Содержание к диссертации
Введение
1. Введение 3
2. Обзор литературы 9
2.1. Клетки нервного гребня и их производные в развитии позвоночных 9
2.1.1. Роль нервного гребня в развитии периферических структур в эмбриогенезе 9
2.1.2. Современные взгляды на эволюцию нервного гребня 15
2.1.3. Онтогенез пигментированных меланоцитов 28
2.1.4. Онтогенез парасимпатических нейронов 31
2.1.5. Онтогенез мезенхимальных популяций 34
2.2. Неканонические функции периферической нервной системы 39
2.2.1. Организация и развитие периферической нервной системы 39
2.2.2. Ключевая роль глиальных клеток в процессах нерв-зависимой регенерации 45
2.2.3. Периферическая глия и регенерация нервов 51
2.2.4. Нерв-зависимые патологии иннервируемых периферических тканей 54
2.2.5. Нервы и их роль в органогенезе и поддержании тканевого гомеостаза 58
2.2.6. Синопсис и постановка вопроса 65
3. Материалы и методы 67
3.1. Генетический трэйсинг клеточных линий: основы метода 67
3.2. Трансгенные животные 70
3.3. Иммуногистохимическое маркирование 72
3.4. In situ гибридизация 74
3.5. Микроскопия 75
3.6. Культуры тканевых эксплантов и анализ остеогенного потенциала 76
3.7. Трэйсинг глиальных производных в зубе в условиях микротравмы 77
3.8. Образование глиальных производных в зубе в условиях денервации 78
3.9. Перерезание седалищного нерва у взрослых мышей
3.10. Проточная цитометрия 80
3.11. Анализ пролиферации с помощью инкорпорированных нуклеотидов BrdU и EdU 81
3.12. In оvo электропорация куриных эмбрионов 82
3.13. Микрохирургия на эмбрионах 84
3.13.1. Удаление фрагмента нервной трубки и ганглиев дорсального корешка 85
3.13.2. Удаление дорсолатерального эпителиально-мезодермального фрагмента 85
3.13.3. Аксотомизация вентрального спинального нерва 86
3.13.4. Культуры толстых поперечных эмбриональных срезов 87
3.13.5. Культуры ганглиев дорсального корешка и фрагментов нервов 88
3.14. Общие статистические аспекты 89
4. Результаты и их обсуждение 90
4.1. Глиальные клетки дают начало пигментным клеткам 90
4.1.1. Образование меланобластов в периферических нервах 90
4.1.2. HMX1 регулирует баланс клеточных типов в линии КНГ 118
4.1.3. Взаимодействия между нейронами и периферической глией контролируют генерацию меланобластов 120
4.1.4. Миелинизирующие Шванновские клетки сохраняют способность производить пигментированные меланоциты 121
4.1.5. Обмен информацией между нейронами и ПШК 122
4.1.6. Растворимые сигналы, регулирующие развитие меланоцитов в нерве 123
4.1.7. Краткое обсуждение конверсии глии в меланоциты 153
4.1.8. Связь между конверсией ПШК в меланоциты и нейрокожными заболеваниями 160
4.1.9. Эволюционные и экологические аспекты нерв-зависимого пути производства меланоцитов 165
4.1.10. Конверсия глии в меланоциты и эволюция нервного гребня 168
4.1.11. Промежуточные выводы 184
4.2. Глиальные клетки генерируют парасимпатические нейроны 186
4.2.1. Парасимпатические ганглии образуются из нерв-зависимых предшественников 186
4.2.2. Промежуточные выводы 218
4.3. Глиальные клетки дают начало мезенхимальным стволовым клеткам в модельной системе зуба
4.3.1. Пластичность нерв-ассоциированных ПШК в зубе позвоночных 219
4.3.2. Промежуточные выводы
5. Заключение 236
6. Выводы 241
7. Cписок сокращений и условных обозначений 243
8. Список литературы 244
- Роль нервного гребня в развитии периферических структур в эмбриогенезе
- Организация и развитие периферической нервной системы
- Анализ пролиферации с помощью инкорпорированных нуклеотидов BrdU и EdU
- Эволюционные и экологические аспекты нерв-зависимого пути производства меланоцитов
Введение к работе
Актуальность проблемы
Эмбриональное развитие является сложно скоординированным элегантным процессом постепенного воспроизводства огромного спектра клеточных элементов в правильном пространственно-временном контексте, их позиционирования и объединения в ткани для формирования функционально адаптированного единства органов в целостном организме. У многоклеточных животных в процессе эволюции возникло множество оригинальных стратегий и механизмов, задействованных на каждом этапе в процессе индивидуального развития для достижения оптимальных результатов координации отдельных элементов в слаженно функционирующие ткани и органы. Понимание законов и принципов возникновения интегрированного многообразия клеточных элементов и механизмов их взаимодействий позволит осуществлять направленные воздействия на процессы дифференцировки и регенерации, бороться с врождёнными генетическими заболеваниями и патологиями, проявляющимися с возрастом.
