Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Жирные кислоты организмов континентальных вод: обзор литературы 15
1.1. Использование жирных кислот в качестве биомаркеров в исследовании трофических взаимодействий в водных экосистемах 15
1.1.1. Жирные кислоты бактерий 16
1.1.2. Жирные кислоты фотосинтезирующих эукариот и прокариот 26
1.1.3. Жирные кислоты пресноводных беспозвоночных и некоторых других нефотосинтезирующих эукариот 38
1.1.4. Жирные кислоты пресноводных и морских рыб 50
1.2. Незаменимые ПНЖК в физиологии и метаболизме рыб и человека 63
1.2.1. Значение ПНЖК для физиологического состояния рыб. Содержание n-3 и n-6 ПНЖК в пищевых объектах рыб как важная характеристика их качества 63
1.2.2. Значение ПНЖК для здоровья человека и основные источники этих веществ 68
Глава 2. Район работ, материалы и методы исследования 85
2.1. Сбор проб биологических объектов 85
2.2. Водохранилище Бугач 91
2.3. Описание эксперимента с Daphnia galeata 92
2.3.1. Культивирование организмов 92
2.3.2. Подготовка кормовой смеси 92
2.3.3. Протокол эксперимента 93
2.4. Подготовка проб для анализа жирных кислот 95
2.4.1. Подготовка проб сестона и донных осадков 95
2.4.2. Подготовка проб беспозвоночных 96
2.4.3. Подготовка проб рыб 96
2.5. Подготовка проб для измерения влажности, определения общего органического углерода и азота и их стабильных изотопов 96
2.6. Анализ общего содержания углерода и азота 97
2.7. Анализ жирных кислот 98
2.7.1. Получение диметилдисульфидных производных 98
2.7.2. Получение диметилоксазолиновых производных 99
2.7.3. Омыление липидов 100
2.8. Изотопный анализ отдельных жирных кислот (ИАОВ) 100
2.9. Анализ стабильных изотопов азота и углерода 101
2.10. Обработка проб гидробионтов 101
2.10.1. Обработка проб фитопланктона 101
2.10.2. Обработка проб зоопланктона 102
2.10.3. Обработка проб зообентоса 102
2.11. Расчёт эффективности переноса ПНЖК и углерода по трофическим цепям 103
2.11.1. Расчёт первичной продукции 103
2.11.2. Расчёт вторичной продукции 104
2.11.3. Расчёт продукции ПНЖК 105
2.12. Расчет трофической позиции консументов 105
2.13. Статистический анализ данных 105
Глава 3. Роль филогенетического и экологических факторов в формировании ЖК состава пресноводных беспозвоночных 108
3.1. Влияние температуры воды и таксономической принадлежности планктонных беспозвоночных на их жирнокислотный состав 108
3.2. Влияние таксономической принадлежности бентосных беспозвоночных на их жирнокислотный состав 121
3.3. Выявление факторов, влияющих на внутривидовую изменчивость жирнокислотного состава эврибионтных беспозвоночных 141
Глава. 4. Исследование спектров питания пресноводных беспозвоночных и позвоночных животных с помощью ЖК маркеров 158
4.1. Спектры питания водных беспозвоночных на примере двустворчатых моллюсков родов Dreissena и Unio 159
4.2. Спектры питания водных позвоночных на примере разных популяций нерки 174
4.3. Спектры питания амфибионтных позвоночных на примере головастиков 182
4.4. Исследование спектров питания водных беспозвоночных с помощью изотопных соотношений углерода в отдельных жирных кислотах 198
Глава. 5. Эффективность переноса веществ разной физиологической ценности по трофическим цепям водных экосистем 221
5.1. Эффективность переноса ПНЖК и общего органического углерода между продуцентами и консументами эвтрофного водохранилища 222
5.2. Эффективность переноса ПНЖК и общего органического углерода между водной и наземной экосистемами через трофическую пару рыбы-птицы 233
Глава. 6. Изучение основных пищевых источников n-3 ПНЖК для человека и поиск альтернативных источников 238
6.1. Абсолютное содержание физиологически ценных n-3 ПНЖК в консервированной рыбе 238
6.2. Печень сельскохозяйственных животных как источник физиологически ценных n-3 ПНЖК 251
Заключение 260
Выводы 261
Список используемой литературы 263
- Жирные кислоты бактерий
- Значение ПНЖК для здоровья человека и основные источники этих веществ
- Выявление факторов, влияющих на внутривидовую изменчивость жирнокислотного состава эврибионтных беспозвоночных
- Печень сельскохозяйственных животных как источник физиологически ценных n-3 ПНЖК
Жирные кислоты бактерий
Жирнокислотный состав бактерий, большей частью представлен насыщенными прямоцепочечными (НЖК) и разветвлёнными (РЖК), мононенасыщенными (МНЖК), циклопропановыми жирными кислотами и кислотами, содержащими гидроксильные группы. Варьирование состава жирных кислот обеспечивает необходимую текучесть мембран для поддержания их оптимального функционирования. В шестидесятых годах прошлого века была обнаружена специфичность жирнокислотного состава разных таксонов бактерий (Shaw, 1974). И уже с семидесятых годов биохимические маркеры стали использоваться для таксономической идентификации бактерий. Жирнокислотный состав позволяет определить таксономическое положение бактерий вплоть до отдельных родов (Shaw, 1974; Holt et al., 1979; Mancuso et al., 1990; Bertone et al., 1996; Simbahan et al., 2004). В начале XXI века описание нового штамма или вида бактерий стало сопровождаться подробной характеристикой его жирнокислотного состава (Yumoto et al., 2001). Были разработаны базы данных для автоматического экспресс-определения таксономической принадлежности того или иного штамма бактерий по жирнокислотному составу. Наиболее известной коммерческой базой данных является Sherlock Microbial Identification System (MIS), основанная на данных газовой хроматографии. В настоящее время, в коллекции MIS содержатся уникальные наборы жирных кислот более 1500 видов бактерий (http://www.midi-inc.com). Однако для определения жирнокислотного состава бактерий необходимо получить достаточное количество биомассы, что возможно сделать только для культивируемых видов. Далеко не все виды, обитающие в водных экосистемах, успешно культивируются. Кроме того, жирнокислотный состав бактерий зависит не только от таксономического положения вида, но и от условий обитания. Жирнокислотный состав бактерий, выращенных в лабораторных условиях, может сильно отличаться от ЖК состава бактерий из природной среды обитания (Сущик, 2008). Поэтому наряду с данными по ЖК составу лабораторных культур бактерий необходимы данные о биохимическом составе сестона природных экосистем в условиях доминирования одного вида или таксономически (физиологически) узкой группы бактерий. Применение ЖК-маркеров в водной экологии должно основываться на четких представлениях об особенностях биосинтеза и состава жирных кислот у основных групп бактерий, обитающих в водных экосистемах.
