Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 История изучения комплекса мономорфных видов из линии Polyommatus admetus 15
1.1 Изучение комплекса, основанное на анализе морфологии бабочек 15
1.2 Изучение комплекса, основанное на исследовании хромосом 16
1.3 Изучение комплекса, основанное на исследовании молекулярных маркеров 19
1.4 Видовая диагностика при помощи митохондриальных ДНК-баркодов 23
Глава 2 Материал и методы 28
2.1 Материал 28
2.2 Методы 37
2.2.1 Анализ рисунка крыльев 37
2.2.2. Анализ кариотипов 37
2.2.3 Пробоподготовка 37
2.2.3.1 Выделение ДНК. 37
2.2.3.2 Амплифиация ДНК 38
2.2.3.2.1 Полимеразная цепная реакция фрагмента гена COI 38
2.2.3.2.2 Полимеразная цепная реакция фрагмента ITS2 38
2.2.3.3 Визуализация результатов выделения ДНК и ПЦР 39
2.2.3.4 Очистка продуктов ПЦР 39
2.2.3 Филогенетический анализ 42
2.2.3.1 Особенности выравниваний 42
2.2.3.2 Методы и программы для построения филогенетических реконструкций 42
2.2.3.3 Медианная сеть гаплотипов 43
Глава 3 Морфология имаго: типы крылового рисунка 45
Глава 4 Анализ хромосомного разнообразия 53
Хромосомные числа у представителей комплекса мономорфных видов 53
Глава 5 Анализ молекулярных маркеров 66
5.1 Анализ филогенетических реконструкций 66
5.2 Анализ медианной сети 74
Глава 6 Видовая идентификация, делимитация видов и классификация группы 83
6.1 Картирование морфологических данных на молекулярную филогению 83
6.2 Картирование хромосомных данных на молекулярную филогению 85
6.3. Видоспецифичность фрагмента COI 90
6.4 Анализ молекулярных и хромосомных кластеров, обнаруженных в симпатрии 94
6.5 Анализ молекулярных и хромосомных кластеров, обнаруженных в аллопатрии 96
6.6 Возможность альтернативных классификаций 98
Заключение 105
Выводы 107
Литература 109
Приложение 1 Дополнительные филогенетические деревья 130
Приложение 2 Описания видов, выявленных в ходе исследования 136
- Изучение комплекса, основанное на исследовании молекулярных маркеров
- Морфология имаго: типы крылового рисунка
- Анализ медианной сети
- Возможность альтернативных классификаций
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Подрод Agrodiaetus является обособленной монофилетической линией в роде Polyommatus, входящем в семейство бабочек-голубянок (Lycaenidae). Бабочки подрода небольшого размера, в размахе крыльев от 1.9 до 3.6 см. По окраске крыльев представители подрода могут быть диморфными (у самок крылья коричневые, у самцов – синие, оранжевые или серые) или мономорфными (крылья самцов и самок окрашены одинаково в коричневый цвет). Апоморфией подрода Agrodiaetus является наличие белой продольной полосы на исподе заднего крыла, хотя есть виды, у которых полоса вторично редуцирована или отсутствует (Eckweiler, Bozano, 2016). Подрод широко распространён в Западной Палеарктике (Kandul et al., 2007) и насчитывает 120 видов (Eckweiler, Bozano, 2016).
Подрод Agrodiaetus всегда привлекал внимание исследователей-систематиков (например, de Lesse, 1960; Huser, Eckweiler, 1997; Carbonell, 2000, 2001; ten Hagen, Eckweiler, 2001; Schurian, ten Hagen, 2003; Lukhtanov, Dantchenko, 2002; Kandul et al., 2002, 2004, 2007; Wiemers, 2003; Vila et al., 2010; Talavera et al., 2013a; Eckweiler, Bozano, 2016). Однако его нельзя назвать хорошо изученным в силу наличия морфологически схожих таксонов, определение которых затруднительно. Эти таксоны практически не различаются по окраске и рисунку крыла (Eckweiler, Bozano, 2016), и по строению гениталий самцов (Coutsis, 1985, 1986).
