (рисунки 6.9, 6.10).
Для фракций гуминовых веществ построены линейные зависимости коэффициента детокскикации от концентрации фракций гуминовых веществ D = f(C) и определены константы детоксикации [7] по отношению к катионам Pb2+ и Zn2+ (рисунок 6.10).
Константа детоксикации фракций гуминовых веществ по отношению к ионам Pb2+ не зависит от происхождения и имеет значение 0,005 ± 0,001. Для ионов цинка константа детоксикации имеет зависимость от выбора токсикантов и от происхождения гуминовых веществ, константы детоксикации фракций гуминовых веществ ЧНТ и СПТ составили 0,059 ± 0,001 и 0,068 ± 0,001, соответственно.
Результаты по изучению детоксицирующих свойств гуминовых веществ торфов позволяют утверждать, что гуминовые вещества и фракции оказывают детоксицирующее действие по отношению к ионам Pb2+ и Zn2+, связывая катионы металлов в нетоксичные комплексы. Высокая концентрация гуминовых веществ оказывает решающее влияние на снятие токсического эффекта. Максимальный детоксицирующий эффект гуминовых веществ проявляется при концентрации 75-150 мг/л. Артефактом является детоксицирующая способность гуминовых веществ при концентрации 25 мг/дм3 по отношению к ионам Zn2+.