Содержание к диссертации
Введение
II. Обзор литературы 9
1. Nematostella vectensis – особенности жизненного цикла, эмбрионального и личиночного развития. 9
1.1 Бесполое размножение Nematostella 10
1.2 Эмбриональное развитие Nematostella 10
2. Осевая организация Nematostella 13
3. Регион-организатор в развитии Nematostella 15
4. Регенерация Nematostella 17
5. Обзор исследований по диссоциации-реагрегации. 18
5.1. Эксперименты по диссоциации-реагрегации клеток взрослых особей (полипов и медуз) 18
5.1.1. Эксперименты по диссоциации – реагрегации клеток колониальных гидроидов 19
5.1.2. Эксперименты по диссоциации-реагрегации клеток гидроидного полипа Hydra 21
5.1.3. Эксперименты по диссоциации - реагрегации клеток гидромедуз 22
5.1.4. Эксперименты по диссоциации-реагрегации клеток Anthozoa и Scyphozoa 23
5.2 Развитие агрегатов эмбриональных клеток книдарий 25
5.3 Клеточные и молекулярные механизмы, обеспечивающие восстановление плана строения в экспериментах с агрегатами клеток книдарий. 27
5.3.1. Развитие агрегата может зависеть от происхождения составляющих его клеток. 27
5.3.2. Роль пролиферации клеток, межклеточной адгезии и подвижности клеток в развитии агрегатов Hydra 30
5.3.3. «Организатор гипостома» и восстановление плана строения полипа Hydra 32
III. Материалы и методы 37
1.Культивирование и индукция гаметогенеза 37
2.Эксперименты по диссоциации эмбрионов и последующей агрегации их клеток. 38
3.Микрохирургические манипуляции с эмбрионами 38
4. Цейтраферная съёмка живых агрегатов 40
5.Конфокальная микроскопия 40
6. In situ гибридизация 42
6. Эксперименты с использованием морфантов 46
7. Методы световой и электронной микроскопии 47
9.Используемые растворы 49
IV. Результаты 51
1. Морфологическое развитие агрегатов. 51
2. Формирование орально-аборальной полярности на молекулярном уровне 54
3. Роль гена brachyury в формировании орально-аборальной полярности 55
5. Проспективные потенции разных регионов эмбриона вдоль орально-аборальной оси тела 56
6. Сегрегация зародышевых листков и формирование эндодермы. 57
7. Потенции зародышевых листков к развитию и трансдифференцировке. 58
7. Роль белка Сadherin-3 в развитии агрегатов . 59
V. Обсуждение 62
1. Формирование орально-аборальной полярности у агрегатов 63
2. Роль Cadherin-3 в развитии агрегатов. 66
3. Потенции клеток зародышевых листков к развитию и трансдифференцировке 67
4. Самоорганизация эмбриональных клеток Nematostella vectensis 68
5. Пластичность развития Nematostella 70
VI. Выводы 75
VII. Заключение 77
VIII. Список сокращений и условных обозначений 79
IX. Список Литературы 81
Приложение 1. Таблицы 100
Приложение 2. Рисунки 102
- Эмбриональное развитие Nematostella
- «Организатор гипостома» и восстановление плана строения полипа Hydra
- Роль белка Сadherin-3 в развитии агрегатов
- Пластичность развития Nematostella
Введение к работе
Актуальность работы. Вопрос о реализации спектра проспективных потенций эмбриональными клетками является одним из фундаментальных в биологии развития. Изучение этой проблемы позволяет лучше понять общие закономерности эмбриогенеза, а также выявить “скрытые” механимы регуляции развития.
Метод диссоциации-реагрегации [Wilson, 1907; 1911] позволяет оценить регуляторный потенциал эмбрионов в условиях, когда первичный план строения полностью разрушен и формируется заново. Особый интерес представляет вопрос о том, сохраняют ли отдельные клетки информацию о своём изначальном положении в организме или они способны изменить свою судьбу под действием регионов-организаторов.
