Содержание к диссертации
Введение
1. Введение 4
2. Литературный обзор
2.1. Карборанилпорфирины на основе природных порфиринов 12
2.2. Карборанилпорфирины на основе синтетических порфиринов 23
2.3. Карборанилфталоцианины 43
2.4. Заключение 46
3. Обсуждение результатов
3.1. Синтез карборанил- и монокарборанилпорфиринов на основе 2-формил- 5,10,15,20- тетрафенилпорфирина и его металлокомплексов 48
3.1.1. Синтез нейтральных карборанилпорфиринов 50
3.1.2. Синтез карборанилпорфиринов с использованием 9-0- и 9-м-иэоцианатокарборанов и некоторые их превращения 51
3.1.3. Синтез анионных дикарбаундекаборатных производных порфиринов 55
3.1.4. Синтез монокарборанилпорфиринов 57
3.2. Синтез карборанилпорфиринов на основе протогемина IX 60
3.3. Исследование биологической активности полученных соединений
3.3.1. Биологическая активность карбораниллорфиринов на основе синтетических порфиринов 64
3.3.2- Биологическая активность карбораниллорфиринов на основе природных порфиринов 69
4. Экспериментальная часть 75
Выводы 92
- Карборанилпорфирины на основе синтетических порфиринов
- Карборанилфталоцианины
- Синтез карборанилпорфиринов на основе протогемина IX
- Биологическая активность карбораниллорфиринов на основе природных порфиринов
Введение к работе
Современные методы лечения больных злокачественными новообразованиями предполагают хирургическое вмешательство, лучевую терапию и лекарственную терапию. Селективное поражение опухоли при минимальном повреждении здоровых тканей в облучаемом объеме является важным условием эффеетивности противоопухолевой терапии. Одним из направлений в решении проблемы избирательного разрушения злокачественных опухолей является развитие бинарных противоопухолевых стратегий, таких как бор нейтрон захватная (В-НЗТ) и фотодинамическая (ФДТ) терапии. Принцип действия В-НЗТ - разрушение злокачественных клеток в результате индукции локального радиоактивного излучения в биологических объектах, содержащих нерадиоактивный изотоп 1аВ, под действием тепловых нейтронов. Принцип действия ФДТ близок к В-НЗТ, и заключается в разрушении злокачественных новообразований при действии на опухоль, содержащую фотосенсибилизатор, света с определенной длины волны.
К сожалению, известные препараты для В-НЗТ меркаптоундекагидрододекаборат (BSH) и 4-дигидроксиборилфенилаланин (ВРА), используемые при лечении опухолей мозга и меланомы, являются не очень эффективными. Они обеспечивают достаточную концентрацию бора в опухоли {25-30 мг/кг), но не всегда создается необходимый градиент концентраций бора между опухолью и здоровой окружающей тканью.
Одним из путей поиска препаратов для В-НЗТ является использование полиэдрических соединений бора - карборанов (достижение необходимой терапевтической концентрации изотопа 10В), а также использование соединений, обладающих способностью избирательно накапливаться в быстро пролиферирующих тканях. В этом плане особый интерес представляют порфирины - макроциклические молекулы, входящие в состав простетических групп ряда ферментов, участвующих в регуляции важных физиологических процессов, включая перенос кислорода, транспорт элеюронов в дыхательной цепи и др. Относительно низкая токсичность порфиринов в отличие от традиционных препаратов, применяемых в химиотерапии и их способность накапливаться преимущественно в клетках, претерпевших злокачественную трансформацию, обеспечивают важные фармакологические преимущества этих соединений для применения в В-НЗТ и ФДТ.
Полученные результаты по синтезу и изучению физико-химических свойств карборанилпорфиринов расширяют и углубляют фундаментальные знания об этом уникальном классе соединений.
Таким образом, разработка стратегии синтеза карборан ил содержащих порфирииов и исследование их биологической активности является актуальной задачей и имеет как фундаментальное научное значение, так и практический интерес.