Синтез жирных кислот de novo во всех организмах осуществляется путём циклического повторения ряда реакций. Выделяют два типа синтеза жирных кислот: тип 1 и тип 2. Синтез ЖК по первому типу происходит, главным образом, у нефотосинтезирующих эукариот, а синтез по второму типу – у прокариот и фотосинтезирующих эукриот. У большинства бактерий, а также в некоторых органеллах эукариотических клеток (митохондриях и пластидах, имеющих бактериальное происхождение) при синтезе ЖК каждая реакция катализируются отдельным ферментом (Gago et al., 2011). Наиболее подробно биосинтез ЖК у бактерий изучен на примере грамотрицательного вида Escherichia coli (Shaw, 1974; Boom, Cronan, 1989; Jackowski et al., 1991; DiRusso et al., 1999; White et al., 2005; Schujman, de Mendoza, 2008).
Итак, синтез жирных кислот у бактерий начинается с карбоксилирования ацетил-КоА (Рисунок 1.1). В этой реакции участвует первая группа ферментов, состоящая из четырёх субединиц ацил-КоА карбоксилазы (AccA, AccB, AccC, AccD), катализирующая образование малонил-КоА из ацетил-КоА (White et al., 2005). Затем малонил-КоА переносится с помощью фермента малонил-КоА-АПБ трансацилазы (FabD) на ацилпереносящий белок (АПБ), который за счёт тиоэфирной связи удерживает промежуточные продукты удлинения углеродной цепи в течение всего синтеза ЖК. Дальнейшее удлинение жирнокислотной цепи состоит из повторяющейся серии следующих реакций. Реакция конденсирования, в которой из малонил-АПБ и ацетил-КоА, под действием фермента -кетоацил-АПБ синтаза III (FabH), образуется -кетоацил-АПБ (Gago et al., 2011). Далее НАДФН-зависимая -кетоацил-АПБ редуктаза (FabG) катализирует образование -гидроксил-АПБ. Следующая реакция дегидрирования катализируется -гидроксиацил-АПБ дегидротазой (FabZ или FabA), с образованием транс-2-еноил-АПБ. В четвёртой реакции происходит восстановление транс-2-еноил-АПБ, катализируемое НАДФН-зависимой (FabI или FabL) или НАДН-зависимой (FabV) еноил-АПБ редуктазой.
После полного прохождения первого цикла образованная ацильная цепь отделяется от АПБ и связывается тиоэфирной связью с остатком цистеина в активном центре фермента -кетоацил-синтаза I или II (FabB, FabF). Затем ацильная цепь присоединяется к малонил-АПБ с высвобождением молекулы СО2 (Chan, Vogel, 2010). Далее образованная -кетоацил-АПБ подвергается превращениям, описанным выше. Все четыре реакции циклически повторяются до образования насыщенной жирной кислоты необходимой длины (Jackowski et al., 1991; Nelson, Cox, 2008; Gago et al., 2011).
Описанные реакции отражают лишь общий принцип синтеза насыщенных жирных кислот у бактерий. Для синтеза ненасыщенных жирных кислот у разных бактерий имеются разные наборы ферментов. Например, у грамотрицательной E. coli под действием фермента -гидроксиацил-АПБ дегидротазы (FabA) из -гидроксидеканоил-АПБ образуется цис-3-деценоил-АПБ. Затем -кетоацил-синтаза I (FabB) катализирует образование цис-5-додеценоил-АПБ. В конечном итоге после удлинения углеродной цепи основную массу ненасыщенных ЖК в E. coli составляют цис-9-гексадеценовая и цис-11-октадеценовая кислоты (Chan, Vogel, 2010). Грамположительные бактерии, например, Streptococcus pneumoniae, вместо фермента FabA содержат специфическую цис/транс изомеразу (FabM), которая катализирует образование цис-3-деценоил-АПБ из транс-2-деценоил-АПБ (Chan, Vogel, 2010). Дальнейшее конденсирование катализирует фермент FabF, вместо FabB. Некоторые бактерии содержат десатуразы, которые встраивают двойную связь в насыщенную ЖК уже после её синтеза. Например, Bacillus subtilis и Pseudomonas aeruginosa содержат мембран-связанный фермент (DesA), который встраивает двойную связь в положение 5 и 9, соответственно, в жирные кислоты фосфолипидов мембран (Aguilar et al., 2001; Zhu et al., 2006). Таким образом, разные группы бактерий имеют особенности в синтезе жирных кислот и способны синтезировать жирные кислоты, присущие только данной группе. В настоящее время выделены маркерные жирные кислоты некоторых групп бактерий, широко распространённых в водных экосистемах (Таблица 1.1).
