Содержание к диссертации
Введение
1. Введение 6
1.1. Актуальность и степень разработанности темы исследования 6
1.2. Цель и задачи работы 10
1.3. Научная новизна работы 10
1.4. Практическая и теоретическая значимость 11
1.5. Положения, выносимые на защиту 11
1.6. Апробация диссертации 12
1.7. Публикации по теме диссертации 12
1.8. Структура и объём диссертации 13
2. Обзор литературы 14
2.1. Морфогенетические потенции 14
2.2. Электромагнитное излучение как действующий на живые объекты фактор 16
2.3. Электромагнитное излучение видимого диапазона 17
2.3.1. История и актуальность изучения воздействия ЭМИ видимого диапазона на живые объекты 17
2.3.2. Действие ЭМИ ВД на процессы развития 18
2.3.3. Действие ЭМИ видимого диапазона на клеточные культуры млекопитающих 19
2.3.4. Первичный акцептор, механизм действия излучения видимого диапазона 20
2.3.5. Ультракороткие лазерные импульсы 23
2.4. Электромагнитное излучение миллиметрового диапазона 25
2.4.1. История и актуальность изучения ЭМИ миллиметрового диапазона 25
2.4.2. Особенности и возможные механизмы действия ЭМИ МД 26
2.4.3. Действие ЭМИ МД на клеточные культуры млекопитающих 27
2.4.4. Онкостатические эффекты ЭМИ МД 29
2.4.5. Отличие действия непрерывного и модулированного (импульсного) излучения .31
3. Материалы и методы 34
3.1. Биологические объекты 34
3.1.1. Эмбриональное развитие вьюна (Misgurnus fossillis) 34
3.1.2. Клеточные культуры теплокровных 34
3.2. Источники электромагнитного излучения 34
3.2.1. Генераторы ЭМИ видимого диапазона .34
3.2.2. Ультракороткие лазерные импульсы .35
3.2.3. Электромагнитное излучение миллиметрового диапазона 35
3.3. Постановка экспериментов по изучению действия ЭМИ на раннее развитие вьюна 36
3.3.1. Подготовка биологического материала к эксперименту 36
3.3.2. Облучение икры вьюна диодным лазером (длина волны 660 нм, плотность мощности 0,02 мВт/см2) 37
3.3.3. Воздействие ЭМИ видимого и миллиметрового диапазона на эмбриональное развитие вьюна 38
3.4. Постановка экспериментов по изучению действия ЭМИ на клеточные культуры млекопитающих 39
3.4.1. Стерильные работы с клеточными культурами 39
3.4.2. Подготовка клеточных культур к эксперименту 40
3.4.3. Воздействие ЭМИ миллиметрового диапазона на клеточные культуры млекопитающих .40
3.4.4. Воздействие фемтосекундных лазерных импульсов на клеточные культуры млекопитающих 41
3.5. Методы исследования воздействия ЭМИ на раннее развитие вьюна (Misgurnis fossillis) 42
3.5.1. Подсчёт числа живых эмбрионов .43
3.5.2. Определение темпов развития эмбрионов .43
3.5.3. Определение длины тела личинок
3.6. Методы исследования воздействия ЭМИ на клеточные культуры млекопитающих 45
3.6.1. Подсчёт числа клеток после облучения (цитометрия) 45
3.6.2. Цитохимическое и иммуноцитохимическое окрашивание .45
3.6.4. Определение митотического и апоптотического индексов 46
3.7. Регистрация физических и химических параметров ростовой среды,
облучённой ультракороткими лазерными импульсами 47
3.7.1. Оценка концентрации активных форм кислорода в культуральной
среде 47
3.7.2. Гидроакустическое исследование среды 47
3.8. Статистическая обработка 48
4. Результаты и обсуждение 49
4.1. Воздействие лазерного излучения 660 нм на раннее развитие вьюна .49
4.1.1. Определение числа живых эмбрионов .49
4.1.2. Определение темпов развития 50
4.1.3. Измерение длины тела личинок 52
4.1.4. Анализ и обсуждение влияния излучения с длиной волны 660 нм на эмбриональное развития вьюна 54
4.2. Воздействие излучений видимого и миллиметрового диапазона на раннее развитие вьюна .54