Карборанилпорфирины на основе синтетических порфиринов
Первые карборанилпорфирины были использованы Хаусгальтером и Рудольфом [45,46]. Эти авторы синтезировали карборанилпорфирины для использования в качестве катализаторов обратимого мультиэлекгронного восстановления малых молекул - Ог и N2. Попытки получения вышеуказанными авторами простейших карборановых аналогов тетрафенилпорфирина конденсацией о-кар бора н ил альдегида с пирролом оказались неудачными, в основном, из-за большого размера карборанового ядра. В случае менее стерически затрудненного о-карборан-1-ил-ацетальдегида, конденсация его с пирролом в кипящей пропионовои кислоте (реакция Ротмунда) дала карборанилпорфирины 38, 39, в которых клозо карборановые полиэдры связаны с порфириновым макроциклом через метиленовый заместитель [45,46]. Кроме того, были получены металлокомплексы этих карборанилпорфиринов, содержащие в координационной сфере лорфирина кобальт [47] или железо [46]. Одним из важных требований к препаратам для В-НЗТ является их водорастворимость. В большинстве случаев достичь этого можно превращением клозо-карборановых полиэдров до анионов шдо-дикарбаундекаборатов. Расщепление клозо-карборановых полиэдров карборанилпорфирина 39 25% раствором пиперидина в пиридине привела к водорастворимому карборанилпорфирину, содержащему четыре анионных яшЭо-карборановых фрагмента [45,46]. Авторами [48] конденсацией тетра(о-аминофенил)порфирина с хлорангидридом карборанкарбоновои кислоты с последующим расщеплением /шозо-карборановых полиэдров до анионных нидо-аналогов, был синтезирован борированный порфирин 40 (ВТРР), содержащий 4 шдо-карборановых полиэдра, связанные с порфирином по о-положениям фенильных колец. Предварительные испытания показали, что ВТТР накапливается преимущественно в печени и карциноме яичника. В работе [49] изучалось накопление бора в глиоме человека, привитой мышам, которым препарат вводился внутрилеритониально, подкожно или обоими путями. Концентрации бора составили до 18 мкг/г опухоли в случае глиомы и до 45 МКҐ/Ґ опухоли в случае карциномы яичника. Измерения проводили на 7-й день после введения препарата, при этом концентрация бора в печени составляла 102 мкг/г. Концентрация бора в глиоме была увеличена до 33 мкг/г опухоли при введении дополнительных количеств препарата в течение первых трех дней. Однако, несмотря на достаточно хорошие результаты, оказалось, что препарат токсичен для клеток крови. Авторами [30] описывается синтез карборанилпорфирина 41, который представляет собой борированное производное тетрафенилпорфирина.
Получение карборанилпорфирина на основе тетрафенилпорфирина проводилось путем монопиррольной конденсации, по методике [50], с выходом конечного продукта 42%, Для достижения водорастворимое карборановые полиэдры переводились в анионные дикарбаундекабораты при кипячении в метанольной щелочи. Карборанилпорфирин 41 был выделен с выходом 50%.Этот карборанилпорфирин позволял достигалать необходимой терапевтической концентрации бора в опухоли, но он оказался токсичным для использования его в качестве препарата для В-НЗТ. Введение этого препарата вызывало изменения гематологических показателей и активности ряда циркулирующих ферментов. В связи с этим, был создан новый борированный порфирин 42, получивший название тетракарборанилфенилпорфирина (TCP) и получены его медный (СиТСР) 43 и никелевый (NiTCP) 44 комплексы Биологические исследования NiTCP на мышах и СиТСР на крысах показали, что эти соединения не являются токсичными при введении их в организм в терапевтических дозах. После введения NiTCP животным-опухоленосителям концентрация бора в опухоли через 78 часов была в 85 раз выше, чем в крови и в 10 раз выше, чем в нормальных клетках мозга [511. Для СиТСР данное соотношение составляло 39:1 и 20:1, соответственно [52], NiTCP оказался нетоксичным для неопухолевых клеток. Таким образом, был сделан вывод, что NiTCP является перспективным агентом для доставки бора в опухоль [53]. Помимо соединения 43 получен препарат СиТСРН (45) [54]. Его исследования на глиоме человека, привитой крысам, показали следующие результаты: при введении препарата в концентрации 450 мг/кг тела через четыре дня концентрация бора в опухоли составляла 114 мкг/г опухоли, в окружающей ткани - 50 мкг/г, при этом концентрация бора в крови составляла всего лишь 5 мкг/г Для сравнения, для применяющихся в клинике ВРА и BSSB (димера BSH), лекарственные формы которых являются водорастворимыми, не наблюдалось существенной разницы между концентрацией бора внутри опухоли и в перифокальной зоне [55,56], Возможная причина этому - низкие молекулярные массы BSSB и ВРА (менее 500), из-за чего препараты не преодолевают барьер кровь/мозг, как это происходило в случае с СиТСРН, который, хотя и липофилен, но имеет молекулярный вес более 1300. Таким образом, СиТСРН может быть полезным препаратом для доставки большого количества бора в злокачественные опухоли человека, что является непременным условием для его применения в В-НЗТ. Карборановые производные тетрафенилпорфирина 46-49 были синтезированы из 5,10,15,20-тетра(л-аминофенил)порфирина и хлорангидридов 9-о-карборанилуксусной, 4-(9 -о-карборанил)валериановой, 4-(9 -м- карборанил)валериановой и 9-м-карборанкарбоновой кислот [57]. Главным отличием этого синтеза являлось то, что карборановые полиэдры были связаны с порфириновым макроциклом через атом бора полиэдра.