Для грамположительных бактерий характерны насыщенные жирные кислоты с нечётным числом атомов углерода, а также кислоты с разветвленной углеродной цепью, а именно изокислоты с 14-18 атомами углерода и антеизокислоты с 15-17 атомами углерода. Кроме того, грамположительные бактерии синтезируют моноеновые ЖК с прямой и разветвлённой цепями (Таблица 1.1).
Ещё одна группа бактерий, синтез жирных кислот которой изучен достаточно подробно, это сульфатредуцирующие бактерии. Основными маркерами данной группы являются разветвлённые и циклопропановые кислоты с 17 и 19 атомами углерода, 10-метилгексадекановая кислота, и некоторые моноеновые жирные кислоты (Таблица 1.1). Известны маркеры для отдельных родов сульфатредуцирующих бактерий: 10Ме16:0 используется как маркер рода Desulfobacter, а i17:1n-7, i15:1n-7, i19:1n-7 характерны для рода Desulfovibrio (Mancuso et al., 1990; Colaco et al., 2007). Схема синтеза маркерных жирных кислот в сульфатредуцирующих бактериях представлена на рисунке 1.2. Предшественником в синтезе разветвлённых ЖК является бутирил-КоА в то время как остальные ЖК синтезируются из ацетоацетил-КоА (Londry et al., 2004). Циклопропановые кислоты и 10-метилгексадекановая кислота синтезируются из соответствующих предшественников, связанных с фосфолипидами, встроенными в мембраны.
Метанотрофные бактерии, широко распространённые в донных отложениях водных экосистем, с точки зрения систематики принадлежат к двум типам: Proteobacteria и Verrucomicrobia. Тип Verrucomicrobia был описан недавно, поэтому жирнокислотный состав представителей этого типа изучен мало (Hedlund et al., 1997; Le Bodelier et al., 2009). В типе Proteobacteria выделяют Alphaproteobacteria и Gammaproteobacteria, которые различаются по жирнокислотному составу. Alphaproteobacteria, в основном, содержит С18 МНЖК, а Gammaproteobacteria – С16 МНЖК (Таблица 1.1). Несмотря на то, что ЖК состав протеобактерий хорошо изучен, новые редкие ЖК, характерные для отдельных родов данного типа, продолжают открывать и по сей день. Со временем эти ЖК тоже будут использованы, как маркерные.
Значение ПНЖК для здоровья человека и основные источники этих веществ
Все жирные кислоты, присутствующие в питании человека можно разделить на четыре основные группы: насыщенные (НЖК), мононенасыщенные (МНЖК), полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК) и транс-жирные кислоты. Количество транс-жирных кислот в питании человека было незначительным, и основным источником этих ЖК были продукты (мясо, молоко, жир) из жвачных животных (Da Silva et al., 2015). После введения в пищевую промышленность гидрогенирования растительных масел, доля транс-жирных кислот в питании человека сильно выросла. Помимо роста транс-ЖК в диете современного человека увеличилось и потребление НЖК, n-6 ПНЖК и жира в целом (Simopoulos, 1999). Основные n-6 ПНЖК рациона человека это 20:4n-6, главным источником которой служит мясо животных, и 18:2n-6, поступающая к нам из растительных масел, семян и орехов. Среди ПНЖК семейства n-3 в рационе человека доминируют 20:5n-3, 22:6n-3 и 18:3n-3. Основным источником ЭПК и ДГК для человека служит рыба и морепродукты (Gladyshev et al., 2009). АЛА поступает к человеку из растительных масел, семян, орехов и зелёных частей растений.
Жирные кислоты в организме человека выполняют несколько функций, одна из которых структурно-функциональная. Мембрана клеток представляет собой бислой фосфолипидов с белковыми включениями. Фосфолипиды состоят из полярной части (“головки”) и двух неполярных молекул ЖК, которые присоединяются к фосфолипиду в положение sn-1 и sn-2. Как правило, в положении sn-1 находятся НЖК или МНЖК, например, стеариновая или олеиновая (18:0, 18:1n-9), а в положении sn-2 находятся ПНЖК. Состав ЖК мембран клеток разных органов и тканей сильно варьирует. В сетчатке глаза человека 90% всех ЖК составляют всего 5 кислот: ДГК (20-25%), 16:0 (18-22%), 18:0 (15-20%), 18:1n-9 (16-19%) и АРК (9-12%) (Van Kuijk, Buck, 1992; Lauritzen et al., 2001). В клетках серого вещества коры головного мозга здорового человека доминируют 18:1n-9 (19%), 18:0 (19%), 16:0 (17%), ДГК (13.5%) и АРК (9%) (McNamara, Carlson, 2006). В фосфолипидах сердца человека преобладают АРК (22-24%), ЛК (18-20%), 16:0 (15%), 18:0 (14%), в то время как содержание ДГК достигает лишь 5% (Rocquelin et al., 1985). В печени основную долю составляют НЖК (16:0 и 18:0), а из ПНЖК преобладают ЛК (17%), АРК (8%) и ДГК (3%) (Гладышев, 2012). Жировая ткань человека состоит, в основном, из МНЖК и НЖК: 18:1n-9 (44%), 16:0 (22%), ЛА (14%), 16:1n-7 (7%) (Hodson et al., 2008).