В то время как компоненты живых систем высоко интегрированы на всех уровнях организации, в современной биологии развития и регенеративной медицине, изучающей эти живые системы, продолжает доминировать дифференциально-тканевой подход к исследованию конкретного органа или клеточного типа, каждый из которых рассматривается по отдельности и, как правило, в значительной изоляции от других компонентов общей организменной системы. Процессы интеграции во время развития и регенерации изучены до сих пор относительно слабо, и именно в последнее десятилетие в этой области исследований возникают концептуально новые подходы. Примером ограниченности дифференциально-тканевого подхода может служить недостаточно изученная функция инфраструктурной ниши, представленной сосудами и нервными волокнами (нервами), как общего интегратора при формировании широкого спектра эмбриональных тканей и органов. Данная ниша, то есть уникальная биохимическая микросреда, необходимая для дифференцировки и поддержания определенного функционального состояния разнообразных клеточных элементов, широко представлена, начиная с ранних стадий эмбрионального развития. Однако, данные о конкретных механизмах её влияния на клеточные элементы только начинают накапливаться. Так, появляется все больше подтверждений тому, что процессы дифференцировки и поддержания определенного функционального состояния в тканях развивающегося эмбриона и взрослого организма ассоциированы с нервными элементами, входящими в данную нишу. Открытия последних лет позволяют переосмыслить роль биохимических сигналов, таких как факторы роста фибробластов FGF2 и FGF4, антериоградиентный белок nAG, SOX2, и предположить взаимосвязь между их наличием и присутствием нервных волокон (Tuisku and Hildebrand, 1994; Rinkevich, et al., 2014). Подтверждаются предположения о морфогенетической роли периферических нервов в развивающихся и регенерирующих органах (Li, et al., 2013; Kumar and Brockes, 2012). При этом,
ключевую роль в таких случаях авторы отводят именно периферическим нервам и периферической нервной системе.
У позвоночных животных периферическая нервная система обеспечивает иннервацию практически всех частей тела. Она формируется на ранних стадиях эмбрионального развития (Landmesser and Morris, 1975; Martin, 1990) и берет свое начало из трех основных источников: нейрогенных плакод, центральной нервной системы (например, моторные спинномозговые нервы) и мультипотентных мигрирующих клеток нервного гребня (Le Douarin, 1986). Помимо многочисленных клеточных типов, которым клетки нервного гребня дают начало в организме, они также дифференцируются в нейросекреторные клетки надпочечников, меланоциты, периферические сенсорные нейроны, нейроны симпатической и парасимпатической системы, а также клетки глии периферических нервных волокон (Le Douarin, et al., 2004). В представляемой работе впервые продемонстрировано, что кроме общеизвестных функций защиты и поддержки нейронов, обеспечения быстрого распространения потенциалов действия вдоль нервного волокна, периферические глиальные клетки сохраняют потенциал мультипотентности, подобно клеткам нервного гребня, из которых они произошли. Это делает глиальные клетки, ассоциированные с нервными волокнами, идеальными кандидатами для реализации морфогенетических, неканонических для клеток глии функций, востребованных для скоординированного развития и регенерации тканей и органов.
В настоящее время, крайне мало известно о функциональных свойствах глиальных клеток, ассоциированных с нервными волокнами, а предположение об их участии в развитии не имело экспериментальных подтверждений. Нет представлений о том, какие именно молекулярные механизмы задействованы в процессах дифференцировки и/или де-дифференцировки (транс-дифференцировки) ассоциированных с нервными волокнами глиальных клеток. Неизвестно, какие именно факторы из биохимического микроокружения позволяют этим клеткам поддерживать состояние мультипотентности, а в строго определенный момент развития (или регенерации) индуцируют их дифференцировку в разнообразные клеточные типы.
Цель и задачи исследования
Доказать мультипотентный потенциал глиальных клеток, ассоциированных с нервными волокнами, лежащий в основе морфогенетической функции периферической иннервации. Выявить молекулярные механизмы взаимодействия ниши, представленной нервами, и прилежащих эмбриональных периферических тканей, обеспечивающие контроль локального клеточного состава, и, как результат, интегрированное, согласованное в пространственно-временном контексте развитие органов, тканей и систем у позвоночных животных.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи: 1. Экспериментально подтвердить возможность дифференцировки предшественников Шванновских клеток в меланоциты, доказать необходимость нарушения контактной сигнализации между нервным волокном и ассоциированными периферическими
глиальными клетками для дифференцировки меланоцитов из предшественников Шванновских клеток.
2. Выявить биохимические сигналы, создающие микросреду, индуцирующую
состояние лабильной дифференцировки в районе нервных волокон. Протестировать
роль мембранного белка нейрегулина (Neuregulin-1, NRG1), инсулиноподобного
фактора роста 1 (IGF1), тромбоцитарного фактора роста (PDGF), канонической Wnt
системы, эндотелина-3 (EDN3), в контроле локальной дифференцировки
предшественников Шванновских клеток и генерации меланобластов.
-
Исследовать гетерогенность популяции предшественников Шванновских клеток, определяющую их предрасположенность к дифференцировке в меланоциты. Установить взаимное влияние экспрессии регулятора развития пигментных клеток Mitf (microphthalmia-associated transcription factor) и негативного регулятора миелинизации Sox2 в процессе дифференцировки меланобластов в периферических нервах.
-
Экспериментально доказать роль предшественников Шванновских клеток как источников для формирования клеток парасимпатических ганглиев нервной системы. Подтвердить, что NEUN+/PHOX2B+ парасимпатические нейроны происходят из SOX10+ клеток, расположенных вдоль периферических нервов, а не формируются напрямую из мигрирующих клеток нервного гребня.
-
Определить период в развитии, когда предшественники Шванновских клеток служат источником для формирования клеток парасимпатических ганглиев. Подтвердить зависимость развития парасимпатических нейронов от наличия преганглионарного нерва в месте формирования будущего ганглия. Установить роль активации рецепторного комплекса ERBB нейрегулином (NRG1) в способности предшественников Шванновских клеток к пролиферации и дифференцировке в парасимпатические нейроны или зрелые глиальные клетки.