Для решения проблем делимитации видов Agrodiaetus широко используются хромосомные (de Lesse, 1960; Lukhtanov, 1989) и молекулярные маркеры (Wiemers, 2003; Kandul et al., 2004, 2007; Lukhtanov et al., 2005; Stradomsky, Fomina, 2013), а также их комбинация (Lukhtanov et al., 2014, 2015; Lukhtanov, Tikhonov, 2015; Shapoval, Lukhtanov, 2015; Vila et al., 2010). Использование хромосомных маркеров считается эффективным, так как кариотипы большинства видов специфичны (гаплоидное число хромосом в пределах подрода варьирует от n = 10 у P. caeruleus до n = 134 у P. shahrami (Lukhtanov, Dantchenko, 2002; Lukhtanov et al., 2005)).
На основе молекулярных исследований было установлено, что подрод Agrodiaetus состоит из двенадцати клад (Kandul et al., 2002, 2004, 2007; Wiemers, 2003). Особый интерес представляют две клады, объединяющие виды, близкие к (1) P. admetus и к (2) P. dolus. На филогенетических реконструкциях эти клады образуют монофилетическую линию «Polyommatus admetus». В этой линии сосредоточены почти все мономорфные виды подрода, которые представляют особую сложность в идентификации. Представители клады admetus и мономорфные представители клады dolus объединяются в так называемый комплекс мономорфных видов подрода Agrodiaetus. Большинство из них имеют локальные ареалы, сконцентрированные на Пиренейском полуострове, Балканском полуострове, в Передней и Средней Азии, и на Кавказе.
Представители мономорфного комплекса в основном изучены с территории Западной Европы. Гораздо менее изученными остаются представители комплекса,
обитающие восточнее: на Балканском полуострове и в Передней Азии. Особенно это касается исследований, основанных на применении молекулярных данных.
Степень разработанности. На данный момент известно немного публикаций, содержащих данные о нуклеотидных последовательностях гена COI и некодирующего спейсера ITS2 для некоторых таксонов, обитающих на территории Балканского полуострова и Передней Азии (Wiemers, 2003; Wiemers et al., 2007, 2009, 2010; Dinc et al., 2013; Lukhtanov et al., 2009, 2015a; Vila et al., 2010; Przybyowicz et al., 2014). Этих данных недостаточно для решения имеющихся в группе таксономических проблем, так как для большинства таксонов, обитающих на этих территориях, данные молекулярных исследований отсутствуют.
Цель и задачи исследования. Целью работы было исследование морфологического, хромосомного и молекулярного разнообразия в комплексе мономорфных видов голубянок P. admetus с территории Балканского полуострова, Ирана и Азербайджана, таксономическая интерпретация полученных данных и изучение возможности видовой идентификации с помощью морфологических признаков, а также хромосомных и молекулярных маркеров.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
-
изучение разнообразия крылового рисунка и выявление тех его элементов, которые можно потенциально использовать для делимитации видов и популяций;
-
анализ всех имеющихся в литературе данных по кариотипам, картирование хромосомных данных на молекулярные деревья и анализ того, насколько кластеры особей, выделяемых по кариотипам, конгруэнтны кластерам, выделяемым на основании молекулярных маркеров;
-
получение и анализ молекулярных данных; выявление митохондриальных гаплогрупп и молекулярных эволюционных линий в пределах комплекса, анализ родственных связей между популяциями, хромосомными расами и видами, основанный на методах молекулярной филогенетики;
-
тестирование гипотезы о том, что симпатрично обитающие хромосомные расы представляют собой репродуктивно изолированные биологические виды;
5) таксономическая интерпретация обнаруженного морфологического,
хромосомного и молекулярного разнообразия в рамках концепций
биологического и филогенетического вида;
6) оценка применимости ДНК-баркодов для видовой диагностики.
Научная новизна. Впервые детально изучена фауна комплекса мономорфных видов подрода Agrodiaetus Балканского полуострова, Ирана и Азербайджана. Впервые получены нуклеотидные последовательности по участку гена COI и ядерному маркеру ITS2 для таксонов подрода Agrodiaetus, обитающих на территории Балканского полуострова, Азербайджана и Ирана. Эти данные позволили реконструировать филогенетические отношения в группе Polyommatus (Agrodiaetus) admetus. При помощи анализа молекулярных и цитогенетических маркеров обнаружены виды-двойники: P. pseudorjabovi/P. rjabovianus/P. valiabadi,
P. timfristos/P. aroaniensis и P. admetus/P. yeranyani. Уточнены ареалы некоторых таксонов и описаны два новых для науки вида и один подвид. Впервые особенности окраски крыльев представлены в виде семи типов, соответствующих определённым таксонам Agrodiaetus.