Nematostella vectensis - представитель типа книдарий, сестринской группы билатерально симметричных животных. Этот вид является модельным объектом биологии развития. N. vectensis легко культивируется в лаборатории [Fritzenwanker, Technau, 2002], её геном полностью отсеквенирован, многочисленные работы посвящены молекулярным и морфогенетическим аспектам её развития [Finnerty et al.2004; Fritzenwanker et al. 2004; Extavour et al. 2005; Kusserow et al. 2005; Torras, Gonzales-Crespo, 2005; Kraus, Technau, 2006; Saina et al., Layden et al.2016]. Несмотря на то, что для эмбрионов Nematostella была выявлена высокая способность к регуляции развития [Fritzenwanker et al., 2002], спектр проспективных потенций отдельных клеток эмбрионов все еще остается неисследованным.
Исследование регуляторного потенциала на модельном виде книдарий имеет большой интерес для эволюционной биологии развития, так как позволяет глубже понять механизмы регуляции развития низших многоклеточных животных, а также способен пролить свет на раннюю эволюцию эмбрионального развития.
Степень разработанности темы. Восстановление организма из диссоциированных клеток является довольно редким явлением, описанным только для нескольких групп животных: губок, книдарий, иглокожих и хвостатых амфибий [Wilson, 1907; Wilson, 1911; Dan-Sohkawa et al., 1986; Nieuwkoop, 1992]. Кроме того, работы, посвященные этому процессу, касаются только морфологических аспектов, и молекулярные механизмы этого явления остаются не изученными. Нормальный эмбриогенез Nematostella vectensis довольно подробно описан, тем не менее, регуляционный потенций эмбриональных клеток данного вида не был изучен.
Цель и задачи исследования.
Цель диссертационной работы - охарактеризовать регуляторный потенциал эмбриональных клеток актинии Nematostella vectensis с помощью экспериментов по диссоциации-реагрегации.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие
задачи:
-
Изучить морфогенетические процессы, обеспечивающие регуляцию развития агрегированных эмбриональных клеток N. vectensis;
-
Сравнить развитие агрегатов N. vectensis с нормальным развитием этого вида и с развитием других представителей типа стрекающих;
-
Выявить молекулярные механизмы формирования полярности в агрегатах;
-
Изучить проспективные потенции разных регионов эмбриона, расположенных вдоль орально-аборальной оси тела в экспериментах по диссоциации-реагрегации;
-
Изучить проспективные потенции клеток двух зародышевых листков в экспериментах по диссоциации-реагрегации;
Научная новизна полученных результатов. В результате проделанной работы была впервые показана способность агрегированных эмбриональных клеток N. vectensis к восстановлению первичного плана строения и формированию зародышевых листков. С помощью методов иммуноцитохими, конфокальной микроскопии, сканирующей электронной микроскопии и цейтраферной съемки было подробно изучено развитие агрегатов на молекулярном, клеточном и тканевом уровнях. Были выявлены морфогенезы и основные сигнальные пути, вовлеченные в формирование орально-аборальной полярности de novo. Благодаря использованию трансгенных линий, в развивающемся агрегате удалось проследить за судьбой эндодермальных клеток, а также впервые на молекулярном уровне показать способность эктодермальных клеток к трансдифференцировке в клетки эндодермы. Был проведён сравнительный анализ развития агрегатов N. vectensis и нормального эмбриогенеза этого вида и других представителей книдарий.
Теоретическое и практическое значение. Агрегаты N. vectensis являются удобной моделью для изучения регуляторного потенциала эмбриональных клеток. В ходе диссоциации эмбрионов разметка тела полностью ''сбрасывается'' и ее формирование начинается de novo. Это позволяет в полной мере описать спектр проспективных потенций клеток эмбрионов. Исследование
альтернативных морфогенезов, вовлеченных в развитие агрегатов, и сравнение их с нормальным развитием этого и других видов книдарий, помогает лучше понять эволюцию эмбрионального развития многоклеточных животных. Предложенная модель агрегированных эмбриональных клеток N. vectensis может быть в дальнейшем использована для исследования спектра проспективных потенций эмбриональных клеток. Полученные в диссертационной работе результаты могут быть использованы в рамках лекций по эмбриологии в высших учебных заведениях.
Личный вклад автора. Личный вклад автора состоял в анализе литературных данных, планировании и выполнении экспериментов, анализе и интерпретации полученных результатов, подготовке данных для публикаций и представлении результатов исследований на международных конференциях соответствующей тематики. Основные результаты работы получены лично автором. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях.
Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность полученных данных обеспечивается корректным использованием современных методов исследования. Особи Nematostella vectensis содержались в оптимальных условиях на всех стадиях онтогенеза. При фиксации и подготовке образцов для исследования методами иммуноцитохими, конфокальной и электронной микроскопии были использованы корректные протоколы. Все эксперименты были проведены в достаточном количестве повторностей. Полученные фото- и видеоизображения подвергались лишь незначительной корректеровке, затрагивающей все пикселы изображения.
Результаты проделанной работы были представлены автором форме устных (4) и стендовых (4) докладов в ряде международных конференций: 1) Международная конференция The fourth meeting of the European Society for Evolutionary Developmental Biology (EED) (Лиссабон, Португалия 2012); 2) Международная научная школа Summer School in Evolutionary Developmental Biology. Conceptual and Methodological Foundations, 3rd Edition. From Gene Networks to Organismal Systems (Венеция, Италия, 2013); 3) Международная конференция The fifth meeting of the European Society for Evolutionary Developmental Biology (Вена, Австрия, 2014); 4) Международная научная школа OIST Winter Course "Evolution of Complex Systems" (Онна-Сон, Окинава, Япония, 2014); 5) Международная научная школа EMBO Practical Course: Multilevel Modelling of Morphogenesis (Норидж, Великобритания, 2015); 6). Международная научная школа 3D developmental imaging (Оэйраш, Португалия, 2016); 7) Международная конференция The sixth meeting of the
European Society for Evolutionary Developmental Biology (EED) (Уппсала, Швеция. 2016); 8) Международная научная школа International Workshop. The diversification of early emerging Metazoans: a window into animal evolution? (Тутцинг, Германия 2017)
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ, из них статей в журналах, соответствующих Перечню ВАК 1, статей в иностранных рецензируемых журналах 1, тезисов докладов и материалов конференций 3.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 116 страницах, содержит 17 рисунков, 2 таблицы и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение, выводы и список литературы. Библиография включает 160 источников.
Эмбриональное развитие Nematostella
Полипы Nematostella - раздельнополые животные. Взрослые особи, и самки, и самцы, имеют 8 мезентериев - складок гастродермы, и гаметогенез происходит непосредственно в них. Самки Nematostella через ротовое отверстие выбрасывают слизистые шнуры, содержащие яйцеклетки.
В целом, ранний эмбриогенез Nematostella vectensis отличается большой вариабельностью. Например, различно расположение бластомеров относительно друг друга после первых делений дробления; первый цитокинез может завершиться уже после первого деления ядер, но нередки случаи, когда цитотомия происходит только после второго или третьего кариокинеза, а также в результате дробления образуются бластомеры разной величины.
Начиная со стадии 16 клеток, начинается эпителизация, и между клетками появляются точечные адгезионные контакты [Fritzenwanker et al., 2007]. На стадии бластулы наблюдаются субапикальные адгезионные контакты. Апико-базальная протяженность этих контактов уменьшается в клетках презумптивной эндодермы, вовлеченных в инвагинационные процессы [Kraus, Technau, 2006; Magie et al., 2007]. На ранних стадиях эмбриогенеза у Nematostella нет септальных контактов [Magie et al., 2007], щелевые контакты тоже не были обнаружены [Mackie et al., 1984 цит. по Magie, 2008]. К тому же, у Nematostella отсутствуют гены коннексина и паннексина, белков, входящих в состав щелевых контактов. Интегрины, найденные у всех многоклеточных животных, позволяют клетке взаимодействовать с внеклеточным матриксом. Они существуют в виде гетеродимеров и состоят из альфа и бета субъединиц. У Nematostella есть как минимум 2 альфа и 5 бета субъединиц, хотя количество существующих гетеродимеров у данного вида не известно [Magie, 2008].