4.3. Воздействие непрерывного и импульсного ЭМИ миллиметрового диапазона на клеточные культуры млекопитающих .57
4.3.1. Подсчёт числа клеток после облучения в клеточных культурах МСК, HaCaT и HeLa 57
4.3.2. Определение митотического и апоптотического индексов в культуре HeLa после облучения в миллиметровом диапазоне 59
4.3.3. Обсуждение воздействия ЭМИ миллиметрового диапазона на клеточные культуры МСК, HaCaT и HeLa 61
4.4. Действие фемтосекундных лазерных импульсов на клеточные культуры млекопитающих 63 4.4.1. Подсчёт числа клеток HaCaT и МСК после облучения фемтосекундными лазерными импульсами 63
4.4.2. Определение митотического индекса в клеточной культуре HaCaT после облучения фемтосекундными лазерными импульсами 65
4.4.3. Физико-химические исследования среды после облучения фемтосекундными лазерными импульсами 65
4.4.4. Обсуждение результатов воздействия фемтосекундных лазерных импульсов на клеточные культуры HaCaT и МСК
5. Заключение 70
6. Выводы 73
7. Список сокращений 75
8. Список литературы
- Научная новизна работы
- История и актуальность изучения воздействия ЭМИ видимого диапазона на живые объекты
- Клеточные культуры теплокровных
- Цитохимическое и иммуноцитохимическое окрашивание
Научная новизна работы
В биологии развития (эмбриологии) к числу базовых представлений относится представление о формообразовательных потенциях – т.е. способностях к дифференцировкам. Это представление может быть отнесено в равной мере к организму в целом, его органам и тканям, и к отдельным клеткам. Определённо и чётко это представление иллюстрируется классификацией стволовых клеток по их потенциям к дифференцировке. Стволовые клетки делят на пять групп: тотипотентные, плюрипотентные, мультипотентные и олигопотентные (Smith, 2006). Тотипотентной стволовой клеткой является оплодотворённая яйцеклетка, а также бластомеры, образующиеся в результате первых делений дробления (Smith, 2006). Эти клетки являются наиболее недифференцированными и способны дифференцироваться в любые клетки организма (для амниот – включая эмбриональные и внезародышевые ткани). Плюрипотентные стволовые клетки способны давать производные всех зародышевых листков: энтодерму, мезодерму и эктодерму, но только в составе тканей эмбриона (для амниот). К ним относят эмбриональные стволовые клетки (Evans and Kaufman, 1981) из внутренней клеточной массы бластоцисты, а также полученные искусственным репрограмированием соматических клеток индуцированные стволовые клетки (Takahashi and Yamanaka, 2006). Мультипотентные стволовые клетки способны дифференцироваться только в пределах одного зародышего листка. Примером мультипотентных клеток могут служить мезенхимальные стволовые клетки (МСК), которые могут быть выделены из костного мозга или жировой ткани взрослого организма. МСК способны дифференцироваться в мышечную, жировую, костную ткань или хрящ (Augello et al., 2010; Bruder et al., 1997; Prockop, 1997; Friedenstein et al., 1970). Однако известны случаи трансдифференцировки, когда МСК дифференцировались в клетки нейрональной ткани, в норме являющиеся производными эктодермального зародышевого листка (Barzilay et al., 2009). Олигопотентные стволовые клетки в пределах какой-либо ткани. Примером олигопотентных клеток являются гемопоэтические стволовые клетки способные дифференцироваться в миелоидную и лимфоидную линии клеток крови (Marone et al., 2002). Наконец, унипотентные стволовые клетки всё ещё способны к самовоспроизведению и дифференцировке, но только в один определённый клеточный тип (Overturf et al., 1997; de Rooij and Grootegoed, 1998; Beck and Blanpain, 2012).