Теоретическое и практическое значение работы. Результаты, полученные в ходе работы, вносят вклад в изучение систематики, филогении и распространения представителей комплекса Polyommatus admetus. Полученные молекулярные данные значительно дополняют накопленные ранее данные по нуклеотидным последовательностям участка гена COI, а также ядерной некодирующей последовательности ITS2. Эти данные, а также данные по кариотипам, картированные на полученную филогению комплекса, могут быть впоследствии использованы для разработки системы всего семейства Lycaenidae. Бабочки подрода Agrodiaetus являются модельным объектом в исследованиях по изучению механизмов видообразования и разработки методов изучения биологического разнообразия, поэтому изучение таксономии группы опосредованно может быть полезным для решения общих вопросов эволюционной биологии. Разработанные с использованием этой группы методы делимитации видов, в частности с использованием молекулярных и цитогенетических маркеров, могут быть использованы как прототипы для анализа биологического разнообразия других групп животных и растений. Некоторые виды подрода Agrodiaetus имеют точечные ареалы, и потенциально являются объектами охраны. Материалы работы могут быть также использованы в образовательных курсах на кафедрах энтомологии и зоологии беспозвоночных различных вузов.
Методология и методы исследования. Для осуществления поставленных задач были использованы современные методы молекулярной биологии, такие как выделение ДНК, ПЦР со специфичными праймерами по фрагменту гена COI и спейсера ITS2, очистка проб для секвенирования, и секвенирование. Для филогенетического анализа полученных последовательностей были использованы специальные программы, позволяющие производить выравнивание последовательностей, построение филогенетических деревьев и сетей.
Положения, выносимые на защиту:
-
Морфологические признаки не могут быть использованы для диагностики таксонов (за исключением P. admetus), так как их состояния либо одинаковы у разных видов, либо не фиксированы внутри видов.
-
Несмотря на большое значение признаков кариотипа в систематике группы, хромосомные числа не являются универсальным признаком для дифференциации видов, так как одинаковые хромосомные числа могут либо возникать независимо в разных группах, либо быть симплезиоморфиями.
-
Несмотря на слабый уровень дифференциации, ДНК-баркоды пригодны для видовой диагностики в комплексе Polyommatus admetus.
-
Polyommatus valiabadi sensu auctorum является триплетом видов, состоящим из P. rjabovianus, P. pseudorjabovi и P. valiabadi sensu stricto. Эти виды в значительной степени различаются по хромосомным числам и ДНК-баркодам.
-
Polyommatus admetus sensu auctorum является сборным видом. Он представлен P. admetus sensu stricto, обитающим на территории Европы и Турции, и P. yeranyani, обитающим на территории Армении и Азербайджана.
Апробация результатов. Результаты работы были представлены на восьми конференциях, шесть из которых являются международными: 12-я Международная Пущинская школа-конференция молодых учёных «Биология – наука 21 века», Россия, Москва, Пущино, 10-14 ноября 2008; Международная конференция «Кариосистематика беспозвоночных животных KARYO V», Россия, Новосибирск, 16-20 августа 2010; 14 съезд Русского энтомологического общества, Россия, Санкт-Петербург, 27 августа – 1 сентября 2012; 7th International Conference on the Biology of Butterflies, Finland, Turku, 11-14 August 2014; Международная конференция «Хромосома 2015», Россия, Новосибирск, 24-28 августа 2015; VI международная конференция по кариосистематике беспозвоночных животных, Россия, Саратов, 27-30 августа 2016; Всероссийская конференция «50 лет ВОГиС: успехи и перспективы», Россия, Москва, 8-10 ноября 2016; 15 съезд Русского энтомологического общества, Россия, Новосибирск, 31 июля – 7 августа 2017; а также результаты были представлены в виде короткого сообщения на практическом курсе по R-программированию в Испании в 2015 году: “The use of Phylogenies in the Study of Macroevolution”, Spain, Barcelona, 28 September-2 October 2015.
Публикации. Основные результаты диссертации изложены в 4 статьях, из которых три в изданиях, рекомендованных ВАК. Всего по материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ.
Структура и объём работы. Работа состоит из введения, 6 глав, заключения, выводов, списка литературы и 2 приложений. Основная часть изложена на 129 страницах и содержит 7 таблиц и 24 рисунка. Список литературы включает 149 наименований, из которых 9 на русском языке и 140 на других языках. Приложения содержат дополнительные филогенетические реконструкции (6 иллюстраций) и видовые описания (с одной иллюстрацией). Общий объём диссертации с приложениями 144 страницы.