Через 6-10 часов после оплодотворения у Nematostella образуется целобластула. Затем на стадии 7-12 часов развития поверхность эмбриона проходит 4-5 циклов впячиваний и выпячиваний, строго сопряженных с клеточными циклами. Экспериментальные данные показали, что зона впячивания совпадает с анимальным полюсом зиготы и соответствует зоне формирования бластопора, а, следовательно, и оральному полюсу полипа [Fritzenwanker et al., 2007]. После 12 цитокинеза пульсации прекращаются, деления клеток становятся асинхронными, и в результате формируется округлая прегаструла. Гаструляция начинается через 18-20 часов после оплодотворения, а хорошо сформированный бластопор можно наблюдать через 21-23 часа (Рисунок 2 В). Обычно инвагинация происходит только в одной зоне эмбриона, хотя изредка возможно наличие одного или двух зачаточных очагов инвагинации [Fritzenwanker et al., 2007]. Гаструляция начинается с формирования преэндодермальной пластинки, содержащей клетки презумптивной эндодермы. Эти клетки начинают эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП): они приобретают колбовидную форму, формируя ламеллоподии и филоподии на своем базальном конце; ядра мигрируют из апикальной в базальную часть клетки, и площадь субапикальных контактов уменьшается. Показано, что ген snail, консервативный регулятор ЭМП, экспрессируется в клетках преэндодермальной пластинки N. vectensis. [Fritzenwanker et. al. 2004]. Клетки бластодермы, находящиеся вокруг преэндодермальной пластинки, формируют губу бластопора, а сам бластопор формируется при инвагинации преэндодермальной пластинки. Преэндодермальная пластинка никогда не имеет правильной округлой формы, и форма бластопора очень изменчива. Существует две точки зрения на дальнейшую судьбу клеток преэндодермальной пластинки Nematostella. Исследования Краус и Технау показали, что после инвагинации клетки преэндодермальной пластинки завершают ЭМП, ослабляя контакт с внутренним краем губы бластопора [Kraus, Technau, 2006]. Согласно этим авторам, преэндодермальная погружается внутрь пассивно, выталкиваясь в глубину бластоцеля заворачивающейся внутрь губой бластопора. Через 12 часов после начала гаструляции все клетки завершают ЭМП, и бластопор замыкается. Маги с соавторами полагают, что гаструляция протекает только посредством инвагинации, и ЭМП клеток преэндодермальной пластинки не доходит до конца [Magie et al., 2007]. Основным механизмом инвагинации они считают подтягивание преэндодермальной пластинки к аборальному полюсу при помощи базальных филоподий колбовидных клеток. Не исключено, что у Nematostella vectensis гаструляция обладает внутривидовой изменчивостью.
В течение следующих 12 часов эмбрион превращается в планулу (Рисунок 2 Г). Личинка обладает антеропостериорной осью, теменным султанчиком и глоткой. Глотка планулы формируется из материала губы бластопора и эндодермы, образовавшейся в результате инвагинации. Начало метаморфоза определяется реорганизацией эндодермы планулы, что приводит к появлению мезентериев. Затем в оральной области зародыша образуются четыре щупальцевых почки, в гастральной полости формируются радиальные мезентеральные камеры, редуцируется теменной султанчик. Личинка приобретает способность к мышечному сокращению, прекращает плавать и оседает на субстрат. Метаморфоз завершается к 5-10 дню после оплодотворения и приводит к формированию первичного полипа (Рисунок 2 Д) [Fritzenwanker, Technau, 2002].
«Организатор гипостома» и восстановление плана строения полипа Hydra
Анализируя результаты экспериментов по диссоциации – реагрегации клеток Hydra, исследователи пришли к выводу, что основную роль в восстановлении плана строения полипа играют явления, близкие к самоорганизации. Под самоорганизацией здесь понимаются процессы, в ходе которых сложная пространственная структура системы как целого формируется за счет коллективного взаимодействия элементов более низкого структурного уровня [Camazine et al., 2003]. Это значит, что у системы спонтанно понижается порядок пространственной (макроскопической) симметрии, т. е. возникают новые морфологические признаки [Черданцев, 2003]. Так, орально - аборальная полярность агрегата клеток гидры устанавливается за счет того, что случайно формирующиеся de novo зачатки оральных структур «организуют» клетки близлежащих областей агрегата [Gierer et al., 1972; Sato et al., 1992; Technau, Holstein, 1992]. Сходным образом в экспериментах Сато [Sato et al., 1992] гипостом полипа формировался именно в том месте агрегата, сделанного из клеток аборальной половины полипа, куда подсаживался небольшой кусочек гипостома гидры. Действительно, кончик гипостома гидры является регионом-организатором [Browne, 1909; Bode, 2012]. Известно, что ткани гидры постоянно обновляются за счет хорошо развитой системы стволовых клеток [Bode et al., 1986; Bode, 1996; Bosch, 2007, 2009; Watanabe et al., 2009]. Кроме того, во время бесполого размножения (при формировании дочерних почек) всё время происходит образование новых оральных полюсов. Таким образом, постоянное функционирование организатора необходимо взрослому полипу гидры для поддержания нормальной осевой организации [Bode, 2012]. Поэтому не удивительно, что при развитии агрегатов первым шагом к восстановлению нормальной полярности и плана строения является формирование «организаторов головы» de novo.