Таким образом, в карборановом ядре сохраняются две незамещенные группы СН, что позволяет вводить различные заместители к атомам углерода каждого карборанового ядра и, таким образом, модифицировать гидрофобные/гидрофильные свойства синтезированных карборанилпорфиринов. Выходы карборанилпорфиринов 46-48 составляют 28-40%. Выход карборанилпорфирина 49 составил всего 2%. В основном был получен полимерный красно-фиолетовый продукт, нерастворимый в органических растворителях. В связи с рядом важных применений карборанилпорфиринов в медицине (БНЗТ, ФДТ и др.) важно изучить их спектральные характеристики и их взаимодействие со светом. Для порфирина 46 были изучены электронные и флуоресцентные спектры, анализ которых показывает, что ковалентное связывание молекул карборана с тетрафениллорфирином приводит к значительным изменениям в тт-системе 20-членного ароматического макроцикла: положения максимумов в электронных и флуоресцентных спектрах сдвигаются в красную область на 3-8 нм по сравнению с исходным тетрафениллорфирином [58]. Наличие довольно существенного красного сдвига в системе карборанилпорфиринов свидетельствует об участии карборанового ядра в создании полисолряженной системы и его способности проявлять свойства трехмерного ароматического заместителя. Таким образом, введение карборановых заместителей в порфирин приводит к специфическим донорно-акцепторным системам, влияющим на их кислотно-основные характеристики. В работе [59] использовался метод монолиррольной кондесации для получения следующих карборанилпорфиринов: Конденсация пиррола с (м-карборан-Э-ил)ацетальдегидом, не привела к образованию порфириновой системы, в то время как 4-(о- и м-карборан-9-ил)пентанали давали карбораниллорфирины 50, 51 с выходом 38 -41%. Авторы [60] на основе 2-[(2-карбокси)винил]-5,10,15,20- тетрафенилпорфирина и 9-гидроксиметил-/и-карборана, 1-гидроксиметил-о-карборана, 3-амино-о-карборана получили карборансодержащие производные тетрафенилпорфирина 52-54.
Карборанилфталоцианины
В отличие от карборанилпорфиринов, работ по синтезу и биологическим исследованиям борированных фталоцианинов очень мало. Опубликовано лишь несколько статей, описывающих синтез ковалентно связанных производных фталоцианинов и полиэдрических карборанов и анионных додекаборатов. Так как фталоцианины способны образовывать очень устойчивые комплексы с металлами, был получен ряд производных металлофталоцианинов, содержащих карборановые кластеры. Первый борированный фталоцианин 102 был получен реакцией 1-(4-аминофенил)-о-карборана с кобальтовым комплексом тетрасульфонилхлорида фталоцианина. Незамещенные SO3H группы были переведены в натриевые соли для улучшения растворимости в воде [10,87]. Первый детально охарактеризованный водорастворимый борированный фталоцианин 103 был синтезирован из карборанилзамещенного фталонитрила. В этом соединении четыре клозо-карборановых фрагмента ковалентно связаны с фталоцианиновой структурой, В одо растворимость достигнута гидролизом групп метиловых эфиров, за которым последовал ионный обмен с образованием натриевых солей карборанилфталоцианина. Этот борированный фталоцианин, по мнению авторов, может оказаться перспективным для В-НЗТ [88]. Борсодержащие фталоцианины 104-107, имеющие в качестве борной компоненты /шозо-додекаборат, получены взаимодействием моноамино-ундекагидро- лозо-додекаборатного аниона с хлорметил-замещенным фталоцианином. Соединения обладали хорошей водорастворимостью за счет присутствия в молекуле анионов додекабората [89]. Также были проведены первичные биологические испытания этих соединений [90,91]. Помимо этого, был получен борированный фталоцианин 108 на основе цинсодержащего фталоцианина и клозо-додекаборатного аниона и исследованы его фотосенсибилизирующие свойства [92]. Оказалось, что этот препарат проявляет такую же способность к фотосинтетическому окислению, как и большинство фотодинамически активных сенсибилизаторов [93], Биологические испытания показали хорошее накапливание этого соединения в опухоли и высокую эффективность как фотосенсибилизатора in vivo. Молекулярные структуры фталоцианинов устойчивы к воздействию тепловых нейтронов [96]. С этой точки зрения фталоцианины представляются более предпочтительными для В-НЗТ, чем порфирины; однако они крайне фоточувствительны, что ограничивает их практическое использование.