Метаболизм целого организма во многом определяется процессами и скоростью этих процессов, ассоциированными с мембранами (Hulbert et al., 2005). Свойства мембран во многом определяются их ЖК составом (Basan, 2006; Mason et al., 2016). Мембраны, содержащие ПНЖК, более проницаемы для ионов Na+, K+, H+, что приводит к более быстрому обмену веществ (Hulbert et al. 2005; Betancor et al., 2015). Однако, мембраны с высоким содержанием ПНЖК в большей степени подвержены действию окислительных агентов вызывая окислительное повреждение органелл и клетки в целом (Pamplona, 2011; Zimmiak, 2011; Naudi et al., 2013; Brenna, Carlson, 2014). Механизмов для защиты от окисления ПНЖК в организме животных и человека весьма много. Витамин Е является акцептором радикалов и действует как ограничитель перекисного окисления липидов; пероксисомная каталаза предотвращает самоокисление ПНЖК; глютатион пероксидаза - селен содержащий фермент, разрушающий перекись водорода и действующий даже при низких концентрациях перекиси; супероксид дисмутаза удаляет свободные радикалы (Henderson, Tocher, 1987). Ткани человека, в которых скорость передачи сигналов и активность мембран имеют важное значение отличаются от других тканей высоким содержанием ДГК (Рисунок 1.8). Такими тканями, в первую очередь, являются нервные, например, кора головного мозга и сетчатка глаза, фоторецепторы которой характеризуются высокой скоростью передачи сигналов (Hulbert et al., 2005; German et al., 2006; Calder, 2016).
В попытках найти преимущества молекулы ДГК в функционировании мембран по сравнению с очень близкими по строению молекулами 22:5n-6 и 22:5n-3, а также ЭПК и АЛА были проведены многочисленные экспериментальные работы (Crawford et al., 1999). Предположительно, более компактное пространственное строение липидов этерифицированных ДГК способствует более эффективному липид-белковому взаимодействию внутри мембраны, что обеспечивает высокую эффективность восприятия светового сигнала и проведения нервного импульса (Crawford et al., 1999; SanGiovanni, Chew, 2005).
Напротив, для регуляции работы мембран некоторых других тканей необходима ЭПК, а не ДГК. Например, в эндотелии сосудов, ЭПК стабилизирует мембраны при возрастании температуры и увеличении количества холестерина тем самым снижая воспалительный процесс и улучшая работу эндотелия (Mason et al., 2016). ДГК уменьшает толщину мембран, увеличивает их текучесть и усиливает агрегацию холестерина в мембранах эндотелия сосудов (Mason et al., 2016).
Ещё одна функция, выполняемая ЖК в организме человека, это энергетическая. В качестве источников энергии в основном используются НЖК и МНЖК, которые в составе триацилглицеринов аккумулируются в белой жировой ткани человека (Qin et al., 2016). Помимо белой жировой ткани в организме человека присутствует бурая жировая ткань. В отличие от белой жировой ткани, в клетках которой находится одна большая жировая капля и небольшое количество митохондрий, клетки бурого жира богаты митохондриями, а многочисленные жировые капли ассоциированы с ними (Seale, 2015; Bartelt, Heeren, 2014; Betz, Enerback, 2015). У новорожденных детей содержание бурого жира гораздо выше, чем у взрослого человека (Bartelt, Heeren, 2014). Местоположение бурого жира во многом определяется его функциями: быстрое сжигание глюкозы и липидов для производства тепла обеспечивает защиту жизненно важных органов младенца (Lidell et al., 2014; Qin et al., 2016). Однако предполагается, что это не единственная функция бурого жира. В буром жире аккумулируется большое количество ДГК, которое, вероятно, используется как пул для обеспечения роста и развития мозга в течение первых месяцев жизни младенцев (Cunnane et al., 2000).
Особенная роль в организме человека принадлежит двум ПНЖК, а именно АРК и ЭПК. Эти ПНЖК являются предшественниками в синтезе гормоноподобных веществ - эйкозаноидов (Simopoulos, 1991, 2000, 2010; SanGiovanni, Chew, 2005). Синтез эйкозаноидов начинается с отщепления АРК или ЭПК от фосфолипидов мембран с помощью фермента фосфолипазы А2 (Tassoni et al., 2008). Этот фермент не специфичен к определённому семейству ПНЖК. Поэтому та ПНЖК, АРК или ЭПК, которая находится в избытке в мембранах, в большей степени будет использоваться в синтезе эйкозаноидов. Из АРК и ЭПК синтезируются три типа эйкозаноидов – простагландины, тромбоксаны и лейкотриены (Tapiero et al., 2002; Simopoulos, 2010). Простагландины и тромбоксаны синтезируются под действием фермента циклооксигеназы (COX), а лейкотриены – под действием фермента липоксигеназы (LOX). Эйкозаноиды, синтезированные из АРК и ЭПК отличаются по своей структуре и свойствам. Из АРК синтезируются простагландины и тромбоксаны второй серии, и лейкотриены четвёртой серии. Простагландины второй серии способствуют развитию воспалительного процесса и индуцируют боль; тромбоксаны второй серии вызывают сужение кровеносных сосудов, усиливают агрегацию тромбоцитов, что в конечном счёте приводит к повышению артериального давления, образованию тромбов и закупорке сосудов; лейкотриены четвёртой серии вызывают спазмы бронхов и усиливают секрецию слизи (Гладышев, 2012; Tapiero et al., 2002; Simopoulos, 2010). Из ЭПК синтезируются простагландины и тромбоксаны третьей серии, и лейкотриены пятой серии, обладающие противоположными свойствами, такими как, расширение кровеносных сосудов и бронхов, снижение кровеносного давления, подавление воспалительного процесса (Simopoulos, 1991; Tapiero et al., 2002; SanGiovanni, Chew, 2005; Schmitz, Ecker, 2008). Дополнительно, из ЭПК и ДГК под действием фермента LOX синтезируются противовоспалительные медиаторы, а именно, резолвины и нейропротектины (Janssen, Kiliaan, 2014). Эти медиаторы выполняют важные функции. Например, нейропротектин D1 ингибирует воспалительные процессы и предотвращает разрушение клеток пигментного эпителия сетчатки глаза (Bazan, 2006). Кроме того, ЭПК и ДГК замедляют синтез эйкозаноидов из АРК и в целом снижают синтез эйкозаноидов (De Caterina, 2011).