Более детально активность регионов - организаторов при развитии агрегатов Hydra изучили Технау с соавторами [Technau et al., 2000]. В эксперименте у полипов перед диссоциацией удаляли оральные концы. К полученной суспензии клеток добавляли кластеры меченых клеток размером 60 – 120 мкм (10 – 180 клеток). Эти кластеры были получены при диссоциации - реагрегации регенерирующих оральных концов полипов, т.е. участков, заведомо обладающих свойствами региона-организатора. Находясь в составе агрегата, эти кластеры экспрессировали гены, характерные для «организатора головы» (кончика гипостома) гидры -hybra1 (ортолог гена brachyury, принадлежащего к семейству T-box транскрипционных факторов) и hywnt3 (сигнальная молекула) [Technau et al., 2000]. Сначала области их экспрессии выглядели как точки, состоящие всего из нескольких клеток. Затем области экспрессии hybra1 и hywnt3 расширялись и достигали размера, сравнимого с размером гипостома. Впоследствии каждая такая область действительно давала начало гипостому. Было показано, что для формирования организатора необходимым и достаточным является кластер из 5 - 15 клеток [Technau et al., 2000]. При использовании в эксперименте кластеров клеток разного размера, начало гипостому, как правило, давал самый большой кластер. Это указывало на то, что более крупный кластер может ингибировать кластер меньшего размера. При этом вероятность формирования оральных структур в области кластера меньшего размера зависела от расстояния между ним и другими подсаженными кластерами. Было показано, что ингибирование происходит только тогда, когда расстояние между кластерами не превышает 800–900 мкм. Это значительно больше того расстояния, на котором организатор может вовлекать клетки в формирование оральных структур (всего 45 мкм) [Technau et al., 2000].
В другом эксперименте изучалось формирование организатора de novo в агрегатах, полученных из тела гидры, лишенной подошвы и «головы», т. е., в этом эксперименте «кластеры–организаторы» в суспензии клеток отсутствовали [Hobmayer et al., 2000]. Была охарактеризована динамика экспрессии двух компонентов Wnt – сигнального пути: hytcf и hywnt3. Через 24 ч. после начала агрегации, после того как завершалась сегрегации двух зародышевых листков, в агрегате обнаруживались группы из 10-20 клеток, экспрессирующих hywnt3. В дальнейшем на месте каждой области экспрессии hywnt3 формировались гипостомы полипов. Специфичная экспрессия hytcf наблюдалась на 24 ч. позже, чем hywnt3: через 24 ч. после агрегации hytcf экспессировался во всех эпителиальных клетках агрегата, и лишь через 48 ч. после начала эксперимента зона экспрессии разделялась на несколько пятен, которые и соответствовали сформировавшимся de novo регионам–организаторам.
Все данные по молекулярным основам формирования полярности у агрегатов клеток гидры хорошо интерпретируются с помощью реакционно-диффузионных моделей формирования пространственных структур. Впервые такую модель (систему дифференциальных уравнений) предложил Тьюринг [Turing, 1952], а дальнейшее развитие этого направления связано с именами Гирера и Майнхардта [Gierer, Meinhardt, 1972]. Фактически модель Гирера и Майнхардта была создана благодаря анализу данных по регенерации полипа Hydra, избранного группой молодых биологов и физиков, работавших в 1960 – 1970-х г. в г. Тюбинген (Германия), в качестве идеального объекта для изучения физических основ биологического формообразования [Gierer, 2012]. Восстановление плана строения полипа Hydra из агрегата клеток они считали «предельным случаем» регенерации и придавали большое значение данным, полученным при анализе этой системы [Gierer, 2012].
