Межфазные потенциалы, возникающие при фотосенсибилизированных окислительных реакциях на поверхности БЛМ Соколенко Елена Александровна

Содержание к диссертации

Введение

Обзор литературы 6

1. Основы фотодинамического воздействия. Классические фотосенсибилизаторы 6

1.1 Фотодинамическое воздействие сенсибилизаторов на клеточную мембрану. 6

1.2 Применение фотосенсибилизаторов в медицине. Основы метода фотодинамической терапии . 10

1.3 Использование фталоцианинов при ФДВ. 14

2. Активные кислород-содержащие соединения - образование и биологическое действие в клетке 16

2.1 Кислород в живой клетке. 16

2.2 Активные формы кислорода. 20

3. Патология зрительного цикла родопсина 24

3.1 Общие сведения о возрастной патологии зрительного цикла. Роль А2Е. 24

3.2 Влияние встраивания А2Е на стабильность мембраны. 31

3.3 Фотохимические свойства А2Е. 33

4. Липидные бислои и граничные потенциалы 37

4.1. Бислоиная липидная мембрана как модель клеточной мембраны. 37

4.2 Методы измерения граничных потенциалов липидных бислоев. 41

4.3 Дипольные модификаторы. 54

4.4 Использование БЛМ для моделирования фотодинамических реакций. 57

Постановка задачи 60

Материалы и методы 62

1. Формирование мембран. 62

2. Экспериментальная установка, используемая в методе КВП. 64

3. Установка, используемая в электрокинетическом методе. 65

Результаты исследования и их обсуждение 67

1. Изучение взаимодействия побочного продукта зрительного цикла родопсина А2Е с БЛМ. 67

1.1 Изучение встраивания А2Е в липидные мембраны. 67

1.1.1 Оценка площади, занимаемой молекулами Л2Е в лшшдном бислое, по данным электрокинетических измерений в суспензии липосом 67

1.1.2 Оценка степени погружения заряженной группы в липидный матрикс. 69

1.2. Изучение Фотоэффектов в системе БЛМ/А2Е, БЛМ/эпокси-А2Е. 70

1.2.1 Кинетика адсорбции А2Е на БЛМ, и фотоиндуцированное изменение граничного потенциала. 70

1.2.2 Влияние тушителей синглетного кислорода (NaN3) и антиоксиданте в (Butylated hydroxy toluene). 76

2. Изучение механизма адсорбции металлофталоцианинов на БЛМ. 78

2.1 Влияние атома металла фталоцианина на его адсорбцию на БЛМ. 78

2.2 Влияние ионной силы раствора. 82

2.3 Влияние числа сульфогрупп в молекуле фталоцианина. 85

3. Фотодинамическое окисление флорицина и транспорт синглетного кислорода через мембрану. 87

3.1. Оценка проницаемости БЛМ для синглетного кислорода по асимметрии реакции окисления флорицина на противоположных границах мембраны 87

3.2. Латеральный обмен флорицина и продуктов его окисления между бислоем и тором. 94

Заключение 101

Выводы 103

• Применение фотосенсибилизаторов в медицине. Основы метода фотодинамической терапии
• Влияние встраивания А2Е на стабильность мембраны.
• Использование БЛМ для моделирования фотодинамических реакций.
• Изучение Фотоэффектов в системе БЛМ/А2Е, БЛМ/эпокси-А2Е.

Введение к работе

Окисление жизненно важных молекул в мембране активными формами кислорода, образующимися при фотовозбуждении фотосенсибилизаторов (ФС), лежит в основе метода фотодинамической терапии раковых заболеваний. По схожему механизму происходит деградация мембранных структур зрительной системы продуктами, образованными в результате метаболизма зрительного родопсина [53]. Наибольшее значение в этих процессах имеет синглетный кислород, первичной мишенью которого в клетках являются мембранные белки и липиды [35]. Несмотря на интенсивные исследования, которые проводятся в течение ряда лет, многие аспекты, касающиеся фотодинамического окисления компонентов мембраны активными формами кислорода, образующимися в присутствии ФС, остаются неизученными. В частности, недостаточно изучено связывание мембраны с ФС, а также проницаемость мембраны для кислорода и его короткоживущих активных форм: синглетного и супероксидного радикалов. Изучение механизмов фотодинамических реакций на уровне организмов или отдельных клеток затруднено из-за сложности их строения. Поэтому представляется целесообразным проводить исследования на искусственных модельных системах, наиболее изученной из которых является БЛМ. В течение ряда лет на БЛМ проводились исследования, в которых исследовались фотодинамические реакции разрушения встроенных в мембрану молекул - мишеней активными формами кислорода (АФК), образующимися при освещении БЛМ с ФС. При этом использовались мишени, которые создают индуцированную проводимость БЛМ. Разрушение таких мишеней регистрировалось с помощью электрических измерений по уменьшению проводимости БЛМ при освещении в присутствии фотосенсибизаторов.

Настоящая работа посвящена изучению взаимодействия ФС с мембранами, а также фотодинамических окислительных реакций на поверхности мемраны. В ней применены электрохимические методы, позволяющие измерять межфазные скачки потенциалов на границе мембраны с водой. Применение этих методов, а также накопленная в течение многих лет методика исследования адсорбции заряженных и дипольных молекул на поверхности БЛМ, позволили изучить механизмы связывания ФС с БЛМ, а также фотодинамических окислительных реакций, в частности, сделать оценку проницаемости БЛМ для синглетного кислорода.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Основы фотодинамического воздействия. Классические фотосенсибилизаторы.

1.1 Фотодинамическое воздействие сенсибилизаторов на клеточную мембрану.

Интерес к изучению действия света на биологические объекты постепенно возрастал с момента открытия ультрафиолетового и инфракрасного излучения на заре 19 века. А в начале 20 столетия зародилась концепция теории клеточной гибели в результате общего действия света и химических соединений. Пионерами в этой области фотобиологии можно считать Рааба (O.Raab), и его научного руководителя профессора Таппайнера (H.Von Tappeiner). Рааб в своих исследованиях обнаружил, что окрашенные акридином, эозином и другими красителями клетки парамеции гибнут при освещении. Опыты Рааба положили начало серии дальнейших исследований в этой области, преимущественно Таппайнера и Иодбауера которые в своей книге за 1907 [137] впервые назвали обнаруженное явление «фотодинамическим воздействием», желая этим термином подчеркнуть отличие обнаруженного явления от фотосенсибилизации в фотографии. Было показано, что фотодинамически активные красители интенсивно флуоресцируют, а спектр действия фотодинамического эффекта соответствует спектру поглощения красителя. После того как было предположено, что в основе фотоокисления органических соединений и фотоповреждения клеток лежит один и тот же процесс - фотосенсибилизированное окисление кислородом, термин «фотодинамическое воздействие» стали применять для обозначения фотосенсибилизированных реакций окисления органических соединений кислородом в биологических системах и в растворах [35].

По характеру первичного процесса все фотохимические реакции при ФДВ делятся на два типа [42]: реакции типа 1, первичной стадией которых служит образование свободных радикалов фотосенсибилизаторов, и реакции типа 2, в которых первичным является взаимодействие возбужденных молекул ФС с кислородом, приводящее к генерации молекулярного кислорода в первом синглетном возбужденном состоянии, (так называемого синглетного кислорода 0₂).

Фотореакции типа 1 и 2 различаются вкладом синглетного кислорода в эти

фотопроцессы. Действительно, в фотореакциях типа 1 синглетный кислород возникает во вторичных процессах и эффективность его образования невелика. Реакции типа 2, наоборот, определяются преимущественно активностью ^xQi-

Соответственно этой классификации ФС также делятся на фотосенсибилизаторы 1 и 2 типов. В зависимости от типа фотосенсибилизатора основной мишенью ФДВ могут являться ДНК, митохондрии, лизосомы, цитоплазматическая мембрана.

Липофильные ФС локализуются в основном в мембранных структурах (включая плазматические, митохондриальные, эндоплазматические и ядерные мембраны) [47]. Так, было показано, что гематопорфирин проникает в клетку путем диффузии и локализуется в митохондриях [47], в то время как гидрофильные сенсибилизаторы проникают в клетку посредством эндоцитоза и локализуются в лизосомах [108].

Большинство исследователей считают, что основным цитотоксическим продуктом, образующимся в результате фотосенсибилизированных реакций, является синглетный кислород (^!0₂), который и приводит в конечном итоге к гибели клетки [35, 124]. Однако в литературе имеются данные о том, что оба типа фотохимических реакций при ФДВ могут наблюдаться одновременно. Выявление вклада '(Зг в реальный фотодеструктивный процесс существенно упрощает задачу исследования его молекулярного механизма. В работе [45] было показано, что если при низких концентрациях гематопорфирипа лизис липосом происходит из-за генерации сингл етного кислорода, то при высоких концентрациях лизис липосом наблюдался и в отсутствие кислорода.

Эффективность фотоповреждения посредством реакции фотосенсибилизированного окисления 2-го типа должна быть больше, когда ФС находится в мембране, либо на границе раздела водный раствор - липид, так как концентрация молекулярного кислорода в мембране и время жизни синглетного кислорода в липидах больше (~30 мкс), чем в водном растворе (~3 мкс) [35]. Появляется все больше данных о том, что одной из основных причин гибели клетки при ФДВ является повреждение ее плазматической мембраны [106]. Мишенью ФДВ могут быть как липиды, так и белки, входящие в состав мембраны. Фотомодификацию липидов обычно связывают с перекисным окислением остатков ненасыщенных жирных кислот и стеролов с различным числом двойных связей [44], а фотомодификация белков, вероятно, связана с образованием сшивок, либо с окислением некоторых аминокислотных остатков, играющих важную роль в функционировании

мембранных белков [139].

Фотомодификация мембран приводит к изменению их основных свойств. Наблюдаемые изменения можно разделить на: 1) изменение барьерной функции, 2) подавление активности мембранных ферментов, 3) нарушение специфических транспортных процессов, 4) изменение уровня возбудимости, 5) уменьшение способности к деформациям [139]. Рассмотрим подробнее некоторые из них.

1.1.1 Увеличение пассивного транспорта через мембрану при ФДВ.

Одна из основных функций плазматической мембраны - служить барьером для проникновения нейтральных молекул и ионов между разделяемыми ею растворами. В результате фотомодификации проницаемость мембраны меняется. При этом гибель клетки может быть связана не только с образованием пор в мембране и проникновением больших молекул, но и с увеличением проницаемости для малых электролитов, таких как ионы натрия, калия, хлора. Это ведет к уменьшению электрохимических градиентов, а следствием осмотического и ионного равновесия является лизис клетки. Так, в работе [99] перед наступлением гемолиза фотомодифицированных клеток крови была зарегистрирована утечка калия. В работе [143] было показано, что в везикулах саркоплазматического ретикулума фотомодификация вызывает увеличение пассивного тока кальция.

Изменение проницаемости мембран при ФДВ было продемонстрировано на искусственных мембранах. В работе [85] исследовалось фотосенсибилизированное повреждение БЛМ, сформированной из липидов с двойными связями в обеих углеводородных цепях, где в качестве ФС применялся гематопорфирин (ГП). В течение некоторого индукционного периода проводимость мембраны при освещении не изменялась, а затем начинался быстрый рост проводимости, заканчивавшийся разрывом мембраны. В случае липидов с двойными связями в одной углеводородной цепи освещение БЛМ в присутствии ГП приводило только к росту проводимости. Результаты позволили авторам [85] предположить, что двойные связи в жирнокислотных остатках липидов являются мишенью при фотодинамическом повреждении модельных мембран. Разрушение мембран при ФДВ гематопорфирина наблюдали также на липосомах [140].

1.1.2 Нарушение специфических транспортных процессов.

Многие авторы отмечают [139], что под действием фотомодификаций происходят

изменения специфических транспортных процессов, предшествующие существенному увеличению тока утечки. Специфические транспортные функции мембраны осуществляют транспортные белки. Некоторые из них, вероятно, содержат существенный для функционирования участок, чувствительный к фотодинамическому повреждению. В работе [91] было показано, что транспортные системы Rb и К⁺, опосредованные переносчиками, в фибробластах мыши линии L929 более чувствительны к ФДВ, чем липидная часть мембраны, определяющая барьерную функцию. В работе [91] был обнаружен эффект фотодинамического воздействия толуидинового синего на транспорт аминокислот и Сахаров в клетках дрожжей. Авторы считают, что уменьшение транспорта связано с повреждением транспортного белка. 1.13 Повреждение ионных каналов при ФДВ.