Более того, фталоцианины не подвергаются катаболизму в тканях. Их длительное присутствие в организме может вызывать повреждение тканей, этого недостатка лишены порфирины - компоненты природных метаболитов. Разработаны подходы к созданию конъюгатов природных и синтетических порфиринов с борсодержащими полиэдрами - препаратов, потенцирующих эффект лучевого воздействия на злокачественные опухоли и/или способных вызывать гибель опухолевых клеток самостоятельно. Порфирины и их металлокомплексы обладают рядом уникальных свойств, которые особенно привлекательны в бинарных противоопухолевых стратегиях. Как показали биологические исследования, многие карборанилпорфирины нетоксичны в терапевтических концентрациях. Порфирины, в силу особенностей своей химической структуры (20-членный макроцикл с системой сопряженных связей, наличие кислотных (-NH-) и основных(-Г ) атомов азота, формирующих координационный центр) являются перспективными агентами для доставки бора в опухоль и способны стабилизировать in vivo комплексы с ДНК. Кроме того, легкость их функционализации по периферии макроцикла позволяет изменять гидрофильность/гидрофобность системы в широком диапазоне концентраций. Наличие в порфиринах лабильной системы сопряженных л-связей позволяет понижать потенциальные барьеры окислительно-восстановительных и кислотно- основных реакций, что способствует прохождению лекарственных форм подобных соединений через мембраны клеток. Все эти свойства порфиринов удовлетворяют основным требованиям к противоопухолевм препаратам: преимущественное накопление и длительное задерживание в опухоли, минимальная общерезорбтивная токсичность, высокая фото/радиосенсибилизирующая активность. Желательно, чтобы препарат взаимодействовал с компонентами ядра опухолевой клетки. Большинство карборанилпорфиринов исследованы на моделях трансформированных клеток. Хотя клеточные культуры не заменяют комплексную физиологию организма, данный подход необходим для выявления молекулярных мишеней новых препаратов, установления диапазона цитотоксических концентраций и оценки целесообразности дальнейшей разработки. Применение борированных порфиринов в В-НЗТ и ФДТ позволяет активировать разнообразные механизмы гибели опухолевых клеток, обусловливая перспективность использования этих методов против опухолей, устойчивых к другим воздействиям. Постоянное внимание исследователей к карборанилпорфиринам как классу противоопухолевых соединений позволяет надеяться на создание препаратов для клинического применения. Борированные порфирины относятся к, так называемым, препаратам «третьего поколения», которые пока еще не достигли стадии применения в клинике.
Недостаточная растворимость и определенная токсичность порфиринов затрудняют практическое использование их борсодержащих производных. Высокая стоимость борсодержащих порфиринов также ограничивает их применение. Большинство синтезированных к настоящему времени карборанилпорфиринов проверялось на клеточном уровне и лишь несколько соединений исследовались на животных. Хотя тестирование /л vitro имеет определенные ограничения и не может заменять комплексную физиологию моделей in vivo, данные эксперименты в какой-то степени могут выявить перспективность подобных соединений и целесообразность их дальнейшего изучения. Поэтому представляется важным разработать новые подходы к синтезу коньюгатов синтетических и природных порфиринов с полиэдрическими карборанами и монокарборанами, обладающих повышенной гидрофильностьга и изучить биологические механизмы цитотоксичности новых соединений для опухолевых клеток человека. Исходным соединением в синтезе борированных порфиринов служил 2-формил-5,10,15,20-тетрафенилпорфирин 1 и его металлокомплексы Си (2), Со (3), Ni (4)т Zn (5), Pd (6). Тетрафенилпорфирин получали методом монопиррольной конденсации из пиррола и бензальдегида [97]. Далее в координационную сферу порфирина вводили атом металла с использованием соответствующих ацетатов, Формилирование проводилось взаимодействием металлокомплексов тетрафенилпорфирина с комплексом Вильсмейера с последующим щелочным гидролизом образующейся иммониевой соли и выделением формильных производных [98]. Безметальный -порфирин 1 получали при действии на иммониевую соль кобальтового комплекса концентрированной серной кислоты. Цинковый комплекс 5 получали введением атома цинка в координационную сферу порфирина 1 с помощью соответствующего ацетата, Нами был осуществлен синтез карборанилпорфиринов, содержащих в качестве карборанового заместителя о- и м-карборановые полиэдры, которые связаны с порфириновой системой через атом углерода полиэдра. Главное отличие нашего подхода от предыдущих работ [38, 59, 80] заключается в том, что использование в реакциях литиевых солей производных карборанов позволило получить конечные продукты меньшим числом стадий, чем описанные ранее способы. Мы нашли, что 1-литий-7-изопропил-м-карборан и 1-литий-2-метил-о-карборан реагируют с формильной группой порфиринов 1-3» приводя к образованию после гидролиза соответствующих алкоголятов борированных производных 5,10,15,20-тетрафенилпорфирина 7 11 с выходами 45-60 % [99]. Литийзамещенные карбораны готовили путем металлирования СН-связей 1-изапропил-м-карборана или 1-метил-о-карборана н-бутиллитием (BuLi) в тетрагидрофуране. Строение карборанилпорфиринов доказано физико-химическими методами. Следует отметить, что соединения 7-11 хорошо растворимы в органических растворителях и плохо в воде.