Тьюринг показал, что взаимодействие двух химически активных веществ, обладающих разной скоростью диффузии, может генерировать в исходно гомогенной системе локальные максимумы их концентраций [Turing, 1952]. В соответствии с теорией формирования биологических структур Гирера – Майнхардта самоорганизация в исходно гомогенной системе возможна только при наличии нелинейных взаимодействий близкодействующего (т.е. медленно диффундирующего) активатора и дальнодействующего (т.е. быстро диффундирующего) ингибитора. Активатор способен к автокатализу, и он же стимулирует продукцию ингибитора, а ингибитор подавляет продукцию активатора [Gierer, Meinhardt, 1972].
В то время, когда создавалась эта теория, о молекулярных основах формирования пространственной структуры в агрегате клеток гидры еще ничего не было известно. К настоящему времени охарактеризован целый ряд молекул, которые полностью или отчасти удовлетворяют требованиям, предъявляемым моделью Гирера – Майнхардта к активатору и ингибитору. Как известно, ключевую роль в формировании и поддержании плана строения книдарий играет сигнальный Wnt-каскад [Holstein, 2008; 2013]. Структура генетических регуляторных сетей гидры, в которые входят компоненты этого каскада, до сих пор до конца не исследована, однако показано, что этот каскад способен к самоорганизации и саморегуляции [Nakamura et al., 2011]. Это значит, что его архитектура определяется и поддерживается системой прямых и обратных связей между молекулами-компонентами каскада, и та же система обратных связей позволяет регулировать концентрацию этих молекул. Роль «активаторов» часто приписывают таким молекулам как b-catenin и Wnt3 [Holstein et al., 2003; Nakamura et al., 2011; Meinhardt, 2012]. Предполагается, что эти молекулы вместе с продуктом гена brachyury (транскрипционный фактор) образуют петлю положительной обратной связи, поддерживая экспрессию друг друга [Meinhardt, 2012]. Гораздо меньше известно о работе компонентов Wnt-каскада, играющих роль «ингибиторов». Одним из таких ингибиторов у гидры может быть Dickkopf (Hydkk1/2/4), растворимый антагонист Wnt [Augustin et al., 2006; Guder et al., 2006], который, однако, не удовлетворяет всем требованиям, предъявляемым теорией к «дальнодействующему ингибитору» [Meinhardt, 2012]. Таким образом, изучение молекулярных механизмов регуляции развития агрегатов гидры еще далеко от завершения.
Молекулярные механизмы формирования полярности у агрегатов книдарий все еще не до конца понятны и требуют дальнейшего изучения. К сожалению, данные по паттернам экспрессии генов в агрегатах клеток книдарий приводятся только в двух работах, описывающих развитие агрегатов гидры [Technau et al., 2000; Hobmayer et al., 2000]. Учитывая эти данные, а также данные, полученные при изучении нормального развития и регенерации книдарий [Duffy et al., 2010; Galliot, Chera, 2010; Trevino et al., 2011], мы можем предположить, что ключевую роль в формировании нормального плана строения при развитии агрегатов играет Wnt -сигнальный путь. Однако, для того чтобы подтвердить или опровергнуть это предположение, необходимо дальнейшее изучение развития агрегатов, полученных как из дефинитивных, так и из эмбриональных клеток книдарий методами молекулярной биологии.
Роль белка Сadherin-3 в развитии агрегатов
Кадгерины являются кальций-зависимыми трансмембранными белками. Многочисленные исследования указывают на то, что они играют значительную роль в раннем эмбриогенезе животных [Nelson, Fuchs, 2010] и участвуют в специфической клеточной адгезии [Takeichi, 1990; van Roy, Berx, 2008]. У Nematostella vectensis было обнаружено 16 генов кадгеринов [Hulpiau, van Roy, 2011], три из которых являются классическими. Сadherin -3 имеет наиболее выраженную экспрессию в раннем развитии N.vectensis, поэтому мы решили изучить его возможную роль в формировании и развитии агрегатов.
Сначала, мы изучили локализацию этого белка, используя метод иммуноцитохимии. В нормальном развитии первая локализация Cadherin-3 появляется еще на стадии дробления. На стадии поздней бластулы Cadherin-3 локализуется полярно как на апикальной, так и на базальной поверхности клеток. Во время гаструляции Cadherin-3 исчезает с поверхностей клеток эндодермы, и сохраняется только у эктодермальных клеток [Pukhlyakova et al. 2016].