Подобный подход можно применить и к более крупным структурным единицам, находящимся в процессе развития (Рисунок 1). Тогда сам онтогенез предстаёт как реализация потенций, где максимальными наделена зигота, а далее они убывают в процессе развития, реализуя его однонаправленную необратимость. Начало изучения морфогенетических функций в эмбриональном развитии можно отнести к работам, выполненным на вьюне (Neyfakh, 1959), когда с помощью жёсткого рентгеновского излучения было обнаружено время активации зародышевого генома на стадии средней бластулы. Вопрос активации генома и регуляции плюрипотентности клеток актуален для биологии развития в настоящее время (Korzh, 2009; Onichtchouk, 2016). 2.2. Электромагнитное излучение как действующий на живые объекты фактор
Одним из актуальных вопросов современной науки является изучение воздействия электромагнитного излучения на живые объекты. Главным природным источником электромагнитного излучения для Земли является Солнце. Большая часть энергии, излучаемой нашей звездой, приходится на инфракрасный и видимый диапазон (со спектральным максимумом в жёлто-зелёной области), и составляет 48 и 44%, соответственно (Рисунок 2). Ещё около 7% энергии Солнца приходится на коротковолновое излучение: ультрафиолетовое, рентгеновское и гамма-лучи. Оставшийся 1% энергии приходится на радиоволны.
История и актуальность изучения воздействия ЭМИ видимого диапазона на живые объекты
Электромагнитное излучение видимого диапазона как естественное, так и техногенное окружает нас повседневной жизни. Как уже было сказано выше, на видимый диапазон приходится значительная часть энергии, излучаемой Солнцем. Плотность мощности солнечного света на поверхности Земли составляет порядка 10-100 мВт/см2. Первые работы по изучению света относятся ещё к XIX веку. При изучении газообмена у лягушек было установлено, что выделение CO2 на свету происходит интенсивнее, чем в темноте, причём подобное эффект наблюдался и при воздействии на изолированную мышечную ткань животного. При изучении действия монохроматического света оказалось, что наблюдаемые биологические эффекты зависят от длины волны излучения. Так в работе Кондратьева 1881 г. (цит. по Крюк, 1986) указывается, что наиболее благоприятным для развития животных является красный свет, наименее – синий и фиолетовый. Таким образом, уже в первой половине XX века были накоплены данные о действии света на различные системы организма, способность тканей к регенерации, пролиферацию клеток, активность ферментов (Вермель, 1925). В то же время начинаются опыты по использованию света в медицинских целях (Гаусман и Фольк, 1929), однако в 30-х годах в связи с развитием фармакологии, а также технологическими сложностями интерес к фототерапии несколько угас. С появлением лазеров, совершенствованием дозиметрических приборов и методов исследования в 60-70-х годах работы по изучению действия света на биологические объекты продолжились на новом уровне. Появились данные, что физиологические эффекты низкоинтенсивного лазерного света более выражены по сравнению с действием излучения той же спектральной области от нелазерных источников (Крюк и др., 1986). К концу 80-х годов был накоплен большой массив экспериментальных исследований и разработок клинического применения монохроматического света, который в настоящее время дополняется новыми исследованиями в различных направлениях (Avci et al., 2014; Carroll et al., 2014).
Были проведены эксперименты и на животных in vivo. Представляют интерес работы, в которых с помощью лазерного излучения проводилась коррекция эмбрионального развития. В работе (Бурлаков и др, 1997) облучение гелий-неоновым лазером неоплодотворённой икры в дальнейшем приводило к увеличению жизнеспособности эмбрионов в процессе развития, причём эффект наблюдался преимущественно на икре плохого рыбоводного качества, на хорошей икре заметного действия не наблюдалось. Исследования действия непрерывного излучения He-Ne лазера (632,8 нм) на физиологическое состояние икры рыб различных видов показали, что оптимальная доза излучения лежит в интервале 1 10-2-3 10-2 Дж/см2 (Попова и Осташков, 1993). В экспериментах, проведённых на эмбрионах вьюна (Мелехова, 2010), было показано, что развитие нарушается начиная с плотности мощности излучения 6-10 Вт/см2 для He-Ne лазера (632,8 нм) и 1,3 Вт/см2 для азотного лазера (337 нм). Наиболее чувствительными к лазерному облучению являются стадии эмбрионального развития, связанные с детерминацией генной активности и морфогенезом, т.н. критические периоды развития (Мелехова, 2010).