Личный вклад автора. Автор диссертационного исследования принимал активное участие во всех этапах изучения комплекса мономорфных видов на протяжении 10 лет: организация и сбор полевого материала в Алтайском крае; проведение лабораторных экспериментов (в т.ч. подбор подходящей методики выделения ДНК, разработка специфичных праймеров); обработка полученных сиквенсов; построение всех филогенетических реконструкций и медианных сетей; анализ полученных реконструкций и сетей; поиск и анализ всех литературных данных по хромосомным числам исследуемой группы; представлении результатов
на конференциях; написание и публикация статей и монографии; подготовка рукописи диссертации.
Благодарности. Я искренне благодарна моему научному руководителю В.А. Лухтанову за руководство проектом, ценные советы в выполнении работы и за предоставленный материал, а также А.Ф. Сайфитдиновой за помощь в освоении методов молекулярной биологии и руководство проектом в лаборатории. Я благодарна сотрудникам РЦ «Хромас», на базе которого проводилось исследование: А.В. Радаеву, И.В. Егияну, М.Д. Воронцову, М.Р. Кулешину и сотрудникам лаборатории «Структуры и функции хромосом» – Е.Р. Гагинской, С.А. Галкиной, Е.И. Кошель, А.Г. Дёмину – за помощь в вопросах филогенетики. Хочу поблагодарить А.П. Галкина – заведующего лабораторией генетики животных СПбГУ, где проходили первые этапы экспериментальной части исследования, за предоставленную возможность работы, и А.Э. Машарского и РЦ «Развитие молекулярных и клеточных технологий» за подготовленные сиквенсы. Отдельно хочу поблагодарить А.В. Данченко, Н.А. Шаповала, Е.А. Паженкову, С.В. Недошивину и А.В. Барабанова – за собранный материал. В заключении, я хочу поблагодарить моего мужа – Пантелеева Юрия Юрьевича – за моральную поддержку на протяжении всей подготовки диссертационного исследования.
Исследования проводились при финансовой поддержке со стороны Российского фонда фундаментальных исследований (гранты РФФИ 18-04-00263а и РФФИ 15-29-02533_офи_м) и Российского научного фонда (грант РНФ 14-14-00541).
Изучение комплекса, основанное на исследовании молекулярных маркеров
В связи с развитием молекулярных методов в конце двадцатого – начале двадцать первого столетия для выявления родственных отношений между таксонами у разных групп организмов систематики начали широко применять методы, основанные на сравнении нуклеотидных замен в отдельных генах или фрагментах генов (Kurtzman, 1994; Brown et al., 1999; Trewick, 2000). Настоящим прорывом в изучении подрода Agrodiaetus явились два независимых исследования, проведённые Вимерсом (Wiemers, 2003) и Кандулом с соавторами (Kandul et al., 2004). Оба исследователя, основываясь на анализе молекулярных данных (Вимерс использовал такие маркеры, как COI, ITS2, ND1 и 16 s rRNA, Кандул использовал три гена – COI, COII и EF1-), установили таксономическую структуру подрода Agrodiaetus и выделили двенадцать монофилетических линий (клад), среди которых были интересующие нас клады P. admetus и P. dolus (рис. 1). Эти клады в нсастоящее время интерпретируются в качестве групп видов (Ekweiler, Bozano, 2016).
Через год вышла работа Лухтанова с соавторами, существенная не только в исследовании подрода Agrodiaetus, но и в понимании механизмов эволюции в целом (Lukhtanov et al., 2005). Работа была сфокусирована на изучении усиления презиготической изоляции в зонах вторичного контакта и эволюции кариотипов у представителей Agrodiaetus.
В 2006 году Лухтанов с соавторами (Lukhtanov et al., 2006) провели ревизию клады P. dolus, используя молекулярные (маркеры COI, COII и tRNA-leu) и цитологические данные. В результате была выявлена новая таксономическая структура клады.
Ещё через год Кандул с соавторами (Kandul et al., 2007) опубликовали работу, в которой говорилось о разнообразии кариотипов и видообразовании у Agrodiaetus. В ней авторы картировали данные по кариотипам на данные, полученные в результае анализа двух митохондриальных генов COI и COII.
Позднее, Вимерс с соавторами решают проверить возможность использования ядерного мультикопийного маркера ITS2 для разрешения проблем систематики Agrodiaetus (Wiemers et al., 2009) по сравнению с COI. По результатам своего исследования они утверждают, что ITS2 также пригоден для исследования таких эволюционно молодых групп, как подрод Agrodiaetus.