Выявление факторов, влияющих на внутривидовую изменчивость жирнокислотного состава эврибионтных беспозвоночных
Для определения влияния экологических факторов на ЖК состав беспозвоночных были исследованы популяции гаммарид Gammarus lacustris Sars, обитающих в условиях, различающихся по температуре и солёности воды, а также по наличию/отсутствию хищников (рыбы) в водоёмах. Чтобы избежать влияния филогенетического фактора, который, как было показано выше, играет ключевую роль в формировании ЖК состава бентосных беспозвоночных, исследования проводили на одном виде.
Температура и минерализация воды в исследованных озёрах приведены в Таблице 3.13. Среди исследованных озёр два озера были холодноводные, а именно, горное озеро Светлое и озеро Собачье, расположенное в северном регионе Красноярского края (Таблица 3.13). Помимо низких значений температур эти озёра характеризовались низкой минерализацией. В остальных озёрах температура воды в июле была практически одинаковая и превышала 20C. Минерализация в тёплых озёрах сильно варьировала: от 200 мг/л в оз. Фыркал до 17828 мг/л в оз. Шунет (Таблица 3.13). Значения минерализации воды в озёрах Шира и Шунет были близкие. В тепловодном оз. Аникино, воды которого в июле, как правило, прогреваются до 25C, в июле 2015 г. температура воды составила 18C (Таблица 3.13). Такое понижение температуры объясняется аномальным похолоданием в первой декаде июля. Процентное содержание количественно значимых ЖК приведено в Таблице 3.14. В популяциях G. lacustris из озёр Шунет, Фыркал и Утичье-1 было обнаружено высокое содержание ЖК маркеров бактерий (18:1n-7, 15:0 и 17:0), включая цианобактерий (18:1n-7), в то время как в популяциях гаммарусов из озёр Светлое и Собачье процентное содержание этих ЖК было самое низкое среди исследованных популяций (Таблица 3.14). Высокое процентное содержание ЖК маркеров диатомовых водорослей, а именно, 14:0, 16:1n-7, 16:2n-4 и 16:3n-4 было обнаружено в гаммарусах из озёр Красненькое и Утичье-3. Низкое содержание ЖК маркеров диатомей было обнаружено в популяциях из озёр Фыркал и Шира (Таблица 3.14).
Физиологически ценная ЭПК тоже является одним из маркеров диатомовых водорослей (Dunstan et al., 1994). Однако, вопреки ожиданиям, наименьшее процентное содержание ЭПК было обнаружено не в популяциях гаммарид из озёр Фыркал и Шира, а в гаммаридах из оз. Светлое, где содержание остальных маркеров диатомей было средним (Таблица 3.14). Высокий процент ЭПК содержали гаммарусы из озёр Собачье, Шунет и Аникино (Таблица 3.14). В популяциях G. lacustris из озёр Светлое и Фыркал было обнаружено высокое содержание линолевой кислоты (18:2n-6, ЛК), одного из маркеров зелёных микроводорослей и цианобактерий, (Таблица 3.14). Высокое содержание других маркеров зелёных микроводорослей и цианобактерий (18:3n-3 и 18:3n-6) было характерно для гаммарид из озёр Красненькое и Аникино (Таблица 3.14). В популяции G. lacustris из холодноводного оз. Светлое был обнаружен самый высокий процент стеаридоновой кислоты, маркера динофитовых и криптофитовых водорослей (Таблица 3.14). В гаммарусах из высокоминерализованных озёр (Шира и Шунет) содержание физиологически ценной ДГК в 2 раза превышало таковое гаммарусов из большинства озёр (Таблица 3.14). Высокое содержание физиологически ценной ЖК из семейства n-6, 20:4n-6 было обнаружено в популяциях из озёр Собачье и Фыркал, минимальный процент данной ЖК был зафиксирован в гаммарусах из оз. Красненькое. Суммарное процентное содержание ПНЖК семейства n-3 во всех исследованных популяциях было выше суммарного содержания ПНЖК семейства n-6 (Таблица 3.14). Значения соотношения n-3/n-6 в популяциях гаммарусов сильно варьировали. Самые высокие значения были обнаружены в гаммарусах из оз. Красненькое, что объясняется высоким содержанием ЭПК и низким содержанием АРК и ЛК в данной популяции (Таблица 3.14). Значения данного соотношения в G. lacustris из озёр Шира, Шунет и Утичье-3 были средние, что объясняется высоким содержанием ДГК и средним содержанием ЭПК, АРК и ЛК в данных популяциях. Низкие значения n-3/n-6 были обнаружены в гаммарусах из озёр Светлое и Фыркал, что объясняется низким содержанием ЭПК и ДГК, и высоким содержанием ЛК и/или АРК в данных популяциях (Таблица 3.14).