Синтез карборанилпорфиринов на основе протогемина IX
Синтезу борированных производных природных порфиринов как транспортных систем для доставки бора в опухоль, уделяется большое внимание, обусловленное низкой токсичностью и высокой селективностью накопления этих соединений в клетках опухоли [15-17, 28-32]. Одно из наиболее перспективных к настоящему времени среди полученных соединений - калиевая соль тетра-кис-карборанкарбоксильного эфира-2,4-бис-(а,р-дигидроксиэтил) дейтеропорфирина IX (ВОРР). В настоящее время ВОРР проходит I стадию клинических испытаний как препарат для ФДТ, а также рассматривается в качестве потенциального агента для В-НЗТ[19]. Также ранее был разработан метод синтеза карборанилзамещенных производных природных порфиринов - дейтеропорфирина IX и протопорфирина IX [40, 41, 43] - путем активации карбоксильных групп порфирина ди-трея)-бутилпирокарбонатом (ВосгО) или ливалоилхлоридом. Метод позволяет получать нейтральные и анионные борированные аналоги природных порфиринов, в которых борсодержащие полиэдры соединены с порфириновым циклом эфирной или амидной связями. Развитием нашего подхода является создание серии новых карборанил- и монокарборанилпроизводных катионного протогемина IX (41) - важнейшего природного порфирина, входящего в состав гемоглобина в качестве простетической группы. Кроме того, доступность этого соединения позволяет получать на его основе карборанилпорфирины в количествах, необходимых для всесторонних исследований. Следует отметить, что взаимодействие порфирина 41 с различными типами борных полиэдров дает возможность регулировать гидрофильные/гидрофобные свойства борированных производных 41 за счет периферических функциональных групп и ионной природы молекулы в целом. Исследование биологических свойств новых соединений позволило выделить по крайней мере одно - 1,3,5,8-тетраметил-2,4-дивинил-6(7)-[2 -(клозо монокарборан-1-ил)метоксикарбонилэтил]-7(6)-(2-карбоксиэтил)порфиринато железо (III) (49), обладающее выраженной противоопухолевой активностью при отсутствии общерезорбтивной токсичности у экспериментальных животных. При взаимодействии порфирина 41 с нейтральным 9-гидроксиметил-м-карбораном 42 в системе Ру-СНгСІг получен катионныи дикарборанилзамещенныи порфирин 43. Карборан в карборанилпорфирине 44 связан сложноэфирной связью с порфириновым макроцилом через атом бора полиэдра.
Аналогичным методом при реакции 41 с нейтральным 3-амино-о-карбораном 44 был синтезирован карборанилпорфирин 45, в котором карборан связан с порфирином амидной связью через атом бора полиэдра. Выходы продуктов 43 и 45 составили соответственно 71 и 65%. Таким образом, для объединения преимуществ ФДТ (возможность локального воздействия на опухоль без повреждения окружающих тканей, контроль наличия препарата в опухоли по его флуоресценции) и В-НЗТ (лечения глубоко расположенных опухолей или опухолей, диаметр которых превышает 1 см) нами был синтезирован ряд карборанил- и монокарборанилпроизводных протогемина IX, предположительно обладающих двойным действием: неитронзахватным и фотосенсибилизирующим [106,107]. В качестве природного порфирина нами впервые был использован [108] протогемин IX- важнейший природный порфирин, входящий в состав гемоглобина в качестве простетической группы. Отсутствие токсичность в исследованиях как in vitro, так и in vivo (см. главу 3.2.) позволяет предположить, что подобные карборанилпорфирины могут оказаться перспективными агентами для бинарных методов терапий. Правомерно предположить, что новые карборанилпорфирины будут проявлять различную цитотоксичность. Поэтому соединения, способные вызывать гибель опухолевых клеток, могут служить прототипами самостоятельных противоопухолевых препаратов, т.е. использоваться без комбинирования с лучевыми воздействиями. Нетоксичные же соединения как самостоятельные лекарства непригодны и подлежат испытаниям в бинарных методах терапии. В качестве модели исследования цитотоксичности использовали культивируемые клетки опухолей человека А549 (аденокарцинома легких) и К562 (лейкоз). В параллельных экспериментах тестировали токсичность новых соединений для нормальных клеток, используя первичную культуру фибробластов кожи человека (ФКЧ).