Но следует заметить, например, что на реконструкциях, основанных на ITS2, таксоны P. alcestis karacetinae и P. alcestis не образовывали вместе одну кладу, также как и таксоны P. fulgens и P. ainsae. Положение остальных таксонов на предложенном в публикации дереве не противоречило известным данным, основанным на изучении митохондриального маркера COI (Kandul et al., 2004, 2007; Wiemers, 2003).
В 2010 году Вершинина и Лухтанов на основе анализа фрагмента митохондриального гена COI и кариотипов проводят исследование криптических видов P. demavendi, P. alcestis и P. karacetinae, и подтверждают гипотезу Вимерса о неконспецифичности P. karacetinae и P. alcestis (Vershinina, Lukhtanov, 2010).
В этом же году Вила c соавторами опубликовали крупное исследование представителей линии Polyommatus admetus, обитающих на территории Западной Европы (западнее 17-го меридиана), основанное на анализе четырёх молекулярных маркеров (COI, leuRNA, COII и ITS2) и цитологических маркеров (хромосомные числа). В этой работе авторы делали акцент на видах с точечным ареалом в Западной Европе. В работе авторы вносят коррективы в таксономию таких видов, как P. ripartii, P. dolus, P. fabressei и P. violetae.
В 2011 году Водолажский и соавторы, используя фрагмент гена COI, уточняют видовую принадлежность и таксономическое положение бабочек P. ripartii из Монголии (Vodolazhsky et al., 2011).
Две крупные работы, основанные на молекулярном исследовании представителей комплекса мономорфных видов, вышли в 2013 и 2014 годах (Dinc et al., 2013a; Przybyowicz et al., 2014). Обе работы были посвящены систематическому положению и структуре вида P. ripartii. Пржибылович с соавторами на основе анализа фрагмента генов COI, COII, а также tRNA-leu и ядерного маркера ITS2 исследовал популяции P. ripartii в Польше. Тем временем Динка с соавторами, используя маркеры COI и COII, изучили P. ripartii из Европы и Сибири и выявили три линии – западноевропейскую, евроазиатскую и балканскую линии. Эти три линии, взятые вместе, не образовывали на деревьях монофилетический кластер, но, тем не менее, авторы не стали опровергать их конспецифичность.
В 2016 году вышла работа Леоны Ловренчик с соавторами, в которой при помощи молекулярно-филогенетических методов удалось выяснить, что бабочки, обитающие в Хорватии и ранее определяемые, как P. aroaniensis, по митохондриальному маркеру оказались P. ripartii (из евроазиатской линии) (Lovreni et al., 2016).
Чераз год Влад Динка с соавторами приводят результаты исследования представителей Agrodiaetus Румынии на основе анализа фрагментов генов COI и COII. Среди исследуемых видов из мономорфного комплекса видов в работе представлены два – P. ripartii и P. admetus. Авторы подтверждают наличие P. admetus для фауны Румынии, но, так как P. ripartii представлен лишь в единичном экземпляре, авторы не дают уверенного заключения об ареале этого вида в Румынии (Dinc et al., 2017).
Таким образом, изучению комплекса мономорфных видов на основе анализа молекулярных маркеров посвящено порядка 11 работ (Kandul et al., 2004, 2007; Wiemers, 2003; Lukhtanov et al., 2005, Lukhtanov et al., 2006; Dinc et al., 2013, 2017; Vershinina, Lukhtanov, 2010; Vodolazhsky et al., 2011; Przybyowicz et al., 2014; (Lovreni et al., 2016). Практически все работы включают анализ либо несколько маркеров (ядерные и митохондриальные), либо анализ маркеров молекулярных вместе с маркерами цитогенетическими (хромосомные числа). Работы по молекулярной филогенетике, и работы по комплексу мономорфных видов в целом направлены на изучение западноевропейской фауны. В то же время остаётся неохваченной фауна Балканского полуострова и Передней Азии.
Морфология имаго: типы крылового рисунка
Традиционно при описании видов бабочек используют такие признаки, как окраска крыльев, крыловой рисунок и структура генитального аппарата самцов. В исследуемой нами группе чешуекрылых строение генитального аппарата идентично или практически не различимо у разных видов (Coutsis, 1986), а одной из основных особенностей бабочек является сходная коричневая окраска верхней стороны крыльев. Что касается испода крыльев, то между таксонами и популяциями существуют небольшие различия, которые позволяют выделить семь типов крылового рисунка (рис. 5-9).