Имеется множество работ по изучению действия лазерного излучения на различные клеточные культуры. Лазерное излучение при определённых параметрах способно как стимулировать, так и угнетать пролиферативную активность различных клеточных культур (Байбеков и Мусаев, 1983; Ченских и др., 1975; Москвалик и Козлов, 1980; Попов, 1980). Например, при изучении действия гелий-неонового (632,8 нм) и гелий-кадмиевого (441,6 нм) лазеров на культуру клеток кожно-мышечной ткани эмбриона человека было показано (Крюк и др., 1986), что наблюдаемый эффект зависит от длины волны, плотности мощности, длительности облучения, а также функционального состояния объекта. Для гелий-неонового лазера наибольшее увеличение митотического индекса (до 123% по сравнению с контролем) наблюдалос ь п р и плотности мощности 30 мВт/см2 и длительности облучения 10 минут. При меньших значениях указанных параметров (5 мВт/см2, 2 минуты) эффект увеличения митотической активности становился менее выраженным, при увеличении плотности мощности до 2000 мВт/см2 или экспозиции до 30 минут наблюдалось уменьшение митотического индекса (70-90% от контрольной группы). Облучение клеток синим светом гелий-кадмиевого лазера в том же диапазоне плотности мощности и длительности приводило к ингибированию митотической активности до 78% от значения в контрольной группе. Указанные изменения наблюдались через 5 часов после облучения, через 24 часа значение митотического индекса в облучённых группах мало отличалось от значения в контроле.
Клеточные культуры теплокровных
Через 24 после облучения в облучённых и контрольных группах производили подсчет числа клеток. Для этого в чашках Петри заменяли ростовую среду на 1 мл раствора трипсина, и, добившись открепления клеток с поверхности, ингибировали активность трипсина добавлением 1 мл ростовой среды. Пипетированием суспензию доводили до моноклеточного состояния, и, взяв из чашки Петри аликвоту суспензии, производили подсчёт концентрации клеток в камерах Горяева. Каждый вариант эксперимента был выполнен не менее чем в 6 повторностях.
При выполнении иммуноцитохимического окрашивания в качестве первичных антител использовали кроличьи поликлональные антитела Anti-Ki67 (Abcam, Великобритания, кат.№ ab15580), в качестве вторых антител использовали ослиные поликлональные антитела, конъюгированные с флуорохромом DyLight488 (Abcam, Великобритания, кат.№ ab5694). Клетки фиксировали 4%-ным параформальдегидом в течение 20 мин при комнатной температуре. Фиксацию производили через 18 ч после облучения. После отмывки фиксатора в фосфатном буфере PBS для блокировки неспецифического связывания антител клетки инкубировали в 5%-ном растворе бычьего сывороточного альбумина (Sigma-Aldrich, США), содержащем 1% тритона Х-100 (Panreac, Испания) и 0.1% Tween-20, при комнатной температуре в течение 30 мин. Далее клетки инкубировали в растворе первичных антител (в концентрации, рекомендованной производителем) в течение 12 ч при температуре 40 С, промывали раствором PBS и инкубировали в растворе вторых антител (в концентрации, рекомендованной производителем) в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем отмывали и докрашивали ядерным красителем Hoechst 33342 (2 мкг/мл, Sigma, США) в течение 15 мин. В качестве отрицательного контроля (контроль неспецифического связывания антител) использовали аналогичные препараты, обработанные только вторыми антителами.
При выполнении цитохимического окрашивания использовали ядерный краситель DAPI. Клетки фиксировали в 3,7% парафенолальдегиде (фирма), для пермобилизации мембраны добавляли 1% тритон X-100, в течение 5 минут производили окрашивание в DAPI. Для отмывки и приготовления растворов использовали PBS (Панэко, Россия). DAPI связывается с AT парами в ДНК, что позволяет различить форму ядра в интерфазных клетках, фазу митоза, а также конечные стадии апоптоза.
После цитохимического и иммуноцитохимического окрашивания фиксированные клетки наблюдали с помощью микроскопа конфокального микроскопа Olympus FV10i. Подсчитывали число делящихся клеток, число аномально делящихся клеток и клеток на заключительных стадиях апоптоза на тысячу клеток по общепринятой методике (Polyakov et al., 2007), Рисунок 18. гематоксилин эозин; Б – нерасхождение хромосом в анафазе, окраска DAPI; В – апоптоз, окраска DAPI.