Для исследований в культурах клеток новые вещества растворяли в диметилсульфоксиде до концентрации 10 мкМ. Дальнейшие разведения проводили в водных средах; конечная концентрация диметилсульфоксида в культуре клеток составила около 0,1%. Гибель клеток, определяемую по восстановлению клетками 1-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-3,5-дифенилформазана (МТТ-тест), регистрировали через 48-72 час. инкубации клеток с карборанилпорфиринами [109-112]. Вначале провели скрининг всей серии новых соединений на цитотоксичность. Соединения 7, 9, 11, 14, 16-18, 19, 21-23 не вызывали гибель клеток, что является необходимым условием для бинарных методов лечения, в то время как для медных комплексов карборанилпорфиринов (8, 10, 15, 20, 34) наблюдался выраженный цитотоксический эффект для опухолевых клеток. Так, сравнение активности о-метил- и м-изопропил-клозо- и нидо-карборанилпроизводных медного комплекса ТФП (8,10,34) показало, что наибольшую цитотоксичность проявляло соединение 8 (концентрация, вызывающая гибель 50% клеток, составила около 13І0 6 М) (таблица 4). Вещества 10 и 34 также были токсичны для клеток А549 в микромолярных концентрациях. Важно, что медные комплексы проявляют избирательную токсичность только к опухолевым клеткам, в то время как в параллельных экспериментах они нетоксичны для неопухолевых клетках в концентрации до 100 мкМ. Это может быть объяснено преимущественным наличием рецепторов для порфиринов в опухолевых клетках. Данное направление сейчас активно исследуется в литературе. Наиболее токсичным оказалось соединение 37, которое в низких микромолярных концентрациях (IC50 5 мкМ) вызывало гибель клеток рака толстой кишки НСТ116, предстательной железы LNCaP, лейкоза К562, меланомы FEMX и аденокарциномы яичника А2780. Это соединение исследовано как самостоятельный препарат (см. ниже). Исходя из первичных биологических исследований, создается общее представление о том, что именно медные комплексы карборанилпорфиринов обусловливают цитотоксичность. Хотя для окончательного суждения о преимущественной гибели опухолевых клеток в сравнении с неопухолевыми требуются дополнительные исследования не только на фибробластах, но и нормальных клетках различного тканевого происхождения, приведенные результаты указывают на то, что медные комплексы карборанилпорфиринов перспективны для исследований в онкологии. Поэтому для изучения механизма противоопухолевого эффекта этого класса соединений использован комплекс монокарборанового производного 5,10,15,20-тетрафенилпорфирина 37 и для сравнения близкие по структуре комплексы 36 и 38. Противоопухолевую активность новых карборанилпорфиринов определяли с помощью МТТ-теста. Цитотоксичность препаратов выражали в ЮБО концентрации, вызывающей гибель 50% клеток. Установлено, что вещество 37 наиболее активно: для линии рака молочной железы MCF-7 цитотоксичность убывала в ряду 37 (4+2) 38 (25+3) = 36 (24+2 мкМ) 2 (52+4) 35 ( 100) (в скобках - средние величины Ю5о и стандартные отклонения, мкМ; данные 3-х экспериментов) (рис. 2)
Биологическая активность карбораниллорфиринов на основе природных порфиринов
Увеличение количества вводимого препарата до 5 мг/кг способствовало повышению эффективности ФДТ. Это проявлялось в статистически значимом снижении коэффициента абсолютного прироста опухоли на протяжении всего срока наблюдения {21 суток) На 3 сутки у 8 из 9 животных наблюдалось не только замедление темпа роста опухоли по сравнению с контролем, но и уменьшение ее объема по сравнению с исходным. То есть наступала частичная ее регрессия. Полная регрессия опухоли имела место у 22,3% крыс. Проведение ФДТ с использованием фотосенсибилизатора в дозе 10 мг/кг в целом привело к увеличению ее эффективности относительно контроля. Также, как и при введении препарата в дозе 5 мг/кг, имелось статистически достоверное снижение коэффициента абсолютного прироста опухоли на всех сроках исследования результатов ФДТ между группами животных, которым вводили 5 мг/кг и 10 мг/кг, процент ТРО в последнем случае был выше и составлял: на 3 сутки 58,2% против 31,6% при дозе 5 мг/кг; на 7 сутки 81,0% против 16,5%; на 10 сутки 72,0% против 24,8%; на 14 сутки 78,3% против 47,1% и 73,6% против 45,0% на 21 сутки. Таким образом применение препарата 49 для ФДТ приводит не только к статистически значимому торможению роста опухоли по сравнению с контролем, но и к значительной регрессии опухоли. При этом наиболее эффективной для ФДТ оказалась доза в 20 мг/кг массы животного (рис 4). Растворители для реакций готовили согласно стандартным методикам. Реагенты из Sigma-Aldrich Fine Chemicals использовались без дальнейшей очистки. Реакции проводили в атмосфере аргона Индивидуальность полученных соединений и ход реакции контролировали тонкослойной хроматографией на пластинках Silufol UV - 254 (Kavalier, Чехословакия) и DC-AIufolien Aluminium oxid 60 F254 neutral (Тур E) (Merck) Очистку полученных веществ проводили методом и колоночной хроматографии на силикагеле Merck L 0.040-0.063 и L40/100 (Чехословакия). ИК-спектры получены в таблетках КВг и в вазелиновом масле на приборе UR-20. Электронные спектры сняты на спектрофотометре JASCO UV/VIS-7800. Спектры 1Н и 11В ЯМР регистрированы на спектрометре Bruker АМХ - 400 в дейтерохлороформе CDCI3 и дейтероацетоне (С03)г)СО с рабочей частотой 400 МГц. Масс-спектры получены на время-пролетном масс-спектрометре Reflex III фирмы Bruker методом MALDI с использованием 2,4,5- тригидроксиацетобензойной матрицы. Общая методика получения о-метил- и м-изопропил-клозо-карборанилпроизводных 5,10,15,20-тетрафенилпорфирина (7-11).