При помощи конфокальной микроскопии мы выявили, что клетки после диссоциации утрачивали полярность расположения Cadherin-3 (Рисунок 16 А). После реагрегации мы обнаружили точечную локализацию этого белка только на апикальных поверхностях клеток с морфологически выраженной эпителиальной полярностью (Рисунок 16 Б). По мере эпителизации поверхностного слоя агрегата, зона локализации Cadherin-3 увеличивала площадь, а по мере формирования базальной мембраны появлялась на базальной поверхности наружных клеток агрегата. К 24 чпд Cadherin-3 локализовался на апикальной и базальной поверхностях эктодермальных клеток и точечно на апикальных поверхностях эндодермальных клеток (Рисунок 16 В). Во время формирования рта часть эктодермальных клеток утрачивала свою целостность, и происходил разрыв эпителия. На месте такого разрыва, клетки утрачивали полярную локализацию Cadherin-3 (Рисунок 16 В).
Для более детального изучения функции третьего кадгерина мы провели нокдаун cadherin-3 при помощи ATG морфолино. Полученные морфанты не были способны вступить в гаструляцию, и у них нарушалась целостность эпителия [Pukhlyakova et al. 2016].
Для исследования роли Cadherin-3 в формировании агрегатов, мы получили агрегаты из морфантов (22 чпо) по этому гену. Мы выявили, что агрегаты, полученные из морфантов по cadherin-3 значительно хуже агрегировали (Рисунок 16 Г), чем агрегаты, полученные из контрольных морфантов (Рисунок 16 Д). Так, площадь всех контрольных агрегатов была в 5,8 раз больше, чем площадь агрегатов, полученных из клеток морфантов по cadherin-3 (Рисунок 16 Е). Кроме того, агрегаты, полученные из клеток морфантов по cadherin -3, распадались на клетки, теряя целостность агрегата через 2 чпд.
Пластичность развития Nematostella
Удивительная способность клеток диссоцированных книдарий реинтегрироваться в целостный организм (в том числе благодаря процессу трансдифференцировки клеток) позволяет получить важную дополнительную информацию об общих принципах и механизмах развития. Наши эксперименты указывают на то, что эмбриональное и личиночное развитие N. vectensis гораздо пластичней, чем можно было ожидать.
Понятие «пластичность развития» было введено Дришем для описания регулятивных возможностей развивающегося эмбриона [Driesch, 1900]. Это явление связано со способностью эмбриона менять траектории развития в зависимости от его условий. Одним из проявлений пластичности и устойчивости развития является индивидуальная изменчивость траекторий развития, не влияющая на достижение эмбрионом узловой стадии развития. Согласно модели “песочных часов” [von Baer, 1828], узловой стадией развития или как ее еще называют филотипическим периодом [Richardson, 1995] является стадия, на которой в пределе одного типа у организмов наблюдается максимальное морфологическое сходство, несмотря на различия в эмбриогенезе на более ранних стадиях [Slack et al., 1993]. В это же время завершается осевая разметка, которая для многих животных определяется экспрессией Hox генов [Harding et al., 1985; Akam, 1987, цит. По Cridge et al. 2016]
У книдарий, в отличие от билатерально симметричных животных, hox гены экспрессируются ассиметрично с одной стороны тела вдоль орально-аборальной оси [Finnerty et al. 2004], не выполняя функцию разметки тела. У данного таксона функцию разметки орально-аборальной оси тела выполняют гены семейства wnt. У Nematostella их паттерн экспрессии вдоль орально-аборальной оси тела напоминает паттерн экспрессии hox генов вдоль антеропостериорной оси у билатерий [Kusserow et al., 2005; Guder et. al. 2006]. Узловой стадий развития у книдарий можно считать стадию личинки: паренхимулы и/или планулы. На этой стадии происходит дифференцировка клеточных линий, орально-аборальная ось тела четко выражена, а также в пределах всей группы типа личинки сходны между собой.