В основе важнейшего механизма ионного транспорта лежит функционирование образованных белками ионных каналов. В ряде работ исследовалось влияние ФДВ [31, 98], действие ультрафиолетового света [133] и у - излучения [60] на ионные каналы биологических мембран. Еще в 1968 году было показано подавление интегральной Na⁺ проводимости в гигантских аксонах кальмара при ФДВ [98]. В этих экспериментах в качестве фотосенсибилизатора использовали эозин Y. Подобные результаты были получены также с бенгальским розовым и флуоресцеином [100]. После отмывки среды от. красителя блокированные токи вновь активировались. Авторы этих работ считали, что инактивация токов связана с воздействием генерируемого синглетного кислорода на каналы, т.е. с участием реакций 2-го типа. В работе [131] проведено подробное исследование фотомодификаций Na⁺ токов в гигантском аксоне кальмара в присутствии метиленового синего. Было предложено два объяснения тому, что происходит с каналами при ФДВ: 1) уменьшается число каналов (так, что остается приблизительно равное количество проводящих и закрытых каналов, причем последние продолжают создавать воротные токи); 2) уменьшается проводимость одиночного канала у всех, либо у части каналов. Авторы пришли к заключению о том, что определенные выводы о механизме явлений можно сделать только на основании измерений ФДВ на проводимость одиночных каналов.

Инактивация ионных каналов наблюдалась и на других объектах. В работе [31] было показано подавление интегрального тока К⁺, опосредованного природными К⁺ каналами Т

лимфоцитов, при воздействии света в присутствии бенгальского розового. Авторы предполагают, что при ФДВ уменьшается число открытых каналов. Тарр и соавторы [138] изучали подавление К⁺ тока клеток сердца под действием непродолжительного освещения в присутствии бенгальского розового. Инактивация калиевого тока наблюдалась на протяжении десятков секунд после окончания освещения. Такая медленная кинетика, по мнению авторов, связана с обращением канала в закрытое состояние.

Наиболее информативным для выяснения механизма ФДВ на каналы оказалось изучение этого процесса на уровне одиночных каналов. Такие работы стали появляться в литературе в последние годы. Так, в работе [49] наблюдали инактивацию Са каналов, выделенных из саркоплазматического ретикулума и встроенных в БЛМ. Авторы заключили, что ФДВ приводит к изменению структуры и функций канала. Активные формы кислорода повреждают канальный белок, вероятно, нарушая контроль за открыванием канала, вследствие чего число открытых каналов в процессе освещения постепенно уменьшается. Каналы, по мнению многих авторов [30, 58], более чувствительны к ФДВ, чем липиды мембран. В работе [58] предполагается, что это объясняется фотомодификацией чувствительных аминокислотных остатков канального белка.

Вопрос о молекулах - мишенях в биологических мембранах до сих пор остается открытым: по одним данным, при фотодинамическом воздействии повреждаются мембранные белки [100], по другим - липиды [99]. Строго говоря, нет сомнений в. принципиальной возможности фотосенсибилизированного повреждения как белков, так и липидов. Оба эти процесса наблюдались in vitro, поэтому исследование механизма каждого из них имеет самостоятельное значение.

1.2 Применение фотосенсибилизаторов в медицине. Основы метода фотодинамической терапии.

В конце семидесятых - начале восьмидесятых годов на основе ФДВ был предложен новый метод в онкологии - фотодинамическая терапия (ФДТ) рака. Метод фотодинамической терапии рака основан на способности фотосенсибилизаторов, выборочно накапливаться в клетках опухоли и инициировать их разрушение при освещении видимым светом [64].

История метода берет начало с опытов Хаусмана 1911 г., коюрый выделил из крови

гематопорфирин и установил, что в его присутствии при освещении происходит повреждение тканей. Впервые действие гематопорфирина на человеческий организм испытал в сенсационном эксперименте на себе самом F.Meyer-Betz [73]. 14 октября 1912 г. он ввел себе внутривенно 0,2 г гематопорфирина и продемонстрировал солнечную фоточувствительность в виде отека и гиперпигментации, которые продолжались в течение 2 месяцев (рис.1). Последующие исследования подтвердили, что системное применение гематопорфирина вызывает интенсивную фотосенсибилизацию различных тканей, в том числе кожи.

Рис. 1. Фотография, иллюстрирующая эксперимент Майера-Бетца (пояснение в тексте).

Поликард обнаружил, что в опухолях, как у животных, так и у человека могут накапливаться эндогенные порфирины [65]. Но только недавно эти два факта стали рассматриваться вместе и использоваться для диагностики опухолей (опухоль обнаруживают по флуоресценции порфирина, предварительно введенного в организм [65]) и терапии рака [28, 78].

Диагностическое значение основанной на использовании гематопорфирина флюоресценции неопластических тканей подчеркнул A.Policard в 1924 г. [97]. Он предположил, что красная флюоресценция, вызываемая ультрафиолетовым светом на экспериментальных саркомах крыс, обусловлена накоплением эндогенного гематопорфирина вследствие вторичного инфицирования гемолитическими бактериями.

В исследованиях с крысами было показано, что красную флюоресценцию неопластической ткани можно усилить путем введения экзогенного гематопорфирина [10]. Стало очевидным, что накопление гематопорфирина опухолями в большей концентрации, чем нормальными тканями, указывает на возможность нового диагностического и лечебного применения сенсибилизаторов при раке. В 1948 г. F.HJ.Figge с соавторами [39] продемонстрировал повышенное сродство (т.е. свойство поглощать, накапливать) к

порфирину таких тканей с высокой пролиферативной активностью, как неопластическая, эмбриональная и регенеративная. Авторы доказали это на модели экспериментальных животных и высказали мнение о возможности ФДТ рака с использованием порфиринов.

За прошлые годы несколько тысяч пациентов были подвергнуты ФДТ. Суть этого метода состоит в том, что порфирин вводят пациенту в кровь (если это водорастворимое соединение - его водный раствор, если неводорастворимое - с помощью липосом [102]). Затем ткани, в которых накопился порфирин, облучают видимым светом, например, с помощью световых волокон. Оптимальное воздействие достигается при облучении светом с длиной волны больше 600 нм, т.к. в этой области лежит одна из полос спектра поглощения большинства порфиринов и проникающая способность излучения в ткань максимальна [132]. Клиническая плотность световой дозы составляет 20 - 120 Дж/см . В результате этих процедур происходит некроз опухолей [101, 103]. По ряду исследователей, ФДТ является единственно возможным методом лечения пациентов, которым не удалось помочь рентгено- и хемотерапией. Из побочных эффектов ФДТ пока обнаружен только один: повышенная чувствительность колеи к свету в течение месяца после инъекции порфирина.

На настоящий момент кроме порфирина в медицине используют широкий спектр фотосенсибилизаторов, относящихся к разным классам химических соединений.

В результате анализа большого объема экспериментальных и клинических материалов были сформулированы основные требования к оптимальному фотосенсибилизатору, включающие биологические (токсические и фармакокинетические), фотофизические и химико-технологические критерии. Прежде всего, это:

низкая темновая и световая токсичность в терапевтических дозах;

высокая селективность накопления в тканях злокачественных новообразований и быстрое выведение фотосенсибилизатора из кожи и эпителиальной ткани;

сильное поглощение в спектральном диапазоне, где биологические ткани имеют наибольшее пропускание (красный и ближний ИК диапазоны);

оптимум между величинами квантового выхода флюоресценции и квантового выхода интерконверсии, второй из которых определяет способность фотосенсибилизатора к генерации синглетного кислорода (в то же время, способность фотосенсибилизатора флюоресцировать обуславливает его диагностические возможности и облегчает контроль

накопления и выведения его из тканей);

высокий квантовый выход образования синглетного кислорода в условиях in vivo;

доступность получения или синтеза, однородный химический состав;

хорошая растворимость в воде или разрешенных для внутривенного введения жидкостях и кровезаменителях;

стабильность при световом воздействии и хранении.

Основное ограничение метода ФДТ - глубина действия лазерного излучения. Используемые в клинике препараты имеют спектр фотодинамического воздействия с максимумами в области 620 - 690 нм. Проницаемость биологических тканей в этом диапазоне незначительна и составляет несколько миллиметров. Известно, что максимальная проницаемость тканей находится в дальней красной и ближней ИК области 750 - 1500 нм и соответствующей диапазону генерации эффективных, надежно работающих и доступных лазеров. Создание и внедрение фотосенсибилизаторов, обеспечивающих эффективную генерацию синглетного кислорода в этой области спектра, могло бы существенно расширить сферу применения ФДТ.

В настоящее время проводится направленный поиск оптимальных фотосенсибилизаторов среди производных хлоринов, бактериохлоринов, пурпуринов, бензопорфиринов, тексафиринов, этиопурпуринов, нафтало- и фталоцианинов [85]. При этом особый интерес представляют фотосенсибилизаторы, обладающие способностью не только быстро накапливаться в опухолях, но и с высокой скоростью распадаться. Каждый из используемых сейчас в ФДТ фотосенсибилизаторов имеет свои преимущества и недостатки. Широко используемые в настоящее время производные гематопорфиринов имеют слабое поглощение в красной области спектра и, кроме того, обладают кожной токсичностью.

ФДТ как метод лечения находится на стадии становления. На сегодня имеется ряд показаний к ее применению в клинике. Десятки клиник мира используют лазерную ФДТ для лечения онкологических заболеваний. Клиническое применение этого метода показывает обнадеживающие результаты для большого числа опухолей [29, 89, 114]. Уникальные свойства ФДТ позволят однозначно определить место этого метода лечения в терапии рака. ФДТ в нынешнем виде представляет местнорегиональный вариант лечения, то есть воздействует на первичные и, вероятно, на местно-распространенные опухоли.

, Таким образом, ФДТ будет играть ведущую роль в избранных областях, подобно хирургии и радиотерапии сегодня. Целью применения такого лечения будет улучшение контроля над местными симптомами опухоли и снижение смертности по сравнению с хирургическим вмешательством и радиотерапией. При этом одной из'проблем ФДТ по-прежнему остается повышение селективности накопления фотосенсибилизатора в опухоли, так как следствием низкой селективности является невысокая эффективность лечения и повышенная чувствительность кожи к дневному свету.

В настоящее время рассматривается возможность применения ФДТ при инфекционных и неонкологических заболеваниях. Проблема инфекционных заболеваний остается одной из главных во многих областях медицины. Устойчивость возбудителей к антибиотикам и необходимость проведения системного лечения создают множество вторичных проблем (проблемы нефро-, гепато- и нейротоксичности). Одна из таких проблем - проблема системной токсичности антибактериальных препаратов. Она может быть рассмотрена с точки зрения "волшебной пули" [141], гипотетически представляющей антимикробное средство, целевым образом доставляемое, в очаг поражения и взаимодействующее только с возбудителем инфекционного заболевания, но не с тканями и клетками организма-хозяина. В данном контексте таким средством представляется ФДТ.

1.3 Использование фталоцианинов при ФДВ.

В течение последнего десятилетия проявляется широкий интерес к исследованию физико-химических свойств тетрапиррольных соединений, в частности, производных ряда хлорофилла и фталоцианины (Фц) для использования их в качестве фототерапевтических агентов. Фц обладают рядом преимуществ перед используемыми в настоящее время в ФДТ гематопорфиринами, а именно: химической стойкостью, более интенсивным поглощением (в 10-20 раз) в красной области спектра, меньшей токсичностью [129]. Кроме того, при синтезе тетрапирролов наблюдается тенденция к созданию соединений с заданными структурно-функциональными свойствами.

Одним из наиболее эффективных сенсибилизаторов из группы металло-Фц является АІФц. Показано, что квантовый выход генерации синглетного кислорода АІФц достигает 0.3,2пФц - 0.36, МФц -0.16 [54].

Среди фталоцианинов с различными заместителями особое место занимают

сульфопроизводные, способные растворяться в воде. Однако для водорастворимых металло-Фц характерны димеризация и олигомеризация с потерей фотохимической активности. Недавно было показано [144] , что тетрасульфированный А1Фц не агрегирует в воде, в то время как в спиртовых растворах наблюдается его димеризация. Авторы [144] предполагают, что по этой причине тетрасульфированное производное А1Фц является более фототоксичным для раковых клеток, чем Zi^n, несмотря на более высокий квантовый выход генерации синглетного кислорода последнего.

Интересным является выяснение типа реакции при ФДВ фталоцианинов. Известно, что азид натрия является эффективным тушителем синглетного кислорода. В работе [61] проводились исследования фотосенсибилизированного окисления триптофана А1Фц и его сульфированными производными. Образование окисленных форм триптофана уменьшалось на 90% в присутствии 15 мМ азида. Это говорит об эффективном образовании синглетного кислорода при ФДВ в присутствии А1Фц и 2-ом типе фотосенсибилизированного окисления. Большинство авторов [38, 124, 129] считают, что в процессе ФДВ фталоцианинов образуется синглетный кислород, который приводит к повреждению клеток.

2. Активные кислород-содержащие соединения - образование и биологическое , действие в клетке.

2.1 Кислород в живой клетке.

Известно, что окислительно-восстановительные процессы составляют основу жизнедеятельности клетки и организма, а кислород играет ключевую роль в энергетике дыхания нормальных аэробных клеток, являясь единственным акцептором электронов.