К раствору 0.1 ммоль соответствующего формилпорфирина в 10 мл тетрагидрофурана прибавляли при 20 суспензию литийпроизводного (получали прибавлением гексанового раствора бутиллития (0.4 ммоль, 1.3М) к раствору 0.4 ммоль клозокарборана в 5 мл тетрагидрофурана в токе аргона), перемешивали 1 час в токе аргона. Реакционную массу выливали в 15 мл воды, экстрагировали хлористым метиленом (3 5) мл. Растворитель отгоняли в вакууме, остаток очищали на колонке с силикагелем (1 20) см, элюент- хлороформ-гексан (1:1), хлороформ. 2-(ю7озо-1 -Изопропил-лт-карборанил)гидроксиметил-5,10,15,20-тетрафенилпорфирин (7). Из 64 мг (0.1 ммоль) формилпорфирина 1, 74 мг (0.4 ммоль) клозо-м-изопропилкарборана и 0.3 мл бутиллития получили 51 мг (57.3%) соединения 7. ИК-спектр (пленка), v, см"1: 3602(ОН), 2930. 2859 (СН порфирина), 2591 (ВН) Электронный спектр (СНСІз), Xmax, нм, (є 10"3) : 420.1 (197.0), 517.6(27.0), 560.2(11.6), 597.2(10.1), 651.0(7.5). 1Н ЯМР - спектр ((CD3)2)CO, S, м.д.: -2.65 уш.сигн. (2Н, NH); 0.94 д. (ЗН, СН3, j = 7.0 Гц); 0.97 д. (ЗН, СН3, j = 7.0 Гц); 1.41 м. 1Н, СН(СН3)2, j = 7.0 Гц); 3.05 уш.сигн. (1Н. ОН); 3.46 д. (1Н, СН-ОН, j = 8.2 Гц); 7.23-8.26 м. (20 Н, Рп); 8.57, с, (1Н, р-пиррол); 8.74, с, (6Н, р-пиррол). Масс-спектр, m/z :831 [М]+ [2-(клозо-1 -Изопропил-м-карборанил)гидроксиметил-5,10,15,20-тетрафенилпорфиринато] медь(М) (8). Из 70 мг (0.1 ммоль) формилпорфирина 2, 74 мг (0.4 ммоль) клозо-м-изопропилкарборана и 0.3 мл бутиллития получили 51 мг (57.3%) соединения 8. ИК-спектр (пленка), v, см"1: 3605(ОН), 2960 (СН порфирина), 2590 (ВН) Электронный спектр (СНСІз), W, нм, (ЕЮ"3) : 421.2(145.6), 547.0(8.9), 584.3(3.6). Масс-спектр, m/z :890.5 [М]+ [2--(клозо-1 -Изопропил-м-карборанил)гидроксиметил-5,10,15,20-тетрафенилпорфиринато] кобальт(П) (9). Из 70 мг (0.1 ммоль) формилпорфирина 3, 74 мг (0.4 ммоль) клозо-м-изопропилкарборана и 0.3 мл бутиллития получили 48 мг (54.2%) соединения 9. ИК-спектр (пленка), v, см"1: 3630(ОН), 2840 (СН порфирина), 2610 (ВН) Электронный спектр (СНСІз). W, нм, (єІО"3): 416.0(137.6). 549.4(16.8), 591.0(6.7). Масс-спектр, m/z :886 [М-1]+ [2-(ллозо-1 -Метил-о-карборанил)гидроксиметил-5,10,15,20-тетрафенилпорфиринато]медь(П) (10). Из 70 мг (0.1 ммоль) формилпорфирина 2, 63 мг (0.4 ммоль) клозо-о-метилкарборана и 0.3 мл бутиллития получили 46 мг (53.4%) соединения 10. ИК-спектр (пленка), v, см"1: 3615(ОН), 2983 (СН порфирина), 2576 (ВН) Электронный спектр (СНСЬ), XmsXl нм, {єіО 3) : 419.0(158.5), 544.4(9.3), 583.4(3.8).