-
Используя идентифицированные клоны клеток, происходящие из единичных PLP1+ предшественников Шванновских клеток, доказать, что парасимпатические ганглии образуются из предшественников Шванновских клеток напрямую, без промежуточной стадии транзиторно-амплифицирующихся предшественников-нейробластов.
-
Экспериментально показать, что предшественники Шванновских клеток участвуют в развитии мезенхимального компартмента зуба и воспроизведении популяции мезенхимальных стволовых клеток, генерирующих клетки пульпы и одонтобласты. Установить клональную преемственность потомков единичной мезенхимальной стволовой клетки. Показать необходимость сохранения иннервации для генерации мезенхимального потомства от PLP1+ клеток.
Основные положения, выносимые на защиту 1. Нервные волокна являются нишей, необходимой для дифференцировки мультипо-тентных глиальных клеток в пространственно-обусловленных направлениях, обеспечивающих гетерогенность иннервируемой ткани.
-
Ассоциированные с нервами мультипотентные глиальные клетки дают начало нескольким клеточным типам, включая меланоциты, нейроны парасимпатических ганглиев и мезенхимальные стволовые клетки.
-
Корректная иннервация необходима для доставки достаточного количества предшественников клеток различных типов в развивающуюся ткань.
-
Молекулярные механизмы дифференцировки мультипотентных глиальных клеток включают как биохимические факторы, контролирующие устойчивость контакта клетки с нервом (сигнальная система мембранных нейрональных пептидов ERBB-NRG1), так и факторы, регулирующие выживаемость и пролиферацию клеток-предшественников после потери контакта с нервным волокном (сайт-специфическая экспрессия факторов роста Edn3, Nrg1, Kitl).
-
Комплексное исследование роли мультипотентных глиальных клеток, ассоциированных с нервами, дает основание полагать, что они сходны по своему потенциалу с клетками нервного гребня.
Научная новизна и теоретическое значение работы
На основе исследований, полученных с использованием генетического трейсинга трансгенных линий мышей, и микрохирургии эмбрионов мышей и птиц, был впервые доказан мультипотентный потенциал глиальных клеток, ассоциированных с нервами. Впервые показано, что предшественники Шванновских клеток, являющиеся прямыми потомками клеток нервного гребня, способны дифференцироваться в меланоциты, клетки парасимпатических ганглиев нервной системы, мезенхимальные стволовые клетки зуба. Доказано взаимное репрессирующее влияние MITF (microphthalmia-associated transcription factor) и SOX2 в процессе дифференцировки меланобластов, детализированы функции сигнальной системы ERBB-NRG1 в контроле устойчивости контакта клетки с нервом и роль сайт-специфической экспрессии Edn3, Nrg1, Kitl в регуляции выживаемости и пролиферации после потери контакта предшественников Шванновских клеток с нервом. Таким образом, было впервые экспериментально доказано предположение, что периферические нервы являются локальной инфраструктурной нишей для мультипотентных клеток, являющихся прямыми потомками клеток нервного гребня.
Впервые продемонстрирована важность глиальных клеток, ассоциированных с нервами, для формирования гетерогенных клеток ганглиев автономной нервной системы и формирования как морфологических, так и сигнальных связей между компонентами тканевых составляющих. На основе комплексных исследований предложен принципиально новый сценарий развития нервной системы, при котором миграция клеток-предшественников в дистальные участки формирующегося тела, а также морфологическая связь удалённых отделов нервной системы, происходят за счет выселения постсинаптических элементов из пресинаптических нервов, которые служат физическими переносчиками стволовых элементов.
Полученные результаты существенно изменяют существующие теоретические представления о фундаментальных принципах, лежащих в основе регуляции формирования нервной системы у позвоночных, вносят новые представления о
мультипотентных возможностях глиальных клеток, ассоциированных с нервами, указывают на необходимость иннервации в формировании локальной инфраструктурной ниши при формировании эмбриональных тканей и органов.
Научно-практическая значимость
Полученные результаты позволили сформировать совершенно новое представление о неканонических морфогенетических функциях периферических нервов у позвоночных. Значительно расширены существующие представления о молекулярных и клеточных механизмах, лежащих в основе направленной дифференцировки предшественников Шванновских клеток. Впервые представлена и экспериментально обоснована новая концепция ассоциированных с нервами мультипотентных клеток, являющихся прямыми потомками клеток нервного гребня.
Методические разработки, использовавшиеся в работе, в частности метод клонального анализа результатов генетического трейсирования с цветовым кодированием представляют интерес в применении для исследования других клеточных систем.
Полученные фундаментальные знания о клеточных и молекулярных механизмах, обеспечивающих морфогенетическую и направляющую роль нервной системы в развитии позвоночных, позволят приблизиться к пониманию молекулярно-генетических основ многих наследственных заболеваний, имеющих системное проявление (например, таких как многочисленные нервно-кожные заболевания). Доказанное в работе участие нервов в развитийных процессах стимулирует исследования молекулярных и клеточных механизмов взаимодействия нерва и иннервируемой ткани для решения задач регенеративной медицины.
Таким образом, результаты работы имеют практическую значимость в регенеративной медицине, при использовании принципов направленной дифференцировки стволовых клеток, ассоциированных с нервами, в восстановительной пластике зубов, а также в сфере борьбы с врождёнными заболеваниями вегетативной нервной системы.
Личный вклад автора.