Обе дискриминантные функции были большие и статистически достоверные (Таблица 3.15). Первый дискриминантный корень выявил различия между популяциями G. lacustris из холодноводного, пресноводного оз. Светлое и тепловодного, минерализованного оз. Красненькое (Таблица 3.15, Рисунок 3.5). Переменные, обеспечившие основной вклад в различия по первому корню были незаменимая для животных 18:2n-6, маркер зелёных микроводорослей и цианобактерий, и физиологически ценная 20:5n-3, маркер диатомей (Таблица 3.15). Высокое содержание 18:2n-6 было в популяции из оз. Светлое, а 20:5n-3 – в популяции из оз. Красненькое (Таблица 3.14 и 3.15). Второй дискриминантный корень выявил различия между популяциями G. lacustris из минерализованного, безрыбного оз. Утичье-1 и холодноводного, пресноводного, безрыбного оз. Светлое (Таблица 3.15, Рисунок 3.5). Основной вклад в данные различия внесли 18:4n-3, 20:4n-3, 18:1n-7 и 17:0. Процентные содержания двух тетраеновых ЖК были высокими в гаммарусах из оз. Светлое, а процентные содержания двух бактериальных маркеров были высокими в гаммарусах из оз. Утичье-1 (Таблица 3.14). Дополнительно, дискриминантный анализ выявил сходство ЖК составов гаммарусов, обитающих во всех рыбных озёрах: Собачье, Аникино, Фыркал, Матарак и Утичье-3, а также сходство ЖК составов гаммарусов из трёх минерализованных, тепловодных, безрыбных озёр: Шира, Шунет и Красненькое (Рисунок 3.5).
На основании анализа ЖК маркеров (Таблица 3.14) и многомерного дискриминантного анализа (Таблица 3.14, Рисунок 3.5) можно заключить, что различия в ЖК составе популяций G. lacustris, обитающих в водоёмах, различающихся по температуре и минерализации воды, а также по наличию/отсутствию хищников (рыб) в водоёмах, главным образом, были вызваны различиями в спектрах питания исследуемых животных. В рационе гаммарусов из озёр Утичье-3 и Красненькое преобладали диатомовые водоросли. Гаммарусы из оз. Светлое предпочитали криптофитовых и/или динофитовых водорослей, богатых 18:4n-3, а также зелёных микроводорослей и/или цианобактерий, богатых 18:2n-6. Гаммарусы из оз. Фыркал тоже потребляли зелёных микроводорослей и/или цианобактерий, однако другие виды, богатые -линоленовой кислотой. Бактерии присутствовали в пище всех гаммарид, но их доля в питании популяций из озёр Шунет, Фыркал и Утичье-1 была больше, по сравнению с долей бактерий в питании остальных популяций. Дополнительно, мы проанализировали вариабельность каждой ЖК в гаммарусах (Таблица 3.16).
Наиболее стабильное процентное содержание, когда 80% данных имели относительно узкий диапазон значений, было обнаружено для 16:0, 18:0, 18:1n-9, 18:1n-7 и 20:5n-3 (Таблица 3.16). Большинство из этих ЖК служат структурными компонентами фосфолипидов мембран. Диапазон значений этих ЖК, возможно, является характерным для ракообразных в целом и для гаммарид в частности. Мы предполагаем, что процентное содержание данных ЖК в любой процветающей популяции G. lacustris будет находиться в установленном диапазоне значений. Напротив, наибольшая вариабельность процентного содержания была характерна для ai17:0, 16:2n-4, 16:3n-4, 18:4n-3, 20:4n-3 и 22:5n-6 (Таблица 3.16). Среди данных ЖК присутствуют маркеры бактерий, водорослей и две длинноцепочечные ЖК (20:4n-3 и 22:5n-6), источником которых, вероятно, была пища животного происхождения. Однако собственный синтез данных длинноцепочечных ЖК из предшественников также теоретически возможен. В отличие от стабильных ЖК, ЖК с высокой вариабельностью, в основном, расходуются на энергетические потребности организма (например, Leonard et al., 2004). Высокая вариабельность ЖК-пищевых маркеров подтверждает результаты, полученные в других статистических анализах, а именно, различия процентного содержания исследуемых популяций гаммарусов, в первую очередь, обусловлены различиями в их спектрах питания.
Гаммариды считаются консументами первого порядка, основным источником пищи которых являются одноклеточные водоросли (Platvoet et al., 2006; Biandolino, Prato, 2006; Mirzajani et al., 2011; Michel et al., 2015). Действительно, согласно ЖК маркерам, исследованные популяции G. lacustris, в основном, питались водорослями. Кроме того, значительную часть рациона гаммарид может составлять листовой опад, однако, это мнение вызывает сомнения и нуждается в проверке (MacNeil et al., 1999). Тем не менее нами было обнаружено присутствие аллохтонной органики в питании популяции из оз. Собачье, но не растительного, а животного происхождения. При изучении водных трофических цепей 18:2n-6 и 20:4n-6 используются как индикаторы пищи наземного происхождения (Gladyshev et al., 2016б). Наземные насекомые и другие наземные беспозвоночные, как правило, содержат значительные количества арахидоновой кислоты (van Dooremalen et al., 2009; Fontaneto et al., 2011). Высокое содержание этой ЖК было обнаружено в гаммарусах из холодноводного, низкоминерализованного, олиготрофного оз. Собачье. Дополнительно, эти гаммариды характеризовались относительно высоким содержанием 18:2n-6 и низким содержанием маркеров водорослей и бактерий (Таблица 3.14). Вероятно, мелкие наземные насекомые входили в состав рациона популяции гаммарусов из оз. Собачье. Действительно, хищничество и каннибализм являются распространёнными стратегиями питания разноногих раков (MacNeil et al., 1999; MacNeil, Platvoet, 2005; Biandolino, Prato, 2006).