Для измерения содержания свободных радикалов, в том числе активных форм кислорода (АФК) в ростовой среде непосредственно после облучения использовали иодид-иодатный метод (Hochanadel, 1952; Fernandez et al., 2003). Йодид взаимодействует с пероксидом водорода по схеме: H2O2 + 3I- + 2H+ = I3- + 2H2O. Образующийся в результате реакции йодат I3- имеет пик поглощения при длине волны 354 нм. Градуировка измерений по содержанию H2O2 в исследуемом растворе показала чувствительность данного метода в пределах 0.3 мкМ/мл. Йодид-реагент приготавливали перед использованием путём смешивания двух водных растворов А (6.6 % KI, 0.2 % NaOH, 0.04% (NH4)6Mo7O244H2O) и Б (2 % KHC8H4O4).
Для акустических измерений применяли игольчатый пьезоэлектрический гидрофон Mller-Platte Needle Probe (Германия) с предусилителем, предназначенный для регистрации высокочастотного ультразвука и ударных волн в жидкостях в диапазоне 500 кГц-15 МГц. Гидрофон снабжен чувствительным полусферическим наконечником из материала PVDF диаметром порядка 400 мкм. Во время измерений наконечник гидрофона погружали в жидкость и устанавливали на расстоянии 3-10 мм от точки фокусировки лазера. Чувствительность гидрофона обеспечивала регистрацию изменения давления на величину более 1 атм. Оценку спектральных характеристик механических колебаний, возникающих при взаимодействии фемтосекундных лазерных импульсов с жидкостью, в области звуковых частот производили с помощью оригинального лазерного регистратора возмущений на поверхности жидкости в чашке Петри. Поверхностные возмущения регистрировали по отклонению пучка непрерывного лазера (0.5 мВт, 650 нм), который фокусировался на поверхности жидкости в пятно 10 мкм на расстоянии 1-12 мм от точки фокусировки фемтосекундного импульса. Отраженный от поверхности жидкости пучок направлялся через диафрагму на фотодиод с полосой частот до 4 МГц. При прохождении поверхностных волн возмущения через область фокусировки, отраженный от поверхности волны пучок лазера изменял направление и смещался на диафрагме, вызывая изменение сигнала с фотодиода, который регистрировался с помощью запоминающего осциллографа LeCroy 6051A.
Цитохимическое и иммуноцитохимическое окрашивание
В условиях интенсивного фемтосекундного лазерного поглощения, если плотность мощности превышает 1011 Вт/см2, возможна многофотонная диссоциация и ионизация молекул воды (Vogel et al., 2005) и компонент культуральной среды в области фокусировки лазерного пучка, что в конечном итоге может сопровождаться образованием АФК перекисного типа. В наших экспериментах плотность мощности достигала 3,21013 Вт/см2 (Таблица 7). Уровень концентрации пероксида водорода и (или) гидроперекисей, измеренный йодатным колориметрическим методом (Hochanadel et al., 1952), оказался ниже предела чувствительности наших измерений (менее 0,3 мкМ/мл).
При плотности мощности 3,2 1013 Вт/см2 в области фокусировки лазерного пучка генерируется плазма высокой плотности (Vogel et al, 2005). Эта плазма поглощает падающее излучение фемтосекундного лазера с высокой эффективностью, и поглощенной энергии импульса может быть достаточно для образования микрокавитационного пузырька в жидкости. Расширение и схлопывание микрокавитационного пузырька генерирует в среде широкополосный (до десятков МГц) акустический сигнал (Vogel et al., 2005). Проведенные нами измерения при помощи игольчатого гидрофона акустических волн в диапазоне 500 кГц—15 МГц показали, что используемые параметры лазерного воздействия не приводят к заметному превышению возникающего акустического сигнала над уровнем шума, а уровень генерирующихся импульсов давления на расстоянии 3 мм от точки фокуса лазера в высокочастотном диапазоне не превышает 1 атм. Под действием сфокусированных лазерных импульсов на поверхности жидкости наблюдались распространяющиеся из области воздействия капиллярные волны. Качественный анализ спектров сигналов, зарегистрированных с помощью лазерного регистратора возмущений показал, что энергия этих поверхностных возмущений сосредоточена в диапазоне 0.5—6 кГц (рис. 3).