Все результаты по анализу линий клеток периферической глии во время эмбрионального развития и у взрослых животных были получены лично И.И. Адамейко. Результаты, связанные с электропорацией и микрохирургией на куриных эмбрионах, были получены совместно с Ф. Лаллемен (F. Lallemend) и П. Эрнфорш (P.Ernfors). Анализ иннервации, развития и позиционирования парасимпатических ганглиев выполнен совместно с В.А. Дячуком и А. Фурлан (A. Furlan). Работы по денервации резцов и анализ зубной ткани выполнены совместно с Н. Каукуа (N. Kaukua), М. Катиби-Шахиди (M.Khatibi-Shahidi) и К. Фрид (K.Fried). Во всех вышеперечисленных случаях, И.И. Адамейко не только выполнял эксперименты, но и отвечал за их дизайн и научное руководство.
Апробация работы.
Результаты данной работы опубликованы в ведущих международных журналах, таких, как Cell (Adameyko et al., 2009), Development (Adameyko et al., 2012), Nature
(Kaukua et al., 2014) и Science (Dyachuk et al., 2014; Adameyko 2016; Furlan, Dyachuk, Kastriti et al., 2017), успешно представлялись на международных конференциях (Single cell analyses – from microbes to human brain 2016 “Single cell transcriptomics for resolving neural crest and glial populations and for solving the challenge of crest multipotency”; The Third International Conference on Dental and Craniofacial Stem Cells 2016 “Glial origin of dental mesenchymal stem cells”) и в качестве приглашённых семинаров (2017/02/15: invited lecture and the seminar “Single cell transcriptomics reveals fate split points in the neural crest and glia” at King’s College London, UK (Host: Prof. Paul Sharpe); 2016/03/24: invited lecture “Glial cell differentiation trajectories and fate choice dynamics” at Kyoto University, Kyoto, Japan (Host: Prof. Yoshiko Takahashi); 2016/08/31: invited lecture “Neural crest and glia heterogeneity suggests early biases related to extrinsic control” at ETHZ, Zurich, Switzerland (Host: Prof. Ueli Suter).
Публикации
Основные результаты диссертации представлены в 17 печатных работах, в числе которых 16 статей в высокорейтинговых международных журналах, включённых в систему цитирования Web of Science (в том числе Nature, Cell, Science).
Структура и объем диссертации
Роль нервного гребня в развитии периферических структур в эмбриогенезе
Загадочные предшественники GnRH-иммунореактивных нейронов оказались не последним направлением в поиске зачаточного нервного гребня у асцидий. Некоторое время назад Бейкер и Броннер-Фрейзер предложили, что меланин-содержащие клетки внутри ЦНС асцидии могут быть эволюционными предшественниками нервного гребня, исходно дающего начало меланоцитам (Baker and Bronner-Fraser, 1997). В подтверждение этой идеи Филипп Баррон Абитуа и Майкл Левин с коллегами показали, что асцидия Ciona intestinalis обладает особенной пигментной клеткой, происходящей из бластомера a9.49 в районе глазка внутри нервной системы. Данная пигментная клетка по многим параметрам напоминает производный клеточный тип от нервного гребня и может быть репрограммирована в мигрирующую популяцию дочерних мультипотентных клеток введением фактора Twist (Abitua, et al., 2012). Линия a9.49 экспрессирует нейрональные гены, гены пограничной пластины и спецификации нервного гребня, включая Id, Snail, Ets и FoxD (Abitua, et al., 2012; Imai, et al., 2006; Jeffery, et al., 2008; Russo, et al., 2004; Squarzoni, et al., 2011; Tassy, et al., 2010; Wada and Makabe, 2006), что в результате приводит к формированию пигментированной клетки глазка (эволюционный аналог меланоцита) и отолита (Nishida and Satoh, 1989). Обычно Twist экспрессируется только в мультипотентных мигрирующих производных мезодермы у асцидий, в частности, в мезенхимальных клетках, дающих начало ряду производных мезодермы, в том числе мышечным стенкам тела, клеткам туники и крови. Тем не менее, после введения TWIST в линию a9.49 в ЦНС, клетки приобрели свойства нервного гребня, такие как способность к миграции и дифференцировке в различные ткани мезодермального происхождения. Авторы также показали, что сигнальные пути, регулирующие спецификацию пигментированного глазка, весьма похожи на аналогичные во время развития нервного гребня позвоночных, в том числе благодаря наличию молекулярных механизмов Wnt-зависимой спецификации и FoxD-опосредованной репрессии Mitf. Однако, существует возможность, что взаимодействие между Mitf и FoxD представляет собой очень древний молекулярный модуль, установившийся еще задолго до разделения хордовых и других животных вероятнее всего в фотосенсорных структурах и который не имеет прямого отношения к клеткам нервного гребня. Таким образом, консервативный набор, состоящий из Mitf/FoxD кросс-репрессии, канонического сигнального пути Wnt и участия КНГ-ассоциированных регуляторных белков в линии пигментированных глазков асцидий a9.49, позволяет утверждать правдоподобность гомологии линии a9.49 с нервным гребнем позвоночных (Abitua, et al., 2012). С другой стороны, это подтверждает гипотезу о том, что мезенхимальные судьбы и свойства были поздним и завершающим аккордом в процессе эволюции нервного гребня (Gans and Northcutt, 1983; Shimeld and Holland, 2000). Тем не менее, не ясно, как в таком случае несколько мезенхимальных судеб и их правильное позиционирование за пределами нервной системы «автоматически» включаются при введении Twist в клетки линии a9.49 внутри ЦНС. В частности, в будущем необходимо прояснить, какой молекулярный механизм открывает возможность новых мезенхимальных судеб в нервной системе экспериментальных асцидий: эктопически-активированные внутренние коды, управляемые непосредственно Twist, или разблокированный потенциал линии (с помощью Twist) в совокупности с внешними сигналами, поступающими из окружающей среды.