Признаки пищи животного происхождения были обнаружены и в других популяциях исследуемых гаммарид. Во время отбора проб гаммарусов из оз. Шира в кишечниках животных были обнаружены остатки копепод (Arctodiaptomus salinus) (Dubovskaya et al., 2018). Каляноидные копеподы, а именно A. salinus доминируют в зоопланктоне озёр Шира и Шунет (Tolomeyev et al., 2010). Для этого вида из обоих озёр было характерно высокое содержание ДГК, достигающее 17% (Tolomeyev et al., 2010). В то же время, сестон и седименты из оз. Шира были бедны ДГК (Makhutova et al., 2003), а среди фитопланктона озёр Шира и Шунет доминировали группы, не синтезирующие ДГК (Таблица 3.13). Напротив, гаммарусы из этих двух озер имели самое высокое процентное содержание ДГК, по сравнению с другими популяциями (Таблица 3.14). В экспериментальных исследованиях спектров питания G. lacustris из оз. Шира было обнаружено, что гаммариды потребляют коловраток (Brachionus plicatilis) и копепод A. salinus (Yemelyanova et al., 2002). Таким образом, очевидно, что популяции G. lacustris из озёр Шира и Шунет получали ДГК, в основном потребляя копепод A. salinus.
Ещё одной причиной высокого содержания ДГК в популяциях гаммарусов из двух высокоминерализованных озёр могла быть адаптация беспозвоночных к высокой солёности. Некоторые ПНЖК, включая ДГК, могут играть важную роль в адаптации организмов к изменению солёности. Известно, что увеличение солёности воды влияет на активность ферментов, участвующих в синтезе ПНЖК, приводя к увеличению соотношений ЭПК/ДГК и ПНЖК/НЖК в морских рыбах и в беспозвоночных (Guermazi et al., 2008; Фокина и др., 2010; Tolomeev et al., 2010; Sarker et al., 2011; Fonseca-Madriqal et al., 2012; Dantagnan et al., 2013). Несмотря на высокое содержание ДГК в популяциях из высокоминерализованных озёр Шира и Шунет, оно достоверно не отличалось от такового в гаммарусах из пресноводного оз. Матарак. Таким образом, мы полагаем, что высокое содержание ДГК в популяциях из озёр Шира и Шунет связано не с высокой минерализацией этих озёр, а со спектром питания гаммарид.
Печень сельскохозяйственных животных как источник физиологически ценных n-3 ПНЖК
Итак, основным источником n-3 ПНЖК (ЭПК и ДГК) для человека, безусловно, является дикая рыба (Robert, 2006; Gladyshev et al., 2013; FAO, 2016). Однако, мировой вылов рыбы достиг своих пределов и не может быть увеличен без катастрофических последствий (Pauly et al., 2002; FAO, 2016), в то время как население Земли продолжает расти и уже сейчас испытывает дефицит ЭПК и ДГК в пище (Gladyshev et al., 2009; Gregory et al., 2013). В настоящее время идёт активный поиск альтернативных источников ЭПК и ДГК для человека (Gregory et al., 2013; Napier et al., 2015). Сюда можно отнести разработки в области культивирования микроорганизмов, богатых ЭПК и ДГК (Sijtsma, de Swaaf, 2004; Ward, Singh, 2005; Rubio-Rodriguez et al., 2010; Peltomaa et al., 2018); получение трансгенных масленичных культур растений, например, Camelina sativa, способных синтезировать в значительных количествах ЭПК и ДГК (Ruiz-Lopez et al., 2012, 2014; Napier et al., 2015; Betancor et al., 2015; Hixson et al., 2017). Напротив, рыбу, выращенную в аквакультуре, нельзя рассматривать в качестве альтернативного источника ЭПК и ДГК для человека, поскольку для её нормального роста и развития требуется пища, богатая n-3 ПНЖК, получаемая всё ещё из дикой рыбы (Sijtsma, de Swaaf, 2004; Robert, 2006). По той же причине обогащение мясной продукции физиологически ценными ПНЖК путём добавления продуктов, богатых ЭПК и ДГК, в пищу животных (Rose, Holub, 2006) нельзя рассматривать как альтернативу дикой рыбе.