Основное количество молекулярного кислорода в клетке - 90-98% расходуется в реакциях тканевого дыхания и микросомального окисления, катализируемых оксидазами, например, митохондриальнои цитохромоксидазои, в результате чего в дыхательных цепях происходит запасание энергии и осуществляется четырехэлектронное восстановление 0₂ с образованием двух молекул воды:

0₂ + 4е^_+ 4Н-+ 2 Н₂0 (2.1)

Значительно реже под действием ферментов (оксигеназ) происходит включение одного из атомов кислорода в биоорганические молекулы:

0₂ + М+2Н-+МО + Н₂0 . (2.2)

Так, важную роль в окислении ненасыщенных липидов играют ферментные реакции, катализируемые липоксигеназами и циклооксигеназами - первыми ферментами на путях образования специфических регуляторов метаболизма - эйкозаноидов. Около 2% поглощаемого кислорода восстанавливается самопроизвольным, неферментативным путем. Эти реакции всегда начинаются с присоединения молекуле 0₂ одного электрона и образования аниона-радикала (содержащего неспаренный электрон) - супероксида О *₂:

0₂ + е" -> 0*₂ (2.3)

Донорами электронов в клетке служат Fe , Си , семихинон и другие промежуточные участники процессов тканевого дыхания. Кроме того, электроны могут генерироваться

вследствие ионизации воды и биоорганических молекул, под воздействием ионизирующей радиации, либо фотосенсибилизаторов под воздействием света.

В- основном состоянии молекулярный кислород парамагнитен - представляет собой триплет - «бирадикал», т.е.- имеет два неспаренных электрона (с параллельными спинами), на различных орбиталях [115]. По этой причине прямые, неферментативные реакции с кислородом могут осуществляться по свободнорадикальным механизмам. Большинство органических молекул синглетны (электроны с антипараллельными^ спинами), поэтому, вследствие различий с триплетным кислородом в направлении спинов, их реакции с молекулярным кислородом из-за спиновых запретов затруднены и протекают очень медленно. Кинетические барьеры одноэлектронного восстановления кислорода в клетке достаточно высоки, поэтому образование супероксида процесс медленный, однако он очень важен для формирования системы окислительно-восстановительного гомеостаза в клетке, т.к. О^т₂ участвует в генерации многих окислителей - активных кислородсодержащих соединений - АКСС (табл. 1).

Таблица 1. Активные кислородсодержащие соединения - АКСС,

играющие важную роль е жизни живой клетки.

Как видно из таблицы 1, к АКСС отнесены активные формы кислорода - АФК, активные соединения азота (АСА) и продукты перекисного окисления липидов.

Выступая в качестве сигнально-пусковых молекул, 0₂^т, а также Н₂0₂, ОН и NO' запускают каскад реакций поддержания окислительно-восстановительного гомеостаза в клетке.

В отличие от многих других биологически активных соединений, АКСС неспецифичны, т.к. вступают в реакции не со специально «предназначенными» к

ферментативному окислению субстратами дыхания, а непосредственно с любыми восстановленными веществами R-H (оксидазная модификация)- липидами, ДНК, белками, образуя гидропероксиды RjOOH. Схематично это можно представить в виде:

АКСС + R-H -> RjOOH (2.4)

Взаимодействуя с липидами (L), АФК и АСА способствуют алкоксил- и пероксил-радикалообразованию и активации тем самым самоускоряющихся цепных реакций перекисного окисления липидов - ПОЛ (пероксидация или перекисное окисление липидов). Главными субстратами ПОЛ в клетке являются полиненасыщенные жирные кислоты, а конечными продуктами - эпоксиды, кетоны, альдегиды.

Под влиянием АКСС - продуктов ПОЛ (11110Л) в интактной клетке образуются аддукты ДНК, обладающих потенциальным цитотоксическим, цитогенетическим и канцерогенным эффектами. Эти эффекты проявляются в зависимости от уровня накапливающихся АКСС, находящихся под многоплановым контролем антиокислительной системы в клетке. Оказывая цитогенетическое действие, АКСС способны вызывать клеточную гибель путем апоптоза и радиационно-индуцируемую нестабильность генома.

Из таблицы 1 видно, что большинство АКСС обладают относительно короткой продолжительностью жизни и находятся в низких стационарных концентрациях. Такое состояние их гомеостаза все же позволяет активным продуктам выполнять важные для нормальной клеточной жизнедеятельности физиологические функции.

Центральным звеном в поддержании в клетке окислительно-восстановительного равновесия является образование АФК.

2.2 Активные формы кислорода.

АФК постоянно образуются в живой клетке как продукты нормального метаболизма. К активным формам кислорода относятся свободные радикалы - супероксидный анион радикал (супероксид), гидроксид и гидропероксид (пергидроксид) - радикалы и нейтральные молекулы - пероксид водорода и синглетный кислород (табл. 1).

АФК обнаруживаются в клеточных органеллах. Главными местами их образования являются митохондриальная, ядерная, плазматическая и микросомальная мембраны у

животных, хлоропласты и хроматофоры у растений.

Неферментативное образование основных АФК и их превращения происходят по схеме, изображенной на рисунке 2 и в реакциях:

+ 0₂* + 2Н⁺ + Fe³⁺ ->[5J (2.5)

Образование АФК катализируют, например, ионы железа. АФК постоянно производятся при взаимодействии 0₂ с ФМН (FMN) или ФАД (FAD). Напротив, восстановление 0₂ цитохром с-оксидазой ничем не осложнено (протекает без накопления АФК), так как этот фермент не высвобождает промежуточные продукты в среду. Наряду с антиоксидантами имеются ферменты, которые также препятствуют образованию свободных АФК. Например, супероксид-дисмутаза вызывает диспропорционирование двух супероксид-радикалов на Ог и менее опасный Н₂Ог. Последний снова диспропорционируется на Ог и Н₂0 гемсодержащей каталазой.

Молекулярный кислород

О_г ч»

Изменение „ | се ответствия.

¹ процессов 1

Супероксид-радикал

Гидрокси-радикал

У^~ о-~-Л_

адикал > 0""С 1

Н⁺ V._^__V ЗН⁺

Супероксид дисмутаза

2 j Каталаза

Рис. 2 Схема, иллюстрирующая пути превращения молекулярного кислорода в АФК. Молекула кислорода (О г) содержит два неспаренных электрона и. таким образом, является бирадикалом. Однако неспаренные электроны расположены так, что молекула О2 остается относительно стабильной. Если молекула присоединяет дополнительный электрон (стадия А), образуется супероксид-анион радикал (Оі), который обладает высокой реакционной активностью. В результате восстановления (стадия Б) образуется пероксид-анион (О2'), который легко связывает протоны и вследствие этого преобразуется в пероксид водорода (НгОг). Присоединение третьего электрона (стадия В) ведет к расщеплению молекулы на ионы О ' и О'. Ион О і присоединяет два протона 2ІҐ, в результате чего образуется вода. Присоединение протона ПҐ к иону О' приводит к образованию гидроксил-радикала (НО'') по [56].

Синглетный кислород занимает особое место среди АФК. Это главный активный продукт фотоактивации как природных, так и синтетических фотосенсибилизаторов, и, следовательно, главный цитотоксичный агент как в ФДТ, так и в естественных патологических процессах фоторазрушения клеточных структур [81]. По этой причине его

концентрация относительно высока даже в норме в хлоропластах растений и в клетках зрительной рецепции животных. Поглощая квант света, пигмент-фотосенсибилизатор переходит в синглетное, а затем в триплетное возбужденные состояния. В обоих возбужденных состояниях молекулы пигмента взаимодействуют с молекулярным кислородом, передают ему свою энергию и превращают его в очень активный окислитель. Кроме фотохимических процессов, образование синглетного кислорода в клетке таюке может произойти при недостатке супероксиддисмутазы в присутствии металлов переменной валентности:

0"₂ + О^т₂ + 2Н⁺ + Fe³⁺-* Н₂0₂ + Fe²⁺ + ^l0_2t (2.6)

Биологическая роль АФК может осуществляться в жизненно необходимых реакциях иммунитета и воспаления: АФК способствуют образованию цитокинов и иммунных рецепторов, миграции лейкоцитов в «аварийные ткани», выполняют микробициднную функцию в фагоцитозе. Так, в макрофагах и нейтрофилах АФК реализуют процесс повреждения и разрушения макромолекул, вредных микроорганизмов, попавших в организм, а также старых, поврежденных и ставших генетически чужеродными клеток.

В конце ушедшего столетия получены данные о способности АФК выполнять сигнальную в клеточной регуляции [23, 69], что на данный мометнт является предметом широких исследований. Показано, что АФК стимулируют накопление цАМФ и цГМФ, ионов Са²⁺ в цитозоле, активацию протеинкиназ, протеинтирозинкиназ и подавление активности протеинфосфатаз. Помимо стимуляции- процессов фосфорилирования белков, АФК активируют и белок Ras, участвующий в передаче сигналов в ядро клетки.

Вопрос о биологической роли АФК находится также и в связи с инициированием ими биофизически значимых процессов в клетке - перекисного окисления липидов.

В настоящее время окончательно установлено, что АФК способны инициировать цепные реакции липопероксидации в норме, а их избыток - усиливать цепные процессы при физических и химических воздействиях.

3. Патология зрительного цикла родопсина.

3.1 Общие сведения о возрастной патологии зрительного цикла. Роль А2Е.

Гематопорфирин, нашедший широкое применение в фототерапии, в естественных условиях образуется в процессе метаболизма гемоглобина. И это не единственный пример продуктов эндогенеза, обладающих фотосенсибилизирующими свойствами. Так, в последнее время в медицинской патологии сетчатки глаза широко обсуждается роль некоторых хромофоров липофусциновых гранул, накапливающихся с возрастом в лизосомах пигментного эпителия сетчатки (RPE). На данный момент выделена и спектрально охарактеризована единственная группа пигментов RPE липофусцина, содержащая ІЧ-ретинил-ІЧ-ретиналидеготаноламин (А2Е), изо-А2Е и другие изомеры А2Е, представленные в меньшем количестве [13, 14] (рис. 3).

Эти хромофоры, являющиеся побочными продуктами зрительного цикла родопсина, поглощают свет в голубой области спектра и известны своими повреждающими свойствами на клетки. Механизм патогенного действия А2Е до конца не изучен, но, как предполагается, именно он занимает ключевую позицию в развитии возрастной дегенерации пигментного эпителия.

Рис. ЗА. Структура А2Е и добавочных А2Е-производных [13] (по [13]). Б. Структура А2Е и iso-A2E. Гидрофобные «руки»,берущие начало от полностъю-транс-ретиналь, наделяет А2Е аліфифильньгми свойствами. In vivo положительный заряд пиримидиновои части, по-видимому, хлорируется. Форма iso- А2Е, цис-алкена в положении С13-14, более выгодна, чем клинообразный А2Е. Изомеры А.2Е и iso-A2E находятся в соотношении 4:1.(по [126]).

Эксперименты in vitro показали, что А2Е в концентрации 25 мкМ вызывает гибель 50% клеток зрительного эпителия. Глаз человека старше 65 лет содержит этот пигмент в количестве, приблизительно соответствующем концентрации 15 мкМ. Согласно современным представлениям, токсичность А2Е обусловлена рядом свойств, основными из которых являются его амфифильность и фотоактивность. Благодаря амфифильности А2Е способен встраиваться в клеточные мембраны, нарушая их стабильность. Фотоактивность А2Е сводится к его способности генерировать на свету активные формы кислорода [94].

Как было описано [92, 94], А2Е и его изомеры являются побочными продуктами зрительного цикла родопсина. Родопсин - интегральный мембранный белок, локализованный в дисках наружного сегмента (специализированных замкнутых мембранах) фоторецепторной клетки и играющий ключевую роль в фоторецепции (рис. 4).

Рис. 4. Схематическое изображение палочки, фоторецепторного диска наружного сегмента, фоторецепторной мембраны диска и молекулы родопсина, по [53].

Помимо белковой части, опсина, молекула родопсина включает остаток \\-цис-ретиналя, связанный ковалентно с є-аминогруппой остатка лизина. Поглощение молекулой родопсина кванта света индуцирует изомеризацию \\-цис-ретиналя в полностью трансформу. В результате этой фотохимической реакции спустя 10 мс происходит аллостерический переход родопсина в его активную форму (родопсин*). Стимуляция родопсином* G-белка запускает каскад передачи сигнала, который побуждает зрительную клетку уменьшить выброс нейромедиатора (глутамата), вследствие чего биполярные нейроны, связанные со зрительными клетками, посылают импульс, что воспринимается как зрительное возбуждение (см. рис. 5).

Электронно-возбужденное _<2оо фс, цис-транс изомеризация ретиналя состояние

опсин + полностью-транс ретиналь

Родопсин (500 нм)

Фотородопсин (585 нм)

| 45 пс Батородопсин (543 нм)

| 170 не Люмиродопсин (497 нм)

І120 мкс Метародопсин la (478 нм)

I «мс Метародопсин їв (458 нм)

I 12 мс Метародопсин II (380 нм) минуты

Б.