Amphioxus (ланцетник), наиболее базальное современное хордовое животное, представляет особый интерес в связи с вопросами эволюции нервного гребня. Amphioxus не имеет нервного гребня или любых других клеток, деламинирующих из дорсальной части нервной трубки или смежной не-нейральной эктодермы. Многочисленные исследования были сфокусированы на анализе экспрессии классических компонентов НГ-ГРС в процессе эмбриогенеза и развития личинки во взрослого ланцетника. Интересным образом, некоторые гены, являющиеся управляющими компонентами развития премиграционного и миграционного нервного гребня позвоночных, экспрессируются в не-нейральной эктодерме Amphioxus. К ним относятся Bmp2/4 (Panopoulou, et al., 1998), Snail/Slug, Pax3/7 и Msx (Holland, et al., 1999; Langeland, et al., 1998; Sharman, et al., 1999). Кроме того, нейруляция у ланцетника осуществляется путём, отличным от нейруляции у высших позвоночных и круглоротых. Не-нейральные эктодермальные листы симметрично наползают с двух сторон дорсальнее инвагинирующей нервной пластинки к средней линии эмбриона, где они сливаются поверх будущей нервной трубки. В то же самое время, нейральная эктодерма сворачивается в трубчатую конструкцию под покрывающим слоем не-нейральной эктодермы. Важно, что эти не-нейральные эпителиальные слои никогда не мигрируют как отдельные, не связанные друг с другом, клетки (Holland, et al., 1996). Несмотря на это, Линда и Николас Холланд предположили, что эти эктодермальные листы могут представлять собой ткань, гомологичную нервному гребню позвоночных (Holland and Holland, 2001).
Чуть позже эта гипотеза получила позднее отвергнутую поддержку в виде результатов исследований по эмбриогенезу круглоротых, в частности, миксин, которые показали наличие эпителиальных карманов, прилегающих к нейральной эктодерме во время развития нервной трубки. Эти карманы, или инвагинации, были интерпретированы как ещё один шаг в эволюции нервного гребня и как трансформация эпителиальных наползающих листов из эмбриона ланцетника. Однако, недавние успехи в эмбриологии миксин показали, что эпителиальные карманы, известные из исторической литературы, являются артефактом метода традиционной фиксации эмбрионов миксин. В действительности, миксины, а также миноги и другие позвоночные, имеют нормально деламинирующий и мигрирующий нервный гребень (Ota, et al., 2007). Эти новые факты подтверждают, что деламинация мигрирующих клеток нервного гребня уже присутствовала у общего предка миксин и других позвоночных в кембрийском периоде около 500 миллионов лет назад (Shu, et al., 2003). Однако, в отличие от круглоротых, у ланцетника гомологи ключевых спецификаторов нервного гребня, за исключением Snail, не экспрессируются в нервной пластинке (Langeland, et al., 1998). Вместо этого, с-Мус, Id, Twist, FoxD3 и SoxE экспрессируются в мезодерме и эндодерме, а AP-2 появляется только в эпидермисе. Кроме того, экспрессия Id и FoxD белков была обнаружена только в передней эктодерме (Meulemans and Bronner-Fraser, 2002; Meulemans, et al., 2003; Yasui, et al., 1998; Yu, 2010; Yu, et al., 2002; Yu, et al., 2008). Интересно, что некоторые эффекторные программы классического нервного гребня, по всей видимости, сохраняются в Amphioxus и отвечают, например, за производство пигмента на основе меланина (MITF, Trp) (Yu, et al., 2008). Исходя из этого, Наталья Никитина и коллеги предположили, что несколько независимых типов клеток с разнообразными потенциалом дифференцировки организовались в пределах границы нервной пластинки и породили набор мультипотентных прото-клеток нервного гребня (Nikitina, et al., 2009). Эта концепция диаметрально противоположна предыдущим идеям, предлагающим унипотентные мигрирующие прото-клетки нервного гребня, набирающие градации мультипотентности постепенно в процессе дальнейшей эволюции.
Организация и развитие периферической нервной системы
Мигрирующие и мультипотентные клетки нервного гребня, деламинирующие из дорсальной части нервной трубки, обнаруживаются ещё у общего предка челюстных и круглоротых, таких как миноги и миксины. Важно отметить, что существуют серьёзные различия в спектре генерируемых судеб, продуцируемых нервным гребнем у эмбрионов хордовых на разных уровнях филогенетической организации. Клетки нервного гребня миноги, например, не дают начало симпатической нервной системе, костной ткани, дентину, миелинизирующим периферическим глиальным клеткам, но при этом образуют различные типы клеточного хряща (Cattell, et al., 2011; Funakoshi and Nakano, 2007; Johnels, 1956). Исходя из этого, в настоящий момент в научном сообществе принято считать, что потрясающая мультипотентность нервного гребня, обнаруженная у многих групп позвоночных, есть результат постепенной эволюции и расширения спектра возможных судеб на пути к высшим таксонам (Donoghue, et al., 2008; Hall and Gillis, 2012). Несмотря на это, подобная информация не помогает решить вопрос об эволюционном клеточном типе, давшем начало прото-нервному гребню. Однако, совершенно очевидно, что мезенхимальные судьбы не являются первичными и наиболее ранними в эволюционном плане. В настоящее время неясно, были ли прото-клетки нервного гребня олигопотентны, давая начало небольшому числу клеток несколько разных судеб, или они были изначально унипотентны, порождая только определённый тип клеток. Недавние исследования показали, что на уровне круглоротых формирование нервного гребня уже