(1) Тип Polyommatus ripartii: испод заднего крыла с хорошо развитой белой продольной полосой, пятна небольшие или среднего размера, прикраевой (маргинальный) рисунок редуцирован. Такой тип крылового рисунка встречается как у представителей группы P. admetus, так и у представителей группы P. dolus, например, P. orphicus orphicus, P. orphicus eleniae, P. nephohiptamenos, P. ripartii pelopi и P. timfristos.
(2) Тип Polyommatus valiabadi: испод заднего крыла с хорошо развитой белой продольной полосой, пятна крупные и яркие, прикраевой (маргинальный) рисунок присутствует. Данный тип характерен для P. valiabadi, P. rjabovianus и P. pseudorjabovi из Ирана и Азербайджана (Lukhtanov et al., 2015). Такой тип окраски крыльев не встречается среди европейских видов Agrodiaetus.
(3) Тип Polyommatus admetus: на исподе заднего крыла отсутствует белая продольная полоса, пятна небольшие или среднего размера, маргинальный рисунок очень чёткий. Данный тип крылового рисунка характерен для P. admetus.
(4) Тип Polyommatus nephohiptamenos: белая полоса на исподе заднего крыла явная и очень широкая, состоит из основной полосы и дополнительного короткого штриха между постдискальной и субмаргинальной областью крыла, сразу под основной полосой; пятна небольшие или среднего размера, прикраевой (маргинальный) рисунок редуцирован. Такой тип встречается у P. nephohiptamenos, нередко у P. ripartii, обнаружен также у P. orphicus orphicus и P. timfristos.
(5) Тип Polyommatus humedasae: на исподе заднего крыла белой полосы нет, пятна небольшие или среднего размера, маргинальный рисунок редуцирован, бледный. Такой тип обычен для P. aroaniensis, P. timfristos и P. orphicus. Он характерен для некоторых популяций P. ripartii из Западной Европы (но не с Балканского полуострова).
(6) Тип Polyommatus aroaniensis: белая полоса на исподе заднего крыла в разной степени редуцирована, пятна небольшие или среднего размера, маргинальный рисунок редуцирован. Этот тип обнаружен у P. aroaniensis, P. timfristos, P. orphicus orphicus и P. orphicus eleniae. Также он обнаружен в популяции P. ripartii из Крыма (Vila et al., 2010) (но не с Балканского полуострова).
(7) Тип Polyommatus orphicus: на исподе переднего крыла присутствует белый постдискальный штрих, расположенный между дискальным пятном и субмаргинальным рисунком, белая продольная полоса на исподе заднего крыла заметная, часто с дополнительным маленьким штришком. Такой тип рисунка характерен для P. orphicus orphicus (хотя не обязательно), однако, основная особенность этого типа – белый постдискальный штрих на переднем крыле – может быть встречен среди разных видов, например, P. aroaniensis и P. nephohiptamenos.
Типы крылового рисунка и все представители комплекса мономорфных видов также представлены в сводной таблице (см. табл. 2).
Анализ медианной сети
Сложные взаимоотношения между видами клад P. admetus и P. dolus были также отражены в медианной сети, построенной на базе фрагмента гена COI (рис. 19, 20, табл. 4). Для построения сети были использованы нуклеотидные последовательности 191 образца (как балканских, так и среднеазиатских), которые объединялись в 96 гаплотипов и 26 гаплогрупп: 10 гаплогрупп в кладе P. admetus и 16 гаплогрупп в кладе P. dolus. Вид Polyommatus ripartii, представленный 82 образцами, был разделён на 38 гаплотипов и 4 гаплогруппы. Каждая гаплогруппа соответствует кладам P. ripartii, образованным на дереве COI: гаплогруппа, образованная подвидом P. ripartii pelopi (образцы с территории Балканского полуострова), гаплогруппа P. ripartii paralcestis (образцы из Малой Азии), и две гаплогруппы, образованные номинативным подвидом P. ripartii ripartii (бабочки, обитающие на территории от Монголии до Европы, и бабочки, обитающие на территории Западной Европы).
P. admetus представлен двумя гаплогруппами: одна образована образцами с территории Балканского полуострова и западной Турции (P. admetus admetus), другая – образцами из Армении и Азербайджана (P. admetus yeranyani + P. admetus malievi). Данные группы расположены далеко друг от друга (это можно увидеть по количеству замен между гаплогруппами) (рис. 19).