Тем не менее, одним из альтернативных источников ЭПК и ДГК для человека могут служить дикие (например, олени, птицы) и сельскохозяйственные животные (Woods, Fearon, 2009; Gregory et al., 2013). Травоядные животные способны синтезировать ЭПК и ДГК из незаменимой 18:3n-3, получаемой из пищи (из зелёной части растений) (Stark et al., 2008; Wood et al., 2008; Kang et al., 2010; Kouba, Mourot, 2011). Однако у жвачных животных значительная часть потреблённой 18:3n-3 подвергается гидрогенизации бактериями, обитающими в рубце желудка. В результате из ненасыщенных ЖК образуются насыщенные. В отличие от жвачных рацион большинства остальных сельскохозяйственных животных (свиней, кур) не богат -линоленовой кислотой (Wood et al., 2008). В целом содержание ЭПК и ДГК в мясе сельскохозяйственных животных существенно ниже, чем в рыбе (Gladyshev et al., 2013). Однако, синтез ЭПК и ДГК из 18:3n-3, главным образом, осуществляется не в мышечной ткани, а в печени (Kang et al., 2010; Gregory et al., 2013; Costa et al., 2014). Действительно, процентное содержание ПНЖК в печени достоверно выше, чем в мышечной ткани у свиней (Ensera et al., 2000; Estevez et al., 2004; Mitchaothai et al., 2007), крупного рогатого скота (Herdmann et al., 2010) и кур (Schreiner et al., 2005; Aziza et al., 2005; Poureslami et al., 2010; Tres et al., 2013; Gonzalez-Ortiz et al., 2013). Хотя информация о процентном содержании ЖК не позволяет оценить пищевую ценность продукта в отношении этих ЖК, большинство имеющихся в литературе данных приведены именно в виде процентов. Для оценки пищевой ценности необходимо рассчитывать отношение массы отдельных ЖК к массе исследуемого продукта (Gladyshev et al., 2007; 2017, 2018; Woods, Fearon, 2009).
Поскольку печень сельскохозяйственных животных широко используется в пищу и потенциально может являться ценным источником ЭПК и ДГК в питании человека, представляется целесообразным количественное измерение вклада данного продукта питания в общее потребление ЭПК и ДГК человеком. Печень потребляется, в основном, в термически обработанном виде, поэтому второй важной задачей представляется оценка влияния кулинарной обработки на количественное содержание ЭПК и ДГК в готовом продукте. ПНЖК легко поддаются окислению при действии высоких температур (Estevez et al., 2007; Ruiz-Rodriguez et al., 2008), хотя на некоторых продуктах было продемонстрировано отсутствие снижения количества ПНЖК после их кулинарной обработки (Gladyshev et al., 2006; Gladyshev et al., 2007; Haak et al., 2007; Kouba, Mourot, 2011; Gladyshev et al., 2014).
Кроме того, целью данной работы был расчёт глобальной продукции ЭПК и ДГК в печени самых распространённых сельскохозяйственных животных (кур, свиней и коров), которая может являться альтернативой рыбе или дополнительным источником n-3 ПНЖК в питании человека.
Был исследован ЖК состав и содержание (мг/г сырого веса) куриной, свиной и говяжьей печени в сыром виде и в готовом продукте, приготовленном двумя самыми популярными способами кулинарной обработки печени: печень тушёная в соусе и печёночный паштет.
В печени всех исследованных животных доминировали 16:0, 18:0 и 18:1n-9 (Таблица 6.5). При этом, в говяжьей и свиной печени процентное содержание 18:0 существенно превышало содержание 16:0, а в куриной печени, наоборот. В отличие от куриной печени, в приготовленной говяжьей и свиной печени наблюдалось увеличение процентного содержания 18:1n-9 по сравнению с сырой печенью (Таблица 6.5). В печени всех животных 20-27% всех ЖК составляли ПНЖК семейства n-6, среди которых доминировали 18:2n-6 и 20:4n-6. При этом в говяжьей печени процентное содержание этих двух ЖК было практически равным, в свиной печени содержание 20:4n-6 превышало содержание 18:2n-6, а в куриной печени, наоборот, содержание 18:2n-6 превышало содержание 20:4n-6 (Таблица 6.5). ПНЖК семейства n-3 составляли от 1.8% до 12% от всех ЖК, с доминированием 20:5n-3, 22:5n-3 и 22:6n-3 (Таблица 6.5). Наибольший процент n-3 ПНЖК был обнаружен в говяжьей печени. Однако при кулинарной обработке их процент снижался почти в 2 раза. Наименьшее содержание n-3 ПНЖК было обнаружено в куриной печени (1.8-2.5%), при этом физиологически ценная ЭПК полностью отсутствовала (Таблица 6.5). В отличие от куриной печени, в говяжьей и свиной печени было обнаружено высокое содержание 22:5n-3, процент которой был сопоставим с суммарным содержанием всех остальных n-3 ПНЖК (Таблица 6.5). Среднее абсолютное содержание ЭПК+ДГК в сырой говяжьей и свиной печени было достоверно ниже, чем в кулинарно-обработанной печени (Рисунок 6.3). Напротив, в куриной печени не было обнаружено достоверных различий в среднем абсолютном содержании ЭПК+ДГК между сырой и кулинарно-обработанной печенью (Рисунок 6.3). Среди кулинарно-обработанной печени самые высокое среднее абсолютное содержание ЭПК+ДГК было обнаружено в говяжьей печени, а самое низкое - в куриной печени (Рисунок 6.3). Соотношение суммы ПНЖК семейства n-6 и семейства n-3 было самым низким в говяжьей печени и самым высоким в куриной печени (Рисунок 6.3). На основании полученных значений абсолютного содержания ЭПК+ДГК в говяжьей, свиной и куриной печени и литературных данных по продукции сельскохозяйственных животных и доли печени от массы животных нами была рассчитана продукция ЭПК+ДГК в печени исследованных сельскохозяйственных животных (Таблица 6.6). Среди исследованных животных глобальная продукция печени свиней самая большая (Таблица 6.6). Однако, доля печени от массы животных у кур в 1.6 и 2.5 раз выше, чем у свиней и коров, соответственно (Таблица 6.6). В результате, среди исследованных сельскохозяйственных животных глобальная продукция куриной печени, и, как следствие, глобальная продукция ЭПК+ДГК в куриной печени была самая большая. Суммарная продукция ЭПК+ДГК в печени исследованных сельскохозяйственных животных составила 3.91 млн кг/год.