регулируется группой эволюционно консервативных молекул, организованных в так называемую генетическую регуляторную сеть (ГРС) нервного гребня (НГ-ГРС) (Meulemans and Bronner-Fraser, 2004; Sauka-Spengler, et al., 2007). Эти молекулы организуют формирование нервного гребня у всех позвоночных и включают индукторы нервной пластины и пограничные детерминанты (FGF, BMP, WNT, DLX, MSX1/2, PAX3/7, ZIC), спецификаторы, собственно, нервного гребня (SLUG/SNAIL, FOXD3, AP-2, TWIST, ID, с-МYC, члены семейства транскрипционных факторов SOXE), факторы деламинации и контролёры миграции (RHOB, кадгерины), и, наконец, молекулы-эффекторы, отвечающие за терминальную дифференцировку нервного гребня и уникальные свойства специализированных производных (MITF, COL2a, CRET, ERBB3) (Sauka-Spengler and Bronner-Fraser, 2006; Sauka-Spengler, et al., 2007). В настоящее время концепция НГ-ГРС представляет собой важный и ключевой этап прогресса в нашем понимании эволюции и онтогенеза нервного гребня, а также кооптации новых функций (Yu, 2010). Поскольку нервный гребень вместе с соответствующей НГ-ГРС довольно хорошо сохраняется во всех позвоночных, исследователи провели поиск экспрессии компонентов этой сети в нижних ветвях филогенетического древа хордовых, в частности, у представителей групп Tunicata и Cephalochordata. Действительно, у оболочников, в частности, у асцидий, были обнаружены экспрессирующиеся модули НГ-ГРС в мигрирующих боковых клетках. Эти гены-спецификаторы НГ включали FoxDb, C-Myc, Twist-1 и Twist-2 вместе с очень немногими эффекторами (Cadherin-2, RhoA, RhoB, RhoC), регулируемыми этими генами (Nikitina, et al., 2009). В соответствии с этим, другое недавнее открытие показало, что оболочники обладают мигрирующими НГ-подобными клетками, дающими начало пигментации. Эксперименты с DiI трэйсингом клеток в развитии личинки асцидии Ecteinascidia turbinata выявили особенные клетки, мигрировавшие из региона нервной трубки в стенку тела и сифон, где они дифференцировались в пигментные клетки (Jeffery, et al., 2004). В результате, авторы данного исследования предположили, что развитие нервного гребня начинается с выхода из ЦНС предшественников пигментных клеток, дающих начало характерной картине пигментации тела. Тем не менее, существующая критика данной работы сосредоточена на недостаточной специфичности DiI-маркировки клеток, прилегающих к нервной трубке, а также на других технических аспектах этого эксперимента (Baker, 2008; Hall and Gillis, 2012). Уильям Джеффри и соавторы провели последующие эксперименты с использованием антител против классических маркеров нервного гребня HNK-1 и тирозиназы на развивающихся личинках двенадцати самых разнообразных видов асцидий для более глубокого определения природы мигрирующих клеток. Набор анализируемых видов асцидий включал как одиночные, так и колониальные формы, различные типы взрослой организации и режимы развития, а также виды с разнообразными параметрами изменения сложности и размеров личинок. Оказалось, что, действительно, популяция мигрирующих пигментных клеток экспрессирует HNK-1 и тирозиназу у всех исследованных видов асцидий, включая Ciona intestinalis и Ecteinascidia turbinata. Кроме того, альбиносы Botryllus schlosseri продемонстрировали отсутствие HNK-1+/TYR+ клеток, что дополнительно подтверждает, что HNK-1 и тирозиназа маркируют именно пигментные клетки (Jeffery, 2006). В последующей публикации, Джеффри и соавторы осуществили более точное трэйсирование клеточных линий, основанное на методике ареста дробления эмбриона асцидии Ciona intestinalis (Jeffery, et al., 2008). В результате, авторы показали, что мигрирующие HNK-1+ клетки происходят вовсе не из ЦНС (как должно было бы быть в случае нервного гребня), а от A7.6 предшественников стволовых боковых клеток, принадлежащих к мезодермальной линии и не экспрессирующих такие важные маркеры КНГ как Msx, Dlx, Zic и Pax (Jeffery, 2006; Jeffery, et al., 2008). Таким образом, эти КНГ подобные клетки, скорее всего, представляют собой результат параллельной эволюции, а не являются гомологами истинного нервного гребня. Это не особенно удивительно в свете того, что другие вторичноротые, например, морские ежи, также приобрели пигментные клетки мезодермального происхождения (Gibson and Burke, 1985; Ruffins and Ettensohn, 1993). Интересно, что мезенхимальные стволовые боковые клетки, возникающие из предшественников A7.6, экспрессируют Twist (Jeffery, et al., 2008), который, предположительно, мог быть кооптирован в нейроэпителиальную линию, чтобы, наконец, собрать комплекс составляющих нервного гребня, обеспечивающих возможность деламинации и миграции в эволюции ранних хордовых.
Другим интересным аспектом жизни асцидий является то, что взрослый ганглий асцидии продолжает расти и, как это было предложено ранее, источником ганглионарных клеток может быть спинная нить – структура, развивающаяся из эмбриональной нервной трубки (Baker and Bronner-Fraser, 1997). Ганглий также способен регенерировать после повреждения, и GnRH-иммунореактивные нейроны, находящиеся в дорсальном сплетении, могут быть источником регенерировавших клеток в ганглии (Baker and Bronner-Fraser, 1997; Bollner, et al., 1995). Броннер-Фрейзер и Бейкер отмечают, что, если бы это было так, предшественники этих GnRH-иммунореактивных нейронов могли бы рассматриваться в качестве гомолога нервного гребня у оболочников (Baker and Bronner-Fraser, 1997).