Рис. 5. А. Упрощенная схема зрительного акта [56] Б. Последовательность фотоиндуцированных конформационных превращений родопсина после поглощения кванта света (по [53]).

На определенной стадии, происходит отсоединение ретиналя от родопсина. Ретиналь обладает высокой реакционной способностью и его высвобождение в ходе зрительного

цикла может приводить к образованию нежелательных соединений. В норме, ретиналь зрительного цикла связывается с АТФ-зависимым переносчиком RmP [74, 75], расположенным в ободках дисков наружного сегмента, который, как предполагают, пребрасывает его на цитоплазматическую сторону мембраны диска сегмента фоторецепторной клетки [41], где он доступен для ретинол-дегидрогеназ. Но, в патологических случаях, например, при нарушении работы RmP-гликопротеина, происходит накопление ретиналя, который может образовывать шиффово основание с соседней молекулой, содержащей аминогруппу. Ею может быть молекула фосфатидилэтаноламина - одного из основных липидов мембраны клетки (см. рис. 6). Полученное связанное шиффово основание (N-ретиналиден-РЕ, NRPE), может далее вступать в реакцию с другой молекулой ретиналя, в результате чего происходит образование амфифильного катиона бисретиналиденэтаноламина (А2Е) (см. рис. 6). Эта реакция возможна лишь при значительной концентрации ретиналя

А.

H-cf&mtfhat

ll«cfaMr«finof

immamm

11-cte-r$tittat

Папностью-транс-ретинапь 1 I Фосфатидилэтаноламин

N-ретинилиден-фосфатидилэтаноламин

>Ч^ОН

Полностью-транс-ретиналь

Бис-ретинилиден-этаноламин (А2Е)

Б.

Рис. 6. А. Генерация побочных продуктов в зрительном цикле. Биосинтез А2Е начинается в наружном сегменте фоторецептора, когда полностью-транс-ретиналь покидает зрительный цикл и реагирует с фосфатидилэтаноламином (в соотношении 2:1)( по [126]). Б.Биогенез А2Е из ретиналя и фосфатидилэтаноламина [127]. Полностью-транс-ретиналь, высвободившийся из молекулы опсина, связывается с присутствующим в большом количестве в мембране диска фосфатидилэтаноламином, образуя NRPE. Присоединение второй молекулы ретиналя приводит к образованию А2Е (образование А2-РЕ и его гидролиз не показаны).

В процессе нормального обновления фоторецепторгой клетки, кончик наружного сегмента палочки отламывается и фагоцитируется расположенными под ним РПЕ-клетками. А2Е не может быть ферментативно расщеплен, он накапливается с возрастом вместе с другими непереваренными частями фоторецепторных клеток в лизосомах ретинального эпителия, образуя гранулы грязно-желтого цвета, за что они получили название липофусцина (гр. lipos жир + лат. fuscus темный), или «пигмента старости» (см. рис. 7).

Рис. 7. Гранулы липофусцина в лизосоме RPE-клетки [54] (А) Аутофлуоресценция глазного дна при возбуждении мягким ультрафиолетом (82-летний пациент) (по [130])

(Б)

Наблюдения последних нескольких лет указывают на то, что RPE-липофусцин играет ключевую роль в этиологии атрофической возрастной дегенерации сетчатки (AMD) [27, 37, 50].

Накапливаясь с возрастом, флуорофор RPE липофусцин, при некой критической его концентрации вызывает деградацию сетчатки [26], дегенерации пигментного эпителия в юном возрасте, вызванной мутацией по обеим аллелям гена ABCR, кодирующем RmP/ABCR-протеина. Мутации в гене ABCR человека для RmP обусловливают болезнь Штаргардта (Stargardt's (STGD)), рецессивно наследуемую форму макулярной дегенерации. Предполагается, что изменения в гене ABCR ассоциированы с возрастной дегенерацией сетчатки (age-related macular degenerations (AMD)). В обоих случаях образуются отложения липофусциновых гранул в клетках RPE с последующей дегенерацией RPE и фоторецепторов.

Липофусцин в RPE-клетках также является источником «аутофлуоресценции» глазного дна (см. рис. 7, Б.) [9, 33]. Её регистрация с помощью конфокальной офтальмоскопии выявляет зоны, подверженные атрофии [18].

Как было сказано, на сегодняшний день не известен точный механизм взаимодействия А2Е и его изомеров с мембраной. Возможное действие А2Е на мембрану сводится к двум основным свойствам пигмента - амфифильная структура бисретиналиденэтаноламина, и его фотоактивность.

3.2 Влияние встраивания А2Е на стабильность мембраны.

Как известно, А2Е является амфифильным катионом. Его структура включает положительно заряженную пиридиновую головку и два гидрофобных ретиналевых хвоста (см. рис. 3, Б.). При этом гидрофобные ретиналевые группы встраиваются между углеводородными хвостами мембранных липидов. Об этом свидетельствует тот факт, что максимум флуоресценции А2Е, связанного с клетками, соответствует таковому в неполярных растворителях [128].

Молекула А2Е способна встраиваться в мембрану. Благодаря клиновидной структуре она может вызывать локальные изменения геометрии бислоя, что в свою очередь может повлиять на энергию спонтанно образующихся пор, а значит и на стабильность мембраны. Факт порообразования под действием А2Е был зафиксирован в опытах по увеличению проницаемости митохондрий для некоторых красителей и даже белковых молекул в присутствии А2Е [92].

Согласно теории порообразования, липидный бислой мембран представляет собой довольно жесткое структурное образование. Однако известно, что время жизни БЛМ ограничено и зависит от состава мембран и внешних условий. В природных мембранах также в ряде случаев возникают механические нарушения и дефекты, например, под действием некоторых продуктов метаболизма, таких, как А2Е.

Обычно нарушение стабильности мембран связывают с необратимыми изменениями их структуры. Наиболее признанным в настоящее время является механизм разрушения мембран, обусловленный дефектами типа сквозной поры. Предполагают, что формирование дефекта сопровождается переориентацией молекул липида, расположенных вблизи границы дефекта с образованием так называемой инвертированной поры.

В свете этой теории очевидно, что молекула А2Е, имеющая коническую форму, встраиваясь в липидный бислой, будет способствовать разрушению мембраны путем образования инвертированных пор. Возможно также, что адсорбция бисретиналиденэтаноламина только с одной стороны мембраны (при встраивании пигмента в один из монослоев), вызовет появление внутримембранного поля (до 100 мВ), которое будет способствовать образованию гидрофильных пор [135]. Кроме того, многие экспериментальные данные [25, 92] свидетельствуют о том, что патогенное действие А2Е может быть связано с его детергентным действием мембраны. Влияние детергентов на

стабильность мембраны может быть связано с изменением ее поверхностного натяжения [145]. О влиянии А2Е на геометрию мембран свидетельствует также наблюдение, что в а присутствии этого пигмента происходило образование пузырей (блеббинг) [126] (см. рис. 8).

Как было показано в некоторых работах, при развитии AMD RPE-клетки погибают в результате апоптоза. Апоптоз, как вид клеточной гибели, существует как физиологически необходимый процесс для поддержания тканевого развития и гомеостаза. Он играет решающую роль в физиологии таких болезней, как рак, синдром приобретенного иммунодефицита, аутоиммунных заболеваниях и тканевых деградациях [118]. При дестабилизации работы митохондрий, к примеру, во время окислительного стресса, они высвобождают апоптоз-индуцирующие белки. Один из них - цитохром С, который, находясь в цитоплазме, не всегда, но зачастую, активирует каспазы, апоптоз-специфичные протеазы. Другой белок - апоптоз-индуцирующий фактор (AIF), индуцирует ядерный апоптоз независимо от каспазной активности. Согласно современным представлениям, митохондрии функционируют как сенсоры клеточного стресса, приводящего к запуску системы апоптоза. Было показано [135], что липофильный катион тУ-ретинил-ІУ-ретиналиденэтаноламин (А2Е), компонент липофусциновых гранул, индуцирует апоптоз в культуре RPE и других клеток. Апоптозу сопутствует появление проапоптотического белка цитохрома С и апоптоз-индуцирующего фактора цитоплазмы и ядра.

Кроме того, многие экспериментальные данные [92, 127], свидетельствуют о том, что патогенное действие А2Е может быть связано с его детергентным действием мембраны. Клеточные мембраны в присутствии А2Е склонны также к образованию пузырей (блеббинг), что было показано в работе [126](см. рис. 8).

Рис. 8. Образование клеточными мембранами выпячиваний (блеб) при добавлении А2Е.

В клетки культуры ARPE-19 вводился ген зеленого флуоресцентного протеина (GFP). GFP в норме локализуется в цитоплазме клетки, заполняя мембранные «пузыри». А2Е добавлялся к культуре клеток в концентрациях 20 мкМ (А) и 100 мкМ (В, увеличено на С). Небольшие выпячивания, образовавшиеся при 100 мкМ пигмента — типичные мембранные блебы. По крайней мере на начальных этапах формирования блеб мембрана сохраняла свою непроницаемость (D), так что краситель (красное свечение) не окрашивал ядра клеток. В то же время ядро окрашивалось красителем DAPI (4',б-диамидино-2-фенилиндол) (F) (по [126]).

3.3 Фотохимические свойства А2Е.

Взаимодействие А2Е с клеточными структурами, таких, как мембраны, а также возможное участие во внутриклеточных процессах, не ограничивается лишь амфифильностью пигмента. К настоящему моменту опубликована масса работ, посвященных фототоксичности А2Е, результаты которых зачастую противоречивы.

Максимум поглощения пигмента А2Е, лежит в районе 430 нм (см. рис. 16).

Из литературных данных известно, что А2Е при освещении генерирует синглетный кислород, т.е. является фотосенсибилизатором [55, 125, 126]. Но как было показано [107], генерация под действием излучения синглетного кислорода бисретиналиденэтаноламином в 60 раз менее эффективна, чем его предшественником, транс-ретиналем.

Поглощая квант света, пигмент-фотосенсибилизатор (например, молекула А2Е) переходит в синглетное, а затем в триплетное возбужденные состояния. В обоих

возбужденных состояниях молекулы пигмента взаимодействуют с молекулярным кислородом, передают ему свою энергию и превращают его в очень активный окислитель. Известно, что возрастающий уровень ^хОг может быть причиной обновления «отработанных» субклеточных компонентов фоторецепторов, а также фотодинамического действия пигментов в клетках, не имеющих фоторецепторных систем. Как было показано в работе [19], под действием короткой вспышки лазера с длиной волны 350 нм в насыщенном аргоном метаноле, А2Е переходит в возбужденное состояние с максимумом поглощения 450 нм (см. рис. 13).

При добавлении 100 мкМ кислорода наблюдается бимолекулярная реакция тушения с константой 2,6*10⁹ л/моль*с. Однако спектры в ближнем инфракрасном диапазоне показали очень слабо различимые полосы поглощения производных А2Е, из которых нельзя сделать однозначного вывода о переносе энергии на радикал А2Е. С другой стороны, А2Е несет положительный заряд и может быть легко окислен в катионрадикал. Таким образом, сенсибилизация в присутствии антрацена ведет обычно к триплет-триплетному переносу энергии с появлением триплетного состояния А2Е. Прямое возбуждение А2Е в метаноле в отсутствие сенсибилизаторов ведет к еле заметным переходным состояниям, что делает сложным их идентификацию, даже если изучать продукт кислородного тушения возбужденного А2Е [19, 126].

Будучи сильным окислителем, синглетный кислород может участвовать в патологических нарушениях клеточных структур. Было показано [126, 135], что, облучение синим светом суспензию RPE-клеток, наполненных А2Е, приводит к индукции апоптоза последних, за счет нарушения стабильности митохондрий и высвобождения из них проапоптотического белка гщтохрома С .

Более того, синглетный кислород, образующийся в результате тушения возбужденного состояния А2Е, способен далее реагировать с самой молекулой пигмента по углерод-углеродным двойным связям ретиналевой группы, в результате чего образуются А2Е-эпоксиды (см. рис. 9) [126].

A2E S

I Свет 430 hm

Эпокси-А2Е *1

Рис.9. Генерация эпокси-форм А2Е.Освещение А2Е ведет к генерации синглетного кислорода, который в дальнейшем присоединяется по двойным углерод-углеродным связям, образуя эпоксиды. Фотоокисленныи пигмент представляет собой смесь эпоксидов с различным количеством присоединенных атомов кислорода [126].

От времени экспозиции бисретиналиденэтаноламина зависит количественный состав смеси эпокси-форм А2Е. Эпокси-формы значительно отличаются по своим спектральным и другим характеристикам от исходного А2Е (см. рис. 10).

Поскольку А2Е является слабым фотосенсибилизатором, возможно разрушение мембран вследствие окисления мембранных липидов синглетным кислородом Особенно подвержены действию активных форм кислорода мембраны, содержащие липиды с ненасыщенными углерод-углеродными связями, например диолеилфосфатидилхолин.