P. nephohiptamenos (4 гаплотипа, основанные на 9 образцах) образует отдельную гаплогруппу от P. ripartii.
Дополнительным результатом нашего исследования оказалось выявление положения P. demavendi. Нам удалось выявить, что на медианной сети P. demavendi представлен двумя гаплогруппами. Одна образована P. demavendi belovi, другая – P. demavendi lorestanus. Также наша сеть демонстрирует, что P. pseudorjabovi и P. khorasanensis представлены двумя отдельными гаплогруппами.
Что касается группы P. dolus, мы хотели бы отметить, что все ранее описанные виды, кроме P. fulgens и P. fabressei, представлены разными гаплогруппами. P. fulgens и P. fabressei являются близкими видами, и даже имеют один общий гаплотип (рис. 20), несмотря на чёткие различия в крыловом рисунке и кариотипе.
Также весьма важным было отразить взаимоотношения между таксонами P. orphicus orphicus, P. orphicus eleniae, P. aroaniensis, и P. timfristos sp. nov. Polyommatus orphicus orphicus и P. orphicus eleniae появляются рядом на сети, хотя не имеют ни одного общего гаплотипа. P. orphicus orphicus представлен четырьмя гаплотипами, основанными на 15 образцах. P. orphicus eleniae представлен двумя гаплотипами, основанными на 4 образцах. Кроме того, P. orphicus orphicus и P. dantchenkoi расположены обособленно друг от друга, а P. aroaniensis представлен двумя гаплотипами, которые расположены обособленно от P. timfristos (рис. 20).
Медианная сеть чётко отражает взаимоотношения между P. valiabadi и P. rjabovianus: первый вид представлен одним гаплотипом, второй вид имеет три гаплотипа, обособленные от P. valiabadi (рис. 20).
Возможность альтернативных классификаций
В соответствии с биологической концепцией вида (Poulton, 1904; Mayr, 1963) популяции считаются отдельными видами, если они репродуктивно изолированы друг от друга. Эта изоляция может не быть полной, но должна быть достаточной для того, чтобы предотвратить смешение таксонов в случае перекрывания их ареалов (Mayr, 1963; Coyne, Orr, 2004). Биологические виды могут быть политипичными (Poulton, 1904; Mayr, 1963), то есть состоять из морфологически и молекулярно различающихся групп популяций. В соответствии с политипической концепцией вида таксоны в аллопатрии можно считать подвидами одного вида, если нет доказательств репродуктивной изоляции между ними.
В соответствии с филогенетической концепцией вида (Cracraft, 1989; Coyne, Orr, 2004) разными видами могут считаться дискретные филогенетические линии (вне зависимости от того, существует между ними репродуктивная изоляция или нет). Иными словами, вид – наименьшая монофилетическая группа с уникальной комбинацией признаков.
Обе концепции (биологическая и филогенетическая) совместимы, так как подвиды в рамках биологической концепции вида могут быть классифицированы как виды в рамках филогенетической концепции вида.
Таким образом, в терминах практической таксономии можно считать, что филогенетический вид – это линия (клада), а биологический политипический вид – максимально возможная совокупность аллопатрических популяций, образующих монофилетическую группу, для которой не показано, что это искусственный комплекс. Существование разных определений вида говорит о вероятности разных классификаций. Общепринятая система европейских дневных бабочек (см. Tolman, Levington, 2002) эклектична: в ней есть и политипические виды, и узко локальные виды, которые удовлетворяют концепции филогенетического вида, но при желании их можно рассматривать, как подвиды и объединять в политипические комплексы. Этот эклектизм прослеживается и в наших собственных публикациях. Так, в работе 2015 года (Lukhtanov et al., 2015) локальная хромосомная раса P. rjabovianus masul была интерпретирована в качестве подвида более широкораспространенного вида P. rjabovianus (т.е. использована политипическая концепция вида). В работе 2016 года (Vishnevskaya et al., 2016) в сходной ситуации таксон P. timfristos был интерпретирован как локальный вид (т.е. использована филогенетическая концепция вида), в то время как теоретически его можно было интерпретировать в качестве подвида P. aroaniensis.