Воздействие фемтосекундными лазерными импульсами на клеточные культуры МСК и HaCaT приводило к увеличению числа клеток облучённых группах по сравнению с контролем через 24 часа после облучения. Следует подчеркнуть, что для обеих культур получены похожие дозовые зависимости: увеличение пролиферации происходит при использовании наименьших доз, а при высоких дозах изменения скорости пролиферации клеток нет. Так, облучение кератиноцитов линии HaCaT относительно малыми дозами (6, 12 и 143 Дж/см2) вызывало увеличение числа клеток через 24 часа после облучения (на 54, 32 и 40% - Таблица 7), а также приводило к увеличению доли делящихся клеток через 18 ч после облучения (Рисунок 33). При этом наибольшее увеличение числа клеток (на 54% по сравнению с контролем) было зарегистрировано при использовании самой малой дозы облучения (6 Дж/см2). Облучение кератиноцитов HaCaT самыми большими дозами из используемых (1433 и 4299 Дж/см2) не вызывало достоверных отличий от контрольной группы. Достоверное увеличение числа клеток через 24 часа после облучения в культуре МСК наблюдалось только при самой малой из используемых доз (6 Дж/см2) и составляло 18% (Таблица 7). Таблица 7. Изменение числа клеток в облучённых образцах по сравнению с контрольными группами через 24 часа после облучения фемтосекундными лазерными импульсами в клеточных культурах HaCaT и МСК. режим облучения 1 2 3 4 5 частота следования импульсов (Гц) 2 2 60 60 60 время облучения (с) 2,5 5 2 60 60 энергия импульса (мкДж) ЗО ЗО ЗО 10 ЗО пиковая плотность мощности (Вт/см2) 3,2 1013 1,07 1013 3,2 1013 доза (Дж/см2) 6 12 143 1433 4299 Изменение числа клеток в облучённых образцах по сравнению с контрольными группами через 24 часа после облучения в клеточных культурах (%): HaCaT 154,4 131,7 140,1 94,4 121,4 МСК 118,5 112,9 95,8 112,0 103,2
Помимо фотобиомодуляции (Кару, 2001; Karu and Passarella, 2014) и изменения уровня АФК (Gamaley and Klybin, 1999; Voeikov, 2010) в случае воздействия фемтосекундных лазерных импульсов на клетки могут играть роль оптомеханические явления (Yusupov et al., 2010; Yusupov et al., 2011). Известно, что за счёт нелинейного оптического эффекта сфокусированные фемтосекундные лазерные импульсы способны создавать быстро расширяющиеся микропузырьки (Schaffer et al., 2002). Генерация акустических волн сфокусированным лазерным импульсом имеет характер точечного источника; так, для импульсов длительностью 100 фс с энергией 1 мкДж, область сверхзвукового расширения ограничивается 7 мкм. При указанной энергии пузыри достигают максимального размера в 100 мкм через 5 мкс, при этом общее время существования пузыря составляет 11 мкс. Расширение и схлопывание кавитационного пузырька порождает широкий спектр акустических волн. Исследования показали, что такие механические воздействия существенно влияют на ряд метаболических процессов в клетке (Janmey and McCulloch, 2007; Huang et al., 2010) и могут приводить, в частности, к стимуляции клеточных делений (Чайлахян и др., 2013).
В нашей работе исследование возникающего широкополосного спектра акустических колебаний проведено в высокочастотном ультразвуковом (500 кГц—15 МГц) и низкочастотном (звуковом) диапазонах. Выполненные при помощи игольчатого гидрофона акустические измерения показали, что уровень генерирующихся в высокочастотном диапазоне импульсов давления на расстоянии 3 мм от точки фокуса лазера не превышает 1 атм. При этом лазерный регистратор поверхностных возмущений выявил наличие механических колебаний в диапазоне 0.5—6.0 кГц. Ранее отмечалось, что акустические импульсные воздействия в звуковом диапазоне частот с амплитудой 0.003 атм. приводят к стимуляции пролиферации клеток (Чайлахян и др., 2013).