і 1 1 r 1 1 г

280 320 360 400 440 480 520 560 Wavetength/nm

Рис. 10. Спектры стабильных форм А2Е в метаноле после облучения светом 75-W ксеноновой лампы. Постоянное освещение А2Е, при использовании фильтра, в насыщенном воздухом метаноле ведет к уменьшению поглощения в максимумах поглощения (431 нм), сопровождающимся увеличением в 284 нм. При экспозиции раствора в течение 21 мин и при дальнейшем облучении с использованием фильтра, пропускавшего свет в диапазоне от 250 до 380 нм, происходит восстановление поглощения в значении 431нмпо [19]). Кроме непосредственного влияния активных форм кислорода, генерируемого бисретиналиденэтаноламином, эпокси-формы А2Е также могут быть вовлечены в патологию клеточных структур. Более того, как предполагается в исследованиях [126], эпоксиды бисретиналиденэтаноламина за счет большего, по сравнению с синглетным кислородом свободного пробега, являются более предпочтительными интсрмедиатами образования побочных продуктов фотосенсибилизации, по крайней мере, при взаимодействии со структурами, находящимися на значительном расстоянии от от исходной молекулы фотосенсибилизатора. Этими мишенями, как было показано в работах [126] могут выступать нуклеиновые кислоты, недоступные для воздействия генерируемого на свету фотосенсибилизатором синглетного кислорода.

Кроме ДНК, мишенями для эпокси-форм могут служить и такие макромолекулы, как белки. В работе [116] было показано, что А2Е-эпоксиды атакуют сульфгидрильные и аминогруппы белков, в частности, цитохромоксидазы митохондрий, что, как уже отмечалось может приводить к апоптозу.

В генерации же других активных форм кислорода, таких, как, например, супероксида, А2Е не участвует. Более того, имеются данные [19];, что этот пигмент сам способен выступать эффективным тушителем супероксида ( константа тушения, k_q~2*10 -10 дм³мол"'с"¹). Этого можно было ожидать, учитывая схожесть структуры А2Е (см. рис.1, 9) со структурой каротиноидов (например, витамина А).

4. Липидные биелои и граничные потенциалы.

4.1. Бислоиная липидная мембрана как модель клеточной мембраны.

БЛМ как объект исследования впервые был предложен в 1962 году Мюллером с соавт. [77] Для формирования БЛМ на отверстие (диаметром приблизительно I мм) в тефлоновой перегородке, разделяющей ячейку на два отсека, которые заполнены раствором электролита, наносят каплю раствора липида в неполярном растворителе. Капелька липидного раствора растекается, образуя вначале многослойную, а затем бислойную пленку. За процессом формирования БЛМ можно следить по интерференционной картине, которая возникает при освещении тонких пленок. При освещении многослойной пленки происходит наложение волн от одного и того же источника, отразившихся от передней и задней поверхности пленки. Возникает интерференционная картина, которая при освещении белым светом оказывается цветной. Поэтому многослойные мембраны принято называть цветными. По мере дальнейшего растекания пленки ее толщина уменьшается, и когда оптическая разность хода становится меньше А/4 длины, волны, отраженные от передней и задней поверхностей пленки, при интерференции гасят друг друга. Пленка становится темной - черная БЛМ. Стоит заметить, что наиболее надежный способ регистрации процесса формирования БЛМ - измерение ее удельной проводимости и емкости, которые являются для каждого раствора липидов вполне определенной величиной. Полученные таким способом мембраны по своим физико-химическим свойствам близки к биологическим мембранам. К недостаткам такой модельной системы можно отнести то, что черная мембрана содержит растворитель, и то, что при формировании БЛМ на границе с отверстием тефлоновой ячейки образуется тор из «лишнего» липида. Объем тора намного больше объема мембраны, а площадь контакта с водой у тора меньше. Поэтому в ряде случаев, возможно, что при добавлении исследуемого вещества в водный раствор, оно успевает войти в БЛМ, но не успевает проникнуть в тор, и равновесие в системе не устанавливается. Указанные факторы могут являться причиной плохой воспроизводимости результатов в ряде случаев.

К настоящему времени хорошо изучены физико - химические свойства БЛМ и разнообразные методические подходы к измерению ее электрических характеристик. По изменению электрических характеристик БЛМ в результате изучаемого процесса можно

исследовать проницаемость мембран и образование в ней пор (по изменению ее проводимости, [145], транспорт веществ через мембрану, если при этом происходит изменение рН в пеперемешиваемых слоях (по изменению трансмембранного потенциала мембраны, модифицированной протонофором, [б, 51], адсорбцию вещества на мембране по изменению распределения потенциалов на границе мембрана - раствор [34, 70, 122]. Изучая распределение граничных потенциалов, можно получить информацию о том, в каком ионном виде адсорбируется вещество, оценить его концентрацию в мембране и глубину проникновения в нее.

В литературе в последние годы появилось много работ, посвященных изучению распределения электрических потенциалов на БЛМ при адсорбции амфифильных ионов. Как уже говорилось в предыдущих главах, амфифилыше ионы - это соединения, молекулы которых имеют заряженную группу и гидрофобный участок. Благодаря этому они способны адсорбироваться и изменять распределение электрического поля на границе мембраны. Несмотря на большое количество работ в этой области, вопрос, каким образом это происходит, остается открытым. В работах [84, 88] (см. также обзор [122]) показано, что зависимость изменения граничного потенциала, вызванного адсорбцией амфифильных ионов, не описывается простой теорией диффузного двойного слоя, и делается предположение о существовании большого скачка потенциала в приповерхностном слое мембраны, который не зависит от ионной силы раствора.

4.1.1 Электростатические потенциалы на границе мембраны.

Углеводородная область липидного бислоя определяет его низкую проницаемость для ионов. Полярная область липидов, а также молекулы ориентированной воды и других соединений на границе мембраны формируют локальные электрические поля, которые играют регулирующую роль в электрофизиологических процессах на мембране. Точную структуру электростатических полей можно установить, если известно расположение всех заряженных и дипольных молекул вблизи границы мембраны. Однако, во многих случаях важно знать не детальную структуру полей, а усредненную картину. Она может быть представлена в виде распределения потенциала на границе мембраны: зависимости потенциалов, усредненных в плоскостях, параллельных мембране, от их положения по отношению к границе раздела мембраны с раствором. Предельным случаем такого распределения является граничный потенциал. В электрохимии принято определение

межфазного потенциала как разности потенциалов между двумя плоскостями, расположенными в разных фазах достаточно далеко от их границы раздела, что гарантирует электронейтральность среды в окрестностях этих плоскостей. К биологическим мембранам такое определение следует применять с осторожностью, поскольку одна из фаз - мембрана - имеет очень малую толщину. Граничный потенциал в этом случае можно определить как разность между электрическим потенциалом в объеме водного раствора и средним потенциалом в¹ плоскости, расположенной посередине мембраны. Однако, часто важно знать не абсолютную величину межфазного потенциала, а ее изменение вследствие различных событий. Такими событиями могут быть изменение состава водного раствора, адсорбция заряженных или дипольных молекул на поверхности мембраны, либо структурные перестройки в самой мембране. Они приводят к изменению распределения потенциала в достаточно тонком слое либо полярной области мембраны, либо водного раствора вблизи мембраны. В отличие от абсолютной величины, изменение межфазного потенциала может быть измерено. Имеющиеся методы позволяют измерить изменение разности' потенциалов между объемом водного раствора и плоскостью, расположенной вблизи границы раздела мембрана/раствор. Положение этой плоскости может быть разным в зависимости от применяемого метода. Это дает возможность, сравнивая результаты, полученные разными методами, получить информацию о распределении электростатического потенциала на границе мембраны с раствором.

Это распределение можно условно разбить на 2 области, различающиеся между собой происхождением потенциала и областью его изменения. Первая область представляет собой водный раствор вблизи границы мембраны. Изменение потенциала в этой области возникает вследствие электрического заряда поверхности мембраны. Заряд может быть вызван, как фосфолипидами самой мембраны, так и посторонними заряженными молекулами, адсорбированными на ее поверхности. Из-за того, что мембрана обладает поверхностным зарядом, тонкий слой водного раствора вблизи мембраны не является электронейтральным. Изменение потенциала в этом слое называют поверхностным потенциалом, а сам слой - диффузным. Существенно, что поверхностный потенциал представляет собой разность потенциалов между плоскостями, расположенными в одной и той же фазе: одна плоскость расположена в объеме раствора далеко от мембраны, другая -максимально приближена к поверхности мембраны. Поэтому абсолютную величину

поверхностного потенциала можно измерить, и имеются экспериментальные методы, позволяющие это сделать.

Вторая область представляет собой границу раздела мембрана/раствор между плоскостью, расположенной в водном растворе вблизи границы мембраны, и плоскостью посередине мембраны. На распределение потенциала в этой области влияют главным образом диполи ориентированных молекул воды на границе мембраны с раствором, а также фосфолипидов и других молекул в полярной области мембраны. Поэтому скачок потенциала в этой области часто называют дипольным потенциалом. В электрохимии разность потенциалов между двумя разными фазами называют Гальвани-потенциалом. Ее абсолютную величину измерить невозможно, но, как уже отмечалось выше, на практике важно знать не абсолютную величину, а только ее изменение вследствие различных событий.

Распределение потенциала поперек всей мембраны можно приближенно представить в виде скачков потенциала на двух противоположно ориентированных границах мембраны с раствором и линейного изменения потенциала в гидрофобной области мембраны (рис. 11 ).

Мембрана

плоскость скольжения

д<р_1П * о

_ни

*61 ^Fdl ^Pd2 *s2

Рис. 11. Распределение электрического поля на границах липидной мембраны с разными растворами электролитов в условиях короткозамкнутой цепи. Внизу изображена эквивалентная электрическая схема.

Если между водными растворами с помощью внешней цепи приложить разность потенциалов, она приведет к изменению профиля потенциала внутри мембраны. Для того, чтобы понять, где это изменение будет более сильным, можно воспользоваться эквивалентной схемой, в которой гидрофобная часть мембраны и внешние слои, ответственные за появление граничных потенциалов, представлены в виде последовательно соединенных конденсаторов (рис. 11). Напряжение между растворами поделится между этими конденсаторами, причем наибольшая часть этого падения напряжения окажется на конденсаторе с наименьшей емкостью. Очевидно, что наименьшей емкостью обладает гидрофобная область мембраны, имеющая наибольшую толщину и наименьшее значение диэлектрической проницаемости. Поэтому основная часть приложенной между растворами разности потенциалов будет падать в гидрофобной области, и только небольшая часть (не более 1 %) в наружных слоях. Это означает, что граничные потенциалы с двух сторон мембраны практически не зависят от приложенного к мембране напряжения, и в дальнейшем мы будем считать их постоянными.

4.2 Методы измерения граничных потенциалов липидных бислоев

4.2.1 Определение ^-потенциала по электрофоретической подвижности липосом.

Метод измерения (^-потенциала появился в начале 20 века, широко используется и описан во многих учебниках и монографиях. Значение (^-потенциала рассчитывается из результатов измерений электрофоретической подвижности частиц по формуле Смолуховского.

^єє . (4.2.1.1)

Следует отметить, что ^-потенциал представляет собой потенциал в «плоскости скольжения», которая не совпадает с поверхностью мембраны. По этой причине ,-потенциал оказывается меньше поверхностного потенциала, ожидаемого на основе теоретических оценок или измеренного другими методами. Это различие становится значительным при высоких значениях поверхностного заряда и в концентрированных растворах. Однако, поверхностный потенциал может быть вычислен из ^-потенциала на

основе с помощью уравнений, учитывающих падение потенциала в диффузном слое в области между поверхностью мембраны и плоскостью скольжения. Наилучшее согласие вычисленного таким образом поверхностного потенциала с теоретически предсказанным, либо измеренным другими методами, было получено- в предположении, что плоскость скольжения отстоит от поверхности мембраны на расстоянии примерно 0.2 нм.

Данный метод очень часто используют в силу двух обстоятельств: во-первых, он позволяет измерить скачок потенциала только в диффузном слое, который вызван поверхностным зарядом мембраны. Поэтому сопоставление результатов измерений этим методом с другими методами, позволяющими» измерить полный скачок граничного потенциала, дает возможность определить, какая его часть приходится на диффузный слой, а какая - на более глубокую область мембраны. Во-вторых, ^-потенциал представляет собой разность потенциалов между плоскостями, расположенными в одной фазе - в водном растворе на бесконечной расстоянии от мембраны и плоскости скольжения около мембраны. Такая разность потенциалов может быть измерена, и данный метод -единственный, позволяющий определить абсолютную величину поверхностного потенциала. Все остальные методы чувствительны к разности потенциалов между двумя разными фазами: водным раствором и плоскости, расположенной внутри мембраны, и поэтому не позволяют измерить абсолютное значение граничного потенциала, а только его изменение.