Варианты интерпретации спорных классификаций:
1) rjabovianus/ masul
Переднеазиатский вид P. rjabovianus s.str. представлен двумя аллопатричными популяциями: популяция из Талыша (Азербайджан) и популяция из Масуле (Иран). Фенотипически особи из обеих популяций сходны. На филогенетическом дереве, построенном по фрагменту гена COI, а также на филогенетической сети (рис. 17, 20, 23), представители обеих популяций с высокой поддержкой кластеризовались вместе, хотя особи из Масуле внутри кластера образовывали монофилетическую группу также с высокой поддержкой. Однако анализ данных по кариотипам продемонстрировал различия в хромосомных числах двух популяций: для представителей из Талыша характерно хромосомное число, равное n=49, в то время как для представителей из Масуле характерно хромосомное число n=43, то есть популяции различаются как минимум шестью фиксированными хромосомными перестройками. В нашем исследовании (Lukhtanov et al., 2015) мы предложили рассматривать популяцию из Масуле в качестве подвида – rjabovianus masul, то есть была использована концепция биологического политипического вида. Тем не менее, если мы будем придерживаться филогенетической концепции вида, то популяцию с отличным хромосомным числом (хромосомную расу), можно считать и обособленным видом Polyommatus masul, с точечным ареалом обитания в Северном Иране. Незначительные различия в исследуемом фрагменте COI (всего две фиксированные замены) можно объяснить невысокой скоростью эволюции этого участка гена в данной популяции (Vishnevskaya et al., 2017).
2) timfristos/ humedasae/ aroaniensis/ orphicus
Если мы будем придерживаться концепции биологического политипического вида, то таксоны P. humedasae – P. orphicus – P. timfristos – P. aroaniesnsis можно интерпретировать как один политипический вид. Все они аллопатричны, а на конкатенированном дереве (рис. 18, 24) со средним значением поддержки кластеризуются вместе. В этом контексте, данную группу можно рассматривать, как линию с различающимися популяциями, каждая из которых имеет уникальный генетический маркер (кариотип). Различия в числах хромосом не обязательно приводят к полной репродуктивной изоляции, и в некоторых случаях не препятствуют межвидовой гибридизации и генетической интрогрессии (Lukhtanov et al., 2015b). Но даже если последнее утверждение справедливо, это не значит, что хромосомные перестройки не имеют отношения к образованию генетических барьеров между популяциями. Ранее в исследованиях других авторов было продемонстрировано, что хромосомные изменения играют важную роль в видообразовании у голубянок (Lukhtanov et al., 2005, 2015b; Kandul et al., 2007; Talavera et al., 2013b). Даже слабое снижение фертильности у гетерозигот может привести к формированию границы между гомозиготными популяциями. Следовательно, эту группу (P. humedasae – P. orphicus – P. timfristos – P. aroaniesnsis) можно также интерпретировать в качестве 4-х видов.
3) alcestis/ karacetinae/ dantchenkoi/ eriwanensis/ interjectus
Теоретически, следуя предыдущей схеме, а именно концепции биологического политипического вида, мы можем объединить в один вид и группу таксонов alcestis/ karacetinae/ dantchenkoi/ eriwanensis/ interjectus. Все эти таксоны обитают в аллопатрии. На дереве, построенном методом BI по фрагменту гена COI, они образуют кладу с поддержкой 96, а на конкатенированном дереве, построенном методом BI – с поддержкой 99 (рис. 17, 23). По фенотипу таксоны схожи, но различаются хромосмными числами. Но если руководствоваться утверждением, что различия в числах хромосом не обязательно приводят к полной репродуктивной изоляции, и в некоторых случаях не препятствуют межвидовой гибридизации и генетической интрогрессии (Lukhtanov et al., 2015b), данную группу таксонов можно рассматривать как один вид с несколькими подвидами, каждый из которых имеет уникальный кариотип.
Таким образом, в таблице 6 мы предлагаем два варианта классификации для группы P. dolus. В случае группы P. admetus обе классификации – как основанная на филогенетической концепции вида, так и основанная на политипической концепции вида – будут одинаковыми (табл. 7).
Не существует объективных критериев для выбора между этитми двумя классификациями в качестве единственной системы. В этой ситуации нам кажется целесообразным в качестве наиболее предпочтительной использовать ту систему, которая в наибольшей степени соответсвует традиционным (общепринятым) представлениям об объеме видов в изучаемом комплексе. Эти представления даны в последней полной опубликованной сводке по подроду Agrodiaetus (Eckweiler, Bozano, 2016). В этой системе такие таксоны как P