Анализ пролиферации с помощью инкорпорированных нуклеотидов BrdU и EdU
Несмотря на то, что периферические нервы исторически воспринимаются исключительно как средство передачи потенциалов действия, важность присутствия нерва в месте травмы и последующей регенерации получила в настоящее время широкое признание. В течение очень долгого периода исследователи задавались вопросом, каким образом некоторые виды животных могут регенерировать значительные части тела, в то время как другие существа не обладают такой выигрышной способностью. Изучение основных различий регенеративных механизмов является долгосрочной целью научного сообщества, и особую актуальность в этом играет зависимость регенерации от иннервации. Одна из первых работ на тему нерв-зависимой регенерации была выполнена на саламандрах, использованных в качестве модельной системы (Todd, 1823). Оказалось, что саламандры способны полностью восстанавливать утраченные конечности, глаза, челюсти, значительные части сердца и головного мозга. Позже, регенерационные исследования были проведены и на других моделях, в том числе беспозвоночных. Например, было показано, что регенерация ампутированного луча морской звезды находится в абсолютной зависимости от наличия неповреждённых радиальных нервов (Huet, 1975). Также исследователи продемонстрировали, что клешня манящего краба не способна к полноценной регенерации в отсутствие педального нерва: в лучшем случае происходит восстановление пустой кутикулы. Наличие педального нерва оказывается необходимым условием для развития новых мышц в ходе регенерации у членистоногих. Более того, экспрессия FGF2 и FGF4 в педальном нерве и эпидермальных клетках в регенерирующих почках конечностей краба поддерживает консервативную роль множественных FGF-подобных фактора роста в раннем развитии регенерационной бластемы (Hopkins, 2001; Needham, 1965). В других группах беспозвоночных, включая плоских червей и некоторых книдарий, есть определённые экспериментальные свидетельства в пользу нерв-зависимой регенерации ((Sugiyama and Wanek, 1993) и недавняя работа (Yazawa, et al., 2009)). Несмотря на это, данная тема все ещё остаётся весьма спорной в научном сообществе. Тем не менее, в модельных системах планарий и книдарий регенеративные процессы были нарушены после селективного удаления нейральных элементов. Несмотря на то, что не ясно, играет ли ключевую роль нерв-ассоциированная глия или сами нервные волокна (продуцирующие сигнальные молекулы) в восстановительных процессах у беспозвоночных, очевидно, что нерв-зависимая регенерация высоко консервативна как принцип в различных группах многоклеточных животных.
В своё время Фредрик Туиску и Клэс Хильдебранд обратили внимание на то, что развитие и регенерация зубов зависят от наличия интактной иннервации у костистых рыб, в частности, у тиляпии (Tuisku and Hildebrand, 1994). В процессе развития этой рыбы нижний альвеолярный нерв достигает будущей локализации зубов задолго до того, как образуются сами зубные зачатки. Хорошо известно, что результат индукции и формирования зубов зависит от совместной и координированной активности орального эпителия и подлежащей мезенхимы. Тем не менее, источники исходного сигнала, маркирующего локализацию будущего зуба, включая самые ранние командные процессы, пока остаются невыясненными. Туиску и Хильдебранд отметили, что уже инициализированные зачатки зубов благополучно продолжают своё развитие в то время, как появление новых зачатков зубов оказывается полностью заблокированным после денервации нижней челюсти. Мы можем только догадываться о молекулярных механизмах взаимодействия между нервом, мезенхимой и оральной эктодермой, приводящих к индукции новых зубов. Сами нервные волокна вполне способны инжектировать морфогенетический фактор напрямую в ткань, равно как и нерв-ассоциированные клетки могут играть ключевую роль в этом процессе (Tuisku and Hildebrand, 1994). С другой стороны, денервация челюсти у детей вследствие травмы не влияет на развитие и рост зубов, что, вероятно, связано с тем, что зачатки зубов уже были заложены в процессе раннего эмбрионального развития и образования новых зачатков постнатально не происходит.
После ампутации конечностей у саламандр, Шванновские клетки повреждённых периферических нервов выделяют факторы, такие как антериоградиентный белок nAG, которые стимулируют образование раневого эпителия, недифференцированной бластемы и кожных желёз. Прогрессирующая регенерация впоследствии сопровождается повышенной экспрессией nAG также и в кожных железах, которые вместе со Шванновскими клетками контролируют инициацию и ход восстановления конечности (Рис. 1.13). Сигнал nAG, транслируемый через рецептор PROD, приводит к образованию и пролиферации гетерогенной по своим свойствам и потенциалам дифференцировки популяции мезенхимальных клеток (бластемы), формирующейся путём де-дифференцировки из мышечных, эпидермальных и многих других клеточных типов в процессе локального запуска регенерационного процесса.
Хирургическая денервация конечности до начала ампутации или генетическая абляция Шванновских клеток приводят к ингибированию образования раневого эпителия, миграции клеток и препятствуют образованию начальных предшественников бластемы. Наоборот, эктопическая экспериментальная оверэкспрессия nAG в денервированных конечностях позволяет достигнуть полноценной регенерации конечности в примерно 50% случаев. Таким образом, начальная фаза регенерации и первые сигналы, необходимые для формирования регенерационной бластемы, поступают от повреждённых периферических нервов и Шванновских клеток, что приводит к индукции раневого эпителия и обеспечивает необходимые условия для полной регенерации (Kumar, et al., 2007). Относительно недавно был опубликован многоплановый и детальный обзор о нерв-зависимой регенерации у амфибий, см. (Kumar and Brockes, 2012).