Масс-спектр, m/z :861.5 [М-1]+ [2-(«лозо-1 -Метил-о-карборанил)гидроксиметил-5,10,15,20-тетрафенилпорфиринато] кобальт(Н) (11). Из 70 мг (0.1 ммоль) формилпорфирина 3, 63 мг (0.4 ммоль) клозо-о-метилкарборана и 0.3 мл бутиллития получили 40 мг (46%) соединения 11. ИК-спектр (пленка), v, см"1: 3610(ОН), 2975 (СН порфирина), 2580 (ВН) Электронный спектр (СНСЬ), Хтах, нм, (єЮ 3) : 415.1(127.0), 545.6(22.4), 587.3(12.7). Масс-спектр, m/z :858 [М-1]+ 9-Изоцианато-о-карборан (12) 1 г (5,3 ммоль) 9-о-карборанкарбоновой кислоты растворяли в 7 мл хлористого тионила и кипятят 2 часа. Избыток хлористого тионила отгоняли в вакууме, продукт сушили при 1 мм Нд 1 час. Затем к полученному хлорангидриду прибавляли 12 мл абсолютного толуола и 1 мл (10 ммоль)триметилсилилазида и кипятили 1-2 часа в атмосфере аргона. Растворитель упаривали, остаток растворяли в 50 мл этилацетата, промывали водой, органический слой отделяли, сушили над сульфатом натрия, упаривали. Кристаллизовали из гептана. Выход: 0,7 г (71,2%). Т. плавления - 156-157 ИК-спектр:3072 (СН), 2613 (ВН), 2313(NCO). ЯМР 1Н (CDCI3), 5, м.д. : 4,56 (с, 2Н, СН карборана); 4,48 (с, 2Н, СН карборана); 3,10-1,15 (уш.с, 9Н, ВН). ЯМР "В (CDCI3), 6, м.д. : 3,96 (с, 1В, В9); -2,87 (д, 1В, J = 145 Гц, В12); -9,24 (д, 2В, J = 150 Гц, В8 10); -13,63 (д, 2В, J = 160 Гц, В4 5); -14,85 (д, 2В, J = 160 Гц, В7 11); -15,56 (д, 2В, J = 180 Гц, В3,6). Элементный анализ: СзВюНцЫО; вычислено: В 58,38%, N 5,94% найдено В 57,69%, N 5,26% 9-Изоцианато-м-карборан (13) Получали аналогично соединению 12 Выход: 0,8 г (81,5%).Т. плавления - 131-132 ИК-спектр: 3070 (СН), 2602 (ВН), 2309{NCO). ЯМР 1Н (CDCI3), 5, м.д. : 3,68 (с, 2Н, СН карборана); 3,0-1,4 (уш.с, 9Н, ВН). ЯМР 11В (CDCI3), 5, м.д. : -1,77 (с, 1В, В9); -6,53 (д. 2В, J = 165 Гц, В5 12); -10,15 (д, 1В, J = 151 Гц, В10); -12,99 (д, 2В, J = 166 Гц, В4 8); -14,51 (д, 2В, J = 168 Гц, В6-11); -17,87 (д, 1В, J = 179 Гц, В3); -21,94 (д, 1В, J = 180 Гц, В2). Элементный анализ: C3Bi0HnNO; вычислено: В 58,38%, N 5,94% найдено В 56,58%, N 5,33% Общая методика синтеза клозо-9-изоцианато-о- и 9-изоцианато-м-карборанилпроизводных5,10,15,20-тетрафенилпорфирина. К раствору 0.1 ммоль соответствующего формилпорфирина в 10 мл тетрагидрофурана прибавляли 0.2 ммоль литиевой соли 9-изоцианато-о- или 9-изоцианато-м-карборана (получали прибавлением гексанового раствора литийдиизопропиламида в тетрагидрофуране (0.1 ммоль, 1.3М) к раствору 0.1 ммоль соответствующих карборанов (12, 13) в 5 мл тетрагидрофурана в токе аргона), перемешивали 1 час в токе аргона. Реакционную массу выливали в 15 мл воды, экстрагировали хлористым метиленом (3 5) мл. Растворитель отгоняли в вакууме, остаток очищали на колонке с силикагелем (1 20) см, элюент-хлороформ-гексан (1:1), хлороформ.