4.2.2 Поверхностный потенциал монослоев.

Методы измерения поверхностного потенциала на монослоях широко используются и хорошо описаны во многих монографиях. Поэтому, как и с предыдущим методом измерения ^-потенциала, в данном обзоре будут приведены комментарии о возможности сопоставления результатов,, полученных на монослоях, с результатами измерения граничных потенциалов непосредственно на биологических и искусственных липидных мембранах. При таком сопоставлении часто оказывалось, что поверхностный потенциал, измеренный на монослоях, значительно превышал граничный потенциал, измеренный на БЛМ. Это может быть вызвано двумя основными причинами. Во-первых, на монослоях измеряется разность потенциалов (естественно, в соответствии с комментариями, сделанными выше, это не абсолютная разность потенциалов, а ее изменение) между двумя бесконечными фазами - воды и воздуха. На мембранах можно измерить лишь разность

потенциалов между водой и плоскостью внутри мембраны, причем из-за того, что мембрана имеет малую толщину, эта плоскость расположена довольно близко от границы раздела липид/вода. Во-вторых, монослои можно сжимать, и площадь, занимаемая молекулами, участвующими в образовании межфазного потенциала на монослоях, является переменной величиной. При сопоставлении результатов, полученных на монослоях и мембранах, наилучшее согласие было получено при таком сжатии монослоя, когда площадь, занимаемая одной молекулой фосфолипида, составляла 60 А [90].

4.2.3 Зонды: флуоресцентные и спин-метки, ионофоры.

Эти методы основаны на влиянии граничных потенциалов на распределение заряженных частиц между мембраной и водой и на скорость их перемещения в мембране. В случае измерений на липосомах в качестве зондов можно использовать флуоресцентные зонды и спиновые метки. На плоских мембранах наибольшее распространение получили ионофоры либо гидрофобные ионы. Принципы определения граничных потенциалов в этих системах сходны. Их можно проиллюстрировать на примере гидрофобных ионов. Для простоты рассмотрим симметричное распределение потенциала, когда граничные потенциалы с обеих сторон БЛМ одинаковы. Гидрофобные ионы адсорбируются в некотором припверхностном слое мембраны, соответствующем минимуму их потенциальной энергии. При достаточно низкой концентрации ионов можно пренебречь их взаимодействием и эффектами насыщения мест связывания. Тогда равновесная концентрация ионов в адсорбционном слое п связана с их концентрацией в растворе C_w и разностью потенциалов между раствором и адсорбционным слоем (р_п распределением Больцмана

^RI , (4.2.3.1)

где у- коэффициент, определяемый неэлектрической энергией связывания (его можно считать константой связывания). Гидрофобные ионы обычно добавляют в водный раствор. Объем раствора намного больше объема мембраны, поэтому количество связанных с мембраной гидрофобных ионов мало по сравнению с их количеством в воде, и их концентрацию в воде можно считать постоянной. Тогда изменение разности потенциалов

между раствором и плоскостью адсорбции гидрофобных ионов Acp_n приведет к изменению их равновесной концентрации в мембране согласно уравнению

Л_=ехр(_^)

^по ^RT . (4.2.3.2)

где пи п₀ соответствующие концентрации гидрофобных ионов в мембране до и после изменения граничного потенциала.

Кинетика транспорта ионов через мембрану может описываться с помощью двух различных подходов. Первый - классический подход Нернста-Планка рассматривает перемещение ионов в мембране как диффузию и миграцию в непрерывной макроскопической среде, второй - квантовый,' Эйринга, как прыжки через потенциальные барьеры [17, 52]. В первом подходе было показано, что вольтамперные характеристики БЛМ лучше всего описываются в предположении, что потенциальный барьер иона в мембране имеет форму трапеции. Второй подход использует упрощенный потенциальный барьер треугольной формы. Оба теоретических подхода, несмотря на их различие, предсказывают одинаковое уравнение, описывающее влияние высоты потенциального барьера на скорость перемещения ионов в мембране, которое по виду аналогично уравнению Эйринга об актив ационном барьере химической реакции. Симметричное изменение граничных потенциалов с двух сторон мембраны вызывает изменение высоты потенциального барьера, причем на нее влияет только часть граничного потенциала, которая падает между плоскостью адсорбции гидрофобных ионов и плоскостью симметрии мембраны (рис. 11). Изменение этой разности потенциалов Асрь приведет к изменению константы скорости перемещения ионов в мембране согласно уравнению

^ = ехр(-^)

^V (4.2.3.3)

где v₀ и уд - константы скорости перемещения ионов в мембране до и после изменения граничных потенциалов. Если проводимость мембраны пропорциональна произведению концентрации гидрофобных ионов в мембране п на константу скорости их перемещения v ,

можно получить простую формулу, описывающую изменение проводимости при изменении граничного потенциала. Для этого достаточно перемножить уравнения (4.2.3.2) и (4.2.3.3)

JL _{= exp(}_^L)

о ^RT (4.2.3.4)

Из уравнения (4.2.3.4) следует, что полное изменение проводимости g позволяет определить изменение граничного потенциала Ащ между объемом раствора и плоскостью симметрии мембраны. Кроме того, в некоторых случаях, используя кинетические методы, можно определить не только проводимость мембраны, но и концентрацию носителей заряда п а также константу скорости их перемещения в мембране v. Это позволяет получить информацию о распределении граничного потенциала в мембране, измерив не только полное изменение граничного потенциала Ащ, но и его части: Аф_п (с помощью уравнения (4.2.3.2)) между объемом раствора и плоскостью адсорбции, а таюке A_s (уравнение (4.2.3.3)) между плоскостью адсорбции и серединой БЛМ.

Хотя формула (4.2.3.4) получена для прямого прохождения ионов, легко показать, что при тех же предположениях она справедлива и для индуцированного транспорта ионов. Однако, тогда z будет представлять собой валентность заряженного? комплекса, переносящего через мембрану электрический ток. Это обстоятельство может быть использовано и для обратной задачи: измеряя зависимость проводимости от граничного потенциала, можно определить заряд этого комплекса.

О возможности определения граничного потенциала БЛМ с помощью измерения проводимости было впервые сообщено в работе [63]. Позднее этот метод интенсивно использовался McLaughlin [70, 71] с антибиотиком нонактином, который создает проводимость БЛМ для положительно заряженных комплексов нонактин-К⁺.

Формула (4.2.3.4) справедлива при условии, что проводимость пропорциональна произведению равновесной концентрации носителей тока в БЛМ на их подвижность. При измерении проводимости по постоянному току это условие выполнятся, если перемещение заряженных комплексов через БЛМ является самой медленной (лимитирующей) стадией ионного транспорта. Это имеет место для многих ионофоров, таких как нонактин, который

по этой причине использовали как зонд для измерения граничных потенциалов, или валиномицин, а также для положительно заряженных гидрофобных ионов [46, 52]. Однако, в ряде случаев, например, в присутствии гидрофобных анионов, перемещение заряженных комплексов через мембрану происходит быстро, и эта стадия не лимитирует постоянный ток. В этих случаях применяют кинетические методы, позволяющие определять скорости отдельных стадий транспорта [48]. Существуют три разновидности методов исследования кинетики ионного транспорта через БЛМ. В них измеряют либо переменный ток через БЛМ при наложении переменного напряжения (метод адмиттанса), либо кинетику релаксации тока при наложении ступеньки напряжения (релаксация тока), либо по кинетику изменения потенциала при саморазряде мембраны (релаксация заряда). Эти методы позволяют определить скорости отдельных стадий ионного транспорта, в частности, проводимость гидрофобной области мембраны. Для нее формула (4.2.3.4) выполняется. По изменению параметров, характеризующих другие стадии ионного транспорта, можно получить дополнительную информацию о распределении потенциала в мембране. Такие исследования проводились с гидрофобными анионами тетрафенилбората [68, 84] и дипикриламина [142], с комплексами валиномицин-рубидий [15, 21].

Недостатком данного метода является то, что на величину проводимости влияет много других факторов, не имеющих отношения к электростатическим потенциалам, таких как толщина, диэлектрическая проницаемость, подвижность заряженных комплексов в мембране, их число мест связывания на границе мембраны и т.д. Поэтому нет уверенности, что полученное в эксперименте изменение проводимости вызвано только изменением граничного потенциала. Во избежание ошибок, измерения граничных потенциалов проводят сразу с несколькими ионофорами или гидрофобными ионами и достоверными считают такие результаты, которые на разных ионофорах совпадают. Наиболее эффективным является использование пары ионофоров или гидрофобных ионов, которые имеют противоположный заряд носителей тока в мембране. Как следует из уравнений (4.2.3.2-4.2.3.4), изменение параметров ионного транспорта, вызванное изменением граничного потенциала, для противоположно заряженных носителей тока должно происходить в противоположном направлении. Неэлектростатические факторы, напротив, влияют на транспорт независимо от заряда носителей тока. Поэтому сопоставление результатов, полученных с противоположно заряженными носителями тока, позволяет

Применение фотосенсибилизаторов в медицине. Основы метода фотодинамической терапии

В конце семидесятых - начале восьмидесятых годов на основе ФДВ был предложен новый метод в онкологии - фотодинамическая терапия (ФДТ) рака. Метод фотодинамической терапии рака основан на способности фотосенсибилизаторов, выборочно накапливаться в клетках опухоли и инициировать их разрушение при освещении видимым светом [64]. История метода берет начало с опытов Хаусмана 1911 г., коюрый выделил из крови гематопорфирин и установил, что в его присутствии при освещении происходит повреждение тканей. Впервые действие гематопорфирина на человеческий организм испытал в сенсационном эксперименте на себе самом F.Meyer-Betz [73]. 14 октября 1912 г. он ввел себе внутривенно 0,2 г гематопорфирина и продемонстрировал солнечную фоточувствительность в виде отека и гиперпигментации, которые продолжались в течение 2 месяцев (рис.1). Последующие исследования подтвердили, что системное применение гематопорфирина вызывает интенсивную фотосенсибилизацию различных тканей, в том числе кожи. Поликард обнаружил, что в опухолях, как у животных, так и у человека могут накапливаться эндогенные порфирины [65]. Но только недавно эти два факта стали рассматриваться вместе и использоваться для диагностики опухолей (опухоль обнаруживают по флуоресценции порфирина, предварительно введенного в организм [65]) и терапии рака [28, 78]. Диагностическое значение основанной на использовании гематопорфирина флюоресценции неопластических тканей подчеркнул A.Policard в 1924 г. [97]. Он предположил, что красная флюоресценция, вызываемая ультрафиолетовым светом на экспериментальных саркомах крыс, обусловлена накоплением эндогенного гематопорфирина вследствие вторичного инфицирования гемолитическими бактериями. В исследованиях с крысами было показано, что красную флюоресценцию неопластической ткани можно усилить путем введения экзогенного гематопорфирина [10]. Стало очевидным, что накопление гематопорфирина опухолями в большей концентрации, чем нормальными тканями, указывает на возможность нового диагностического и лечебного применения сенсибилизаторов при раке. В 1948 г. F.HJ.Figge с соавторами [39] продемонстрировал повышенное сродство (т.е. свойство поглощать, накапливать) к порфирину таких тканей с высокой пролиферативной активностью, как неопластическая, эмбриональная и регенеративная. Авторы доказали это на модели экспериментальных животных и высказали мнение о возможности ФДТ рака с использованием порфиринов.

За прошлые годы несколько тысяч пациентов были подвергнуты ФДТ. Суть этого метода состоит в том, что порфирин вводят пациенту в кровь (если это водорастворимое соединение - его водный раствор, если неводорастворимое - с помощью липосом [102]). Затем ткани, в которых накопился порфирин, облучают видимым светом, например, с помощью световых волокон. Оптимальное воздействие достигается при облучении светом с длиной волны больше 600 нм, т.к. в этой области лежит одна из полос спектра поглощения большинства порфиринов и проникающая способность излучения в ткань максимальна [132]. Клиническая плотность световой дозы составляет 20 - 120 Дж/см . В результате этих процедур происходит некроз опухолей [101, 103]. По ряду исследователей, ФДТ является единственно возможным методом лечения пациентов, которым не удалось помочь рентгено- и хемотерапией. Из побочных эффектов ФДТ пока обнаружен только один: повышенная чувствительность колеи к свету в течение месяца после инъекции порфирина. На настоящий момент кроме порфирина в медицине используют широкий спектр фотосенсибилизаторов, относящихся к разным классам химических соединений. В результате анализа большого объема экспериментальных и клинических материалов были сформулированы основные требования к оптимальному фотосенсибилизатору, включающие биологические (токсические и фармакокинетические), фотофизические и химико-технологические критерии. Прежде всего, это: низкая темновая и световая токсичность в терапевтических дозах; высокая селективность накопления в тканях злокачественных новообразований и быстрое выведение фотосенсибилизатора из кожи и эпителиальной ткани; сильное поглощение в спектральном диапазоне, где биологические ткани имеют наибольшее пропускание (красный и ближний ИК диапазоны); оптимум между величинами квантового выхода флюоресценции и квантового выхода интерконверсии, второй из которых определяет способность фотосенсибилизатора к генерации синглетного кислорода (в то же время, способность фотосенсибилизатора флюоресцировать обуславливает его диагностические возможности и облегчает контроль накопления и выведения его из тканей); высокий квантовый выход образования синглетного кислорода в условиях in vivo; доступность получения или синтеза, однородный химический состав; хорошая растворимость в воде или разрешенных для внутривенного введения жидкостях и кровезаменителях; стабильность при световом воздействии и хранении. Основное ограничение метода ФДТ - глубина действия лазерного излучения. Используемые в клинике препараты имеют спектр фотодинамического воздействия с максимумами в области 620 - 690 нм.