Эволюционные и экологические аспекты нерв-зависимого пути производства меланоцитов
Трэйсированные четырёхмесячные Krox20-Cre/R26EYFP мыши были подвергнуты анастезии с помощью интраперитонеальной инъекции комбинированных препаратов, состоящей из 75mg/kg кетамина (Ketaminol, Intervet, #511485) и 1mg/kg медетомидингидрохлорида (DormitorVet, OrionPharma, #015602), приготовленных в стерильном растворе для инъекций (Braun, #12250031). Глаза анастезированных животных были покрыты влагоудерживающим гелем (Oculentum simplex APL, #336164).
После анестезии мы брили и обрабатывали кожу бедра с наружной стороны 70% раствором этанола, а затем осуществляли надрез скальпелем, последовательно раздвигали пинцетами бедренные мышцы и экспонировали седалищный нерв. Затем мы лигировали нерв с помощью шовного материала, после чего 5 mm фрагмент нерва был отрезан ниже лигатуры и оставлен рядом с лигированным нервом в ране, которая была последовательно зашита и обработана антисептиком. Контралатеральная сторона тела служила в качестве внутреннего контроля. Для пробуждения оперированных животных мы подкожно вводили антидот Antisedan (AntisedanVet, OrionPharma, #471953) в соответствии с инструкцией производителя. Оперированным животным была предоставлена мягкая пища на период восстановления. Мы наблюдали мышей дважды в день в течение первых трёх дней и вводили Tamgesic для снижения неприятных ощущений каждые 24 часа до полного восстановления. Экспериментальные животные были собраны для анализа через 80 дней после операции. Под стереомикроскопом мы анализировали распределение пигментированных меланоцитов как описано (Rizvi, et al., 2002) под кожей и внутри мышц перед взятием тканей для фиксации 4% PFA в течение 12 часов на льду, криопротекции и последующего детального анализа на гистологических срезах.
Перед анализом YFP+ популяций глиальных производных в зубе мы активировали генетический трэйсинг во взрослых Plp-CreERT2/R26YFP животных с помощью единичной инъекции 5 mg тамоксифена с последующим периодом трейсирования в 4 недели или дольше. Фрагменты зубной пульпы были получены из трэйсированных резцов Plpl-CreERT2/R26YFP животных. Для каждого эксперимента мы брали 8 независимых пульп, которые мы инкубировали на шейкере (225 оборотов в минуту) в растворе ферментов Collagenase/Dispase (2.5mg/ml; Roche #11097113001), разведённых в 1x TrypLE Express (Gibco), в течение 1 часа на 37C. После энзиматической диссоциации клетки пропускали через клеточное сито и отмывали в PBS. Для последующих окрашиваний мы использовали либо живые клетки, либо клетки, зафиксированные в ледяном матаноле (45 минут на льду с последующими отмывками в PBS) в зависимости от конкретных антител. Затем клеточная суспензия была проинкубирована в растворе первичных антител на PBS в концентрации 4g/ml (antihy1, anti-Ki67, anti-GFP) в течение 45-60 минут на льду, после чего мы отмывали клетки от первичных антител в PBS. Вторичные антитела в разведении 1:1000 в PBS (AlexaFluor405, 488 and 647; Life Technologies) добавлялись к клеточной суспензии и инкубировались с образцами 45 минут на льду в условиях защиты от света, после чего мы отмывали клетки от раствора антител в PBS буфере. Далее, мы выполняли анализ клеточных популяций, помеченных антителами, с помощью проточной цитометрии на приборе FACSCantoII и программного обеспечения BD FACSDiva 6.1.3. Каждый эксперимент был независимо повторен три раза и сравнен с независимыми контролями, представляющими собой как неокрашенный первичными антителами образец, так и образец, окрашенный неспецифическими IgG-антителами (4g/ml, Santa Cruz).
Мы выполняли окрашивание инкорпорированных BrdU нуклеотидов стандартным способом с использованием Abcam BrdU Immunohistochemistry Kit #ab125306 в соответствии с инструкцией производителя после преинкубации в 2N HCl в течение 30 минут на 37C. Раствор BrdU (200 g/g) был инъектирован однократно или один раз в день was в течение трёх недель, после чего мыши были собраны по истечению различных периодов времени после последней или однократной инъекции (8 часов, 24 часа, 32 дня, 64 дня).
Для выявления глиального потомства и анализа удержанной пролиферативной метки (label-retaining assay) мы выполняли предварительное генетическое трэйсирование в Plp1-CreERT2/R26YFP мышах, которые для этого были инъектированы 5mg тамоксифена один раз в день в течение двух дней. После 7 месяцев трэйсирования мы осуществляли 5 последовательных интраперитонеальных инъекций раствора EdU (65g/g, каждые 48 часов). Через 71 день после последней инъекции EdU мы собирали экспериментальных животных для анализа.
В другом случае Р5 CD1 молодые мыши были инъектированы раствором EdU (3.3 g/g) в течение трёх недель каждый день, после чего выдержаны в течение последующих трёх недель перед анализом. Клетки зубной пульпы были собраны для анализа остаточного инкорпорированного EdU с помощью проточной цитометрии в соответствии со стандартной инструкцией производителя (EdU staining for flow cytometry, Invitrogen). THY1-FITC антитела (Ebioscience) были проинкубированы с клетками в течение 10 минут на комнатной температуре перед фиксацией и последующей детекцией EdU. Мы использовали BD Fortessa cell analyser (BD Biosciences) и программное обеспечение FACSDIVA для записи данных и программу Flowjo software для анализа. EdU-Alexa647, THY1-FITC и DAPI флуорофоры были возбуждаемы лазерами 633 nm, 488 nm и 351 nm и детектированы с помощью эмиссионных фильтров 670/30 nm, 530/30 nm и 450/50 nm соответственно.