В экспериментах по диссоциации-реагрегации эмбрионов колониального гидроида Phialidium (Clytia), на третий день развития из агрегатов формировались нормальные личинки (планулы), способные к метаморфозу, приводившему к развитию первичного полипа [Freeman, 1981]. У этих агрегатов не наблюдалась гаструляция по типу униполярной иммиграции, как в нормальном развитии, и автор заключил, что их развитие вовсе лишено гаструляции [Freeman, 1981]. Из описания развития агрегатов следует, что они формировали два слоя клеток с помощью морульной деламинации.
В нашей работе агрегаты Nematostella к шестому дню развития также достигали стадии планулы и имели как на молекулярном, так и на морфологическом уровне орально-аборальную ось тела. Тем не менее, в первые дни развития эти агрегаты разительно отличались от эмбрионов Nematostella. Большой интерес представляет то, что сегрегация зародышевых листков агрегатов Nematostella по типу морульной деламинации широко распространена в эмбриональном развитии других видов гидроидов [Allman, 1871; Metschnikoff, 1886; Kraus, 2006; Kraus et al., 2014], и, в частности, удивительным образом схожа с гаструляцией гидроидного полипа Dynamena pumila (Рисунок 17).
Таким образом, агрегаты Nematostella и Clytia не используют способ гаструляции, характерный для их нормального эмбриогенеза. Вместо этого включается альтернативный способ гаструляции, “заимствованный” у других представителей книдарий. Этот феномен можно объяснить тем, что у каждого таксона имеется свой "канонизированный" паттерн изменчивости [Stearns, 1994], позволяющий развитию организмов данного таксона использовать специфический набор для таксона набор морфогенезов. Несмотря на то, что в нормальном онтогенезе реализуется только один вариант развития, при столкновении с изменением строения организма (например, реорганизацией расположения клеток, как в примере с агрегатом), могут быть использованы запасные морфогенезы, доступные всем представителям этого таксона.
Другим примером использования альтернативных морфогенезов, разрешенных в пределе одного типа, может служить эксперимент по удалению поверхностных клеток нервной пластинки у бесхвостых амфибий. В результате такой манипуляции, у амфибий формировалась нервная трубка, лишенная полости [Dettlaff, 1983], которая очень напоминала раннюю нервную трубку костистых рыб. Таким образом, эмбрионы бесхвостых амфибий, столкнувшись с физическими ограничениями на использование нормального морфогенеза (изгибание нервной пластинки), стали использовать запасной путь развития, характерный для нормального развития другого представителя типа хордовых - костистых рыб.
Можно предположить, что с помощью замены нормального пути развития на альтернативные пути происходила эволюция морфогенезов. Если обратиться к модели эпигенетического ландшафта Уоддингтона [Waddington, 1957], можно представить, как при изменении одной точки развития (в случае агрегатов Nematostella - замена стадии целобластулы на стадию морулы), происходит изменение всей траектории развития организма, что может привести к модификации и более поздних стадий онтогенеза.
Стоит отметить, что такие аберрации развития могут происходить при условии, что изменение онтогенеза произошло на узловой точке развития. Так при диссоциации на клетки зародышей морского ежа на стадии раннего дробления происходит полное восстановление целобластулы, которая затем развивается нормальным образом, проходя через стадию инвагинационной гаструлы [Spiegel, Spiegel, 1975]. При проведении этого же эксперимента на стадии гаструлы происходит нарушение узловой стадии развития, и в этом случае формируются агрегаты, напоминающие по строению морулу, что ведет к изменению пути развития без изменения его конечного результата я [Giudice, 1962].
В ходе нашей работы, мы показали, что агрегированные клетки N. vectensis способны достичь дефинитивной стадии, регулируя свое развитие из почти гомогенных условий. Пластичность организма проявлялась на молекулярном, клеточном и тканевом уровнях развития, что позволило нам изучить спектр проспективных потенций эмбриональных клеток Nematostella Изучение пластичности развития может внести большой вклад в понимании механизмов онтогенеза. К сожалению, эта область биологии развития все еще остается мало изученной. Очень часто пластичность развития воспринимают как аберрацию эмбриогенеза, а не как тонкую работу организма, позволяющую оптимизировать развитие в соответствии с внешними и внутренними условиями. Тем не менее, пластичность развития можно обнаружить на всех уровнях организации животных, и она является неотъемлемым свойством организма.