Проницаемость биологических тканей в этом диапазоне незначительна и составляет несколько миллиметров. Известно, что максимальная проницаемость тканей находится в дальней красной и ближней ИК области 750 - 1500 нм и соответствующей диапазону генерации эффективных, надежно работающих и доступных лазеров. Создание и внедрение фотосенсибилизаторов, обеспечивающих эффективную генерацию синглетного кислорода в этой области спектра, могло бы существенно расширить сферу применения ФДТ. В настоящее время проводится направленный поиск оптимальных фотосенсибилизаторов среди производных хлоринов, бактериохлоринов, пурпуринов, бензопорфиринов, тексафиринов, этиопурпуринов, нафтало- и фталоцианинов [85]. При этом особый интерес представляют фотосенсибилизаторы, обладающие способностью не только быстро накапливаться в опухолях, но и с высокой скоростью распадаться. Каждый из используемых сейчас в ФДТ фотосенсибилизаторов имеет свои преимущества и недостатки. Широко используемые в настоящее время производные гематопорфиринов имеют слабое поглощение в красной области спектра и, кроме того, обладают кожной токсичностью. ФДТ как метод лечения находится на стадии становления. На сегодня имеется ряд показаний к ее применению в клинике. Десятки клиник мира используют лазерную ФДТ для лечения онкологических заболеваний. Клиническое применение этого метода показывает обнадеживающие результаты для большого числа опухолей [29, 89, 114]. Уникальные свойства ФДТ позволят однозначно определить место этого метода лечения в терапии рака. ФДТ в нынешнем виде представляет местнорегиональный вариант лечения, то есть воздействует на первичные и, вероятно, на местно-распространенные опухоли. , Таким образом, ФДТ будет играть ведущую роль в избранных областях, подобно хирургии и радиотерапии сегодня. Целью применения такого лечения будет улучшение контроля над местными симптомами опухоли и снижение смертности по сравнению с хирургическим вмешательством и радиотерапией. При этом одной из проблем ФДТ по-прежнему остается повышение селективности накопления фотосенсибилизатора в опухоли, так как следствием низкой селективности является невысокая эффективность лечения и повышенная чувствительность кожи к дневному свету. В настоящее время рассматривается возможность применения ФДТ при инфекционных и неонкологических заболеваниях. Проблема инфекционных заболеваний остается одной из главных во многих областях медицины. Устойчивость возбудителей к антибиотикам и необходимость проведения системного лечения создают множество вторичных проблем (проблемы нефро-, гепато- и нейротоксичности).

Влияние встраивания А2Е на стабильность мембраны.

Как известно, А2Е является амфифильным катионом. Его структура включает положительно заряженную пиридиновую головку и два гидрофобных ретиналевых хвоста (см. рис. 3, Б.). При этом гидрофобные ретиналевые группы встраиваются между углеводородными хвостами мембранных липидов. Об этом свидетельствует тот факт, что максимум флуоресценции А2Е, связанного с клетками, соответствует таковому в неполярных растворителях [128]. Молекула А2Е способна встраиваться в мембрану. Благодаря клиновидной структуре она может вызывать локальные изменения геометрии бислоя, что в свою очередь может повлиять на энергию спонтанно образующихся пор, а значит и на стабильность мембраны. Факт порообразования под действием А2Е был зафиксирован в опытах по увеличению проницаемости митохондрий для некоторых красителей и даже белковых молекул в присутствии А2Е [92]. Согласно теории порообразования, липидный бислой мембран представляет собой довольно жесткое структурное образование. Однако известно, что время жизни БЛМ ограничено и зависит от состава мембран и внешних условий. В природных мембранах также в ряде случаев возникают механические нарушения и дефекты, например, под действием некоторых продуктов метаболизма, таких, как А2Е. Обычно нарушение стабильности мембран связывают с необратимыми изменениями их структуры. Наиболее признанным в настоящее время является механизм разрушения мембран, обусловленный дефектами типа сквозной поры. Предполагают, что формирование дефекта сопровождается переориентацией молекул липида, расположенных вблизи границы дефекта с образованием так называемой инвертированной поры. В свете этой теории очевидно, что молекула А2Е, имеющая коническую форму, встраиваясь в липидный бислой, будет способствовать разрушению мембраны путем образования инвертированных пор.

Возможно также, что адсорбция бисретиналиденэтаноламина только с одной стороны мембраны (при встраивании пигмента в один из монослоев), вызовет появление внутримембранного поля (до 100 мВ), которое будет способствовать образованию гидрофильных пор [135]. Кроме того, многие экспериментальные данные [25, 92] свидетельствуют о том, что патогенное действие А2Е может быть связано с его детергентным действием мембраны. Влияние детергентов на стабильность мембраны может быть связано с изменением ее поверхностного натяжения [145]. О влиянии А2Е на геометрию мембран свидетельствует также наблюдение, что в а присутствии этого пигмента происходило образование пузырей (блеббинг) [126] (см. рис. 8). Как было показано в некоторых работах, при развитии AMD RPE-клетки погибают в результате апоптоза. Апоптоз, как вид клеточной гибели, существует как физиологически необходимый процесс для поддержания тканевого развития и гомеостаза. Он играет решающую роль в физиологии таких болезней, как рак, синдром приобретенного иммунодефицита, аутоиммунных заболеваниях и тканевых деградациях [118]. При дестабилизации работы митохондрий, к примеру, во время окислительного стресса, они высвобождают апоптоз-индуцирующие белки. Один из них - цитохром С, который, находясь в цитоплазме, не всегда, но зачастую, активирует каспазы, апоптоз-специфичные протеазы. Другой белок - апоптоз-индуцирующий фактор (AIF), индуцирует ядерный апоптоз независимо от каспазной активности. Согласно современным представлениям, митохондрии функционируют как сенсоры клеточного стресса, приводящего к запуску системы апоптоза. Было показано [135], что липофильный катион тУ-ретинил-ІУ-ретиналиденэтаноламин (А2Е), компонент липофусциновых гранул, индуцирует апоптоз в культуре RPE и других клеток. Апоптозу сопутствует появление проапоптотического белка цитохрома С и апоптоз-индуцирующего фактора цитоплазмы и ядра. Кроме того, многие экспериментальные данные [92, 127], свидетельствуют о том, что патогенное действие А2Е может быть связано с его детергентным действием мембраны. Клеточные мембраны в присутствии А2Е склонны также к образованию пузырей (блеббинг), что было показано в работе [126](см. рис. 8). Взаимодействие А2Е с клеточными структурами, таких, как мембраны, а также возможное участие во внутриклеточных процессах, не ограничивается лишь амфифильностью пигмента. К настоящему моменту опубликована масса работ, посвященных фототоксичности А2Е, результаты которых зачастую противоречивы. Максимум поглощения пигмента А2Е, лежит в районе 430 нм (см. рис. 16). Из литературных данных известно, что А2Е при освещении генерирует синглетный кислород, т.е. является фотосенсибилизатором [55, 125, 126]. Но как было показано [107], генерация под действием излучения синглетного кислорода бисретиналиденэтаноламином в 60 раз менее эффективна, чем его предшественником, транс-ретиналем. Поглощая квант света, пигмент-фотосенсибилизатор (например, молекула А2Е) переходит в синглетное, а затем в триплетное возбужденные состояния.

В обоих возбужденных состояниях молекулы пигмента взаимодействуют с молекулярным кислородом, передают ему свою энергию и превращают его в очень активный окислитель. Известно, что возрастающий уровень хОг может быть причиной обновления «отработанных» субклеточных компонентов фоторецепторов, а также фотодинамического действия пигментов в клетках, не имеющих фоторецепторных систем. Как было показано в работе [19], под действием короткой вспышки лазера с длиной волны 350 нм в насыщенном аргоном метаноле, А2Е переходит в возбужденное состояние с максимумом поглощения 450 нм (см. рис. 13). При добавлении 100 мкМ кислорода наблюдается бимолекулярная реакция тушения с константой 2,6 109 л/моль с. Однако спектры в ближнем инфракрасном диапазоне показали очень слабо различимые полосы поглощения производных А2Е, из которых нельзя сделать однозначного вывода о переносе энергии на радикал А2Е. С другой стороны, А2Е несет положительный заряд и может быть легко окислен в катионрадикал. Таким образом, сенсибилизация в присутствии антрацена ведет обычно к триплет-триплетному переносу энергии с появлением триплетного состояния А2Е. Прямое возбуждение А2Е в метаноле в отсутствие сенсибилизаторов ведет к еле заметным переходным состояниям, что делает сложным их идентификацию, даже если изучать продукт кислородного тушения возбужденного А2Е [19, 126]. Будучи сильным окислителем, синглетный кислород может участвовать в патологических нарушениях клеточных структур. Было показано [126, 135], что, облучение синим светом суспензию RPE-клеток, наполненных А2Е, приводит к индукции апоптоза последних, за счет нарушения стабильности митохондрий и высвобождения из них проапоптотического белка гщтохрома С . Более того, синглетный кислород, образующийся в результате тушения возбужденного состояния А2Е, способен далее реагировать с самой молекулой пигмента по углерод-углеродным двойным связям ретиналевой группы, в результате чего образуются А2Е-эпоксиды (см. рис. 9) [126].

Использование БЛМ для моделирования фотодинамических реакций.

Изучение механизма фотодинамических реакций на уровне организмов или отдельных клеток затруднено из-за их сложности строения. Поэтому в течение многих лет проводятся исследования на искусственных модельных системах. Наиболее изученной модельной системой являетсяБЛМ. Рассмотренные выше методы позволяют изучать адсорбцию веществ либо несущих заряд, либо обладающих дипольным моментом. Их применение оказалось полезным при изучении взаимодействия фотосенсибилизаторов с липидной мембраной. Эффективность фотосенсибилизатора обусловлена прежде всего его способностью связываться с мембраной и только затем - способностью генерировать активные формы кислорода при освещении. Изучение адсорбции ГП на мембране важно для выяснения молекулярного механизма фотохимических реакций, поскольку, было показано, что эффективность фотосенсибилизаторов зависит от их окружения в мембране, которое определяется глубиной расположения их плоскости адсорбции (липосомы). Это было показано в работе [88], где была исследована адсорбция производных гематопорфирина, различающихся гидрофобностью периферийных групп. Оказалось, что при нейтральных значениях рН молекулы гемато-порфиринов адсорбируются на мембране в виде анионов. Их адсорбция сопровождается изменением граничных потенциалов, которое включает в себя как изменение потенциала в диффузной части двойного слоя, так и появление дополнительного неэкранируемого скачка потенциала, вследствие погружения- заряженных групп гематопорфирина внутрь мембраны, и более гидрофобные из исследованных производньк гематопорфирина глубже встраиваются в мембрану, вызывают большие изменения структуры мембраны и обладают большим фототоксичёским действием. Схожее исследование было проведено в работе [112]. где была показано, что эффективность адсобрции фталоцианинов, различающихся числом сульфогрупп, коррелирует с эффективностью этих фотосенсибилизаторов в разрушении встроенных в мембрану грамицидиновых каналов: Рассмотренный метод измерения граничных потенциалов позволяет изучать не только адсорбцию фотосенсибилизаторов, но и их транспорт через мембрану, что было показано в работе [87] на примере гематопорфиринов.

Это соединение обладает зарядом, следовательно, его адсорбция может быть зарегистрировано иметодом КВП . Впервые изменение граничного потенциала при адсорбции фталоцианинов на БЛМ методом КВП было обнаружено в работе [ПО]. Однако, систематического изучения адсорбции фталоцианинов на БЛМ этим методом до настоящего времени сделано не было. Адсорбция алюминиевых фталоцанинов с различным числом сульфогрупп исследовалась элекгрокинетическим методом на липосомах [112], либо с помощью измерений вольта-потенциалов на монослоях [117]. Было показано, что зависимость ( -потенциала от концентрации фталоцианинов по мере уменьшения числа сульфогрупп сдвигается в область меньших концентраций [112]. Иными словами, с уменьшением числа сульфогрупп в молекулах фталоцианина возрастает ффективность их адсорбции на мембране. Аналогичные зависимости были получены при измерении вольта-потенциала на монослоях липидов при адсорбции четырежды и трижды сульфированных алюмофталоцианинов: трижды сульфированный фталоцианин адсорбировался эффективнее четырежды сульфированного [117]. При введении фторида и « -потенциал липосом, и вольта-потенциал монослоев уменьшались. Эффективность адсорбции фталоцианинов коррелировала с их эффективностью как фотосенсибилизаторов на бислойной липидной мембране, вызывающих разрушение встроенных грамицидиновых каналов. В ранних экспериментах было показано, что освещение БЛМ в присутствии ФС приводит к значительному сокращению ее времени жизни, что связано с разрушением липидов, имеющих двойные связи в углеводородных цепях. Если БЛМ сформировать из липидов, не имеющих двойные связи, нарушения их стабильности не происходит [85, ПО]. Это дает возможность изучения адсорбции и транспорта ФС на БЛМ без влияния на эти процессы продуктов фотодинамической реакции [87, 88]. На таких мембранах можно изучать и фотодинамические реакции, если дополнительно ввести в мембрану компонент, который является мишенью для активных форм кислорода. Если вещества - мишени создают индуцированную проводимость БЛМ, их разрушение легко зарегистрировать с помощью электрических измерений. Для этой цели использовались пептиды, формирующие в БЛМ ионные каналы, в частности, грамицидин А [5, 57, 59, ПО, 111]. Мишенями могут и более простые соединения: было показано, что освещение фталоцианина, адсорбированного на поверхности мембраны, приводит к разрушению находящегося в ней протонофора - СССР, в результате чего происходило уменьшение проводимости мембраны и образование трансмембранного потенциала.

Этот потенциал говорил об асимметрии фотодинамической реакции и был объяснен с помощью модели, в которой предполагалось, что реакция происходит более интенсивно на той стороне мембраны, где адсорбирован фталоцианин [121]. Это означает, что концентрация синглетного кислорода с той стороны мембраны, где он образуется в результате возбуждения адсорбированных молекул ФС, существенно выше, чем на противоположной стороне, куда он диффундирует. Значительная часть рассмотренных выше исследований ФДВ выполнена на клетках, что не позволяет исследовать физические механизмы взаимодействия фотосенсибилизаторов с мембраной и окисления липидных и белковых компонентов мембраны. Более удобной системой для таких исследований является БЛМ. Однако, имеющихся в настоящее время исследований на БЛМ недостаточно, чтобы ответить на ряд вопросов. Во-первых, недостаточно изучено связывание А2Е и других фотосенсибилизаторов с БЛМ. Оно имеет большое значение, поскольку встраивание в мембрану является самой первой и необходимой стадией взаимодействия фото сенсибилизатора с мембраной. Такое исследование проводилось с гематопорфиринами [85, 86, 88], но никогда с А2Е. Предполагают, что именно встраивание А2Е в мембрану и окисление под действием света как самого А2Е, так и ненасыщенных липидов в мембране, приводит к ее разрушению. Эти ранние стадии можно исследовать на бислойной липидной мембране. Поскольку молекула пигмента положительно заряжена, ее встраивание в БЛМ может быть изучено методами, позволяющими измерять граничный потенциал. Те же методы могут быть использованы и для изучения окисления А2Е под действием света, что может приводить к изменению липофильности и заряда молекулы, а вследствие этого - к изменению граничного потенциала БЛМ. Эти исследования составят первую часть настоящей работы. Адсорбцию ФС на мембране считают необходимым условием для фотодинамической гибели клеток [112]. Распределение различных ионно-агрегационных форм ФС между водным раствором и мембраной определяется их гидрофобностью, кислотностью и полярностью среды, типом липидов, составляющих мембрану. Выяснение влияния указанных факторов на это распределение является одной из задач предстоящего исследования. Эта задача представляется весьма актуальной, т.к. и содержание кислорода в основном состоянии, и время жизни синглетного состояния зависят от условий в среде. От положения адсорбированных молекул ФС в мембране зависит и действие различных доноров и акцепторов электронов, в частности, эффективность тушителей АФК, которые присутствуют в биологических объектах. Выяснить влияние этих факторов можно, изучив адсорбцию на БЛМ различных аналогов фталоцианина, различающихся по степени гидрофобности молекулы.

Изучение Фотоэффектов в системе БЛМ/А2Е, БЛМ/эпокси-А2Е.

Об этом говорит большая величина граничного потенциала, полученная в экспериментах. Сопоставление максимальных граничных потенциалов на рисунке 18, В с полученными ранее (рис.17,) свидетельствует о том, что в этом способе удается встроить в мембрану до 10 мольных процентов А2Е. После окончания адсорбции А2Е БЛМ с адсорбированным А2Е освещали постоянным светом. Под действием освещения, потенциал сначала возрастал, а затем уменьшался (рис. 18, А). Величина возрастания потенциала, вызванного действием света, приблизительно совпадала с величиной темнового потенциала, вызванного адсорбцией А2Е. Это иллюстрирует рисунок 16Г, где отложена зависимость фотоэффекта от адсорбционного потенциала. О корреляции этих величин говорит то, что точки располагаются вблизи прямой. Изображенная на рисунке прямая проведена по точкам методом наименьших квадратов. Ее наклон примерно равен 1. Если во время роста потенциала свет выключить, потенциал продолжал расти с большей скоростью, достигая стационарного уровня (рис. 18, Б). Изменение потенциала при освещении свидетельствует о том, А2Е превращается в новое соединение. По-видимому, это происходит с участием кислорода. Наиболее изученным продуктом окисления А2Е является эпокси-А2Е, который образуется из А2Е при длительном освещении. Судя по структурной формуле (см. рис. 6), ЭП0КСИ-А2Е является менее липофильным, чем исходный А2Е, и поэтому после образования должен десорбироваться с поверхности мембраны. Таким образом, образованием эпокси-А2Е можно объяснить спад потенциала при длительном освещении. Чтобы показать, что эпокси формы действительно обладают меньшей липофильностью, а также исследовать возможное влияние последних на мембрану, мы предварительно освещали растворы А2Е видимым светом в присутствии кислорода, что приводило к образованию эпокси-А2Е. Мы изучали адсорбцию на БЛМ и фотоэффекты двух различных по степени окисленности образцов, полученных при облучении в течение различного времени: 1ч. 30 мин. и 2ч. 40 мин. Это видно по их спектрам, которые отличались от исходного пигмента и между собой (см. рис. 19, А, ср. также рис. 10). Как видно из рисунка 19, Б, адсорбция образцов, предварительно экспонированных светом (кривые 2 и 3), дает меньший адсорбционный потенциал, чем исходный препарат А2Е (кривая 1). Чем больше была длительность предварительного облучения, тем меньше было изменение граничного потенциала.

Освещение БЛМ приводило к дальнейшему уменьшению граничного потенциала, которое, по-видимому, вызвано дальнейшим образованием эпокси-форм А2Е в мембране и их десорбцией с ее поверхности. Причины возрастания потенциала на начальных стадиях освещения не вполне ясны. Можно предположить, что освещение мембраны сначала вызывает образование промежуточной формы окисления А2Е, которая затем превращается в эпокси-форму. Увеличение потенциала при образовании промежуточной формы окисления А2Е под действием света может быть вызвано либо увеличением плотности заряда на поверхности мембраны, либо изменением дипольного потенциала. Для того, чтобы проверить, происходит ли изменение дипольного потенциала, адсорбция А2Е и фотоэффекты изучались в растворах с различной ионной силой фонового электролита (см. рис 20). Увеличение ионной силы раствора должно приводить к экранированию заряда и уменьшению поверхностного потенциала, но не может влиять на дипольный потенциал. Поскольку мы показали, что адсорбция А2Е приводит к увеличению поверхностного заряда мембраны, то, как и ожидалось, стократное увеличение ионной силы привело к значительному уменьшению поверхностного потенциала, вызванного адсорбцией. Фотопотенциал в растворах с высокой ионной силой также уменьшился, причем в той же пропорции, что и потенциал адсорбции (рис. 20, 21). Из этого можно заключить, что увеличение граничного потенциала при освещении в присутствии А2Е вызвано увеличением суммарного поверхностного заряда молекул адсорбированного пигмента, а не дипольного потенциала. Весьма вероятно, что в результате тушения возбужденного состояния А2Е происходит не только генерация АФК, которые в свою очередь, окисляя молекулы А2Е, приводят к образованию эпокси-А2Е, но и реакции по свободно-радикальному механизму, приводящему к поперечным сшивкам молекул А2Е между собой по двойным связям ретиналевои группы, что сопровождается увеличением плотности поверхностного заряда на мембране. При этом реакции второго типа преобладают в начальный момент освещения, затем доминируют реакции по образованию эпоксидов. Другое возможное объяснение возрастания потенциала основано на результататах экспериментов на липосомах по определению площади, занимаемой заряженной молекулой А2Е в мембране. Было показано, что эта площадь в 2 раза превышает площадь липида, и это могло быть вызвано тем, что не каждая молекула А2Е на поверхности мембраны заряжена. Возрастание потенциала в 2 раза при освещении может приводить к дополнительной диссоциации молекул А2Е в мембране, например, за счет освобождения связанных противоионов, нейтрализующих заряженные группы.

Обобщая полученные результаты, можно предположить, что мы имеем дело с двумя явлениями, противоположно влияющими на изменение граничного потенциала (первоначальный рост и дальнейшее уменьшение). Включение света приводит как к образованию эпоксидов А2Е, так и некой промежуточной формы окисления А2Е. Образование промежуточной формы приводит к росту потенциала, который происходит быстрее, чем его уменьшение при образовании эпоксидов. Поскольку эффект света необратим, процесс образования промежуточных форм эпокси-А2Е имеет характер цепной реакции - свет является инициатором реакции, и дальнейшее ее протекание не зависит от освещения. Образование же эпоксидов, напрямую зависит от освещения А2Е. Достигнутое при освещении стационарное значение потенциала - это равновесие между эффектом, обусловленным образованием промежуточных форм, увеличивающих потенциал и эффектом, обусловленным десорбцией эпоксидов А2Е, то есть уменьшением потенциала.. Выключение света сдвигает равновесие в сторону первого явления, что приводит к росту граничного потенциала Известно, что в фотохимических превращениях А2Е участвует кислород, и синглетный кислород является вероятным интермедиатом реакции превращения А2Е в эпоксиды. Поэтому представлялось интересным исследовать влияние тушителей синглетного кислорода на обнаруженные нами изменения граничного потенциала при освещении. В работе исследовалось действие классического тушителя синглетного кислорода азида натрия, а также липофильного антиоксиданта ВНТ\Butylated hydroxytoluene), который предотвращает окисление внутри мембраны. Кинетика изменения граничного потенциала в присутствии этих соединений показана на рисунке 22 (также см. рис. 21). Как видно из рисунка, введение в систему тушителей синглетного кислорода не предотвращает увеличения граничного потенциала при освещении. Интерпретация полученных результатов может свестись к следующему. Предположительно, синглетный кислород не участвует в изменении структуры А2Е, вызванное «первичным» освещением.. С другой стороны, возможно, что сам А2Е является более предпочтительной мишенью для синглетного кислорода, вследствие чего тушители оказываются неэффективными.

Похожие диссертации на Межфазные потенциалы, возникающие при фотосенсибилизированных окислительных реакциях на поверхности БЛМ

Модельные подходы к расчету профиля поверхности свободной энергии для внешнесферных реакций электронного переноса в полярных средах Соколов Владимир Викторович

Новые методы определения биологически активных соединений, основанные на иммунохимических реакциях на поверхности пьезокварцевых сенсоровДергунова Елена Сергеевна

Окислительно-восстановительные реакции кислорода на поверхности углеродных электродов литий-воздушных аккумуляторовСемененко, Дмитрий Александрович

Исследование поверхности потенциальной энергии реакций иодирования предельных углеводородов методом функционала плотностиЯркова Анна Геннадьевна

Квантовохимическое исследование поверхности потенциальной энергии реакции Принса и путей повышения селективности образования 1,3-диоксановКупова Ольга

Механизм низкотемпературных реакций с участием -кислорода на поверхности FeZSM-5: изотопный обмен O2 и окисление метанаПарфенов, Михаил Владимирович

Реакционная способность индивидуальных форм водорода, адсорбированного на поверхности скелетных никелевых катализаторов, в реакциях жидкофазной гидрогенизации малеата натрия и 4-нитрофенолята натрияПрозоров, Дмитрий Алексеевич

Реакции газофазного окисления-восстановления поверхности PbS (001)Неудачина Вера Сергеевна

Формирование активной поверхности Pd-содержащих катализаторов в реакции гидродехлорирования хлорсодержащих органических соединений Голубина Елена Владимировна

Термодинамика адсорбции водорода и органических соединений на поверхности дисперсного никеля и никелевых катализаторов в условиях реакции жидкофазной гидрогенизацииУлитин, Михаил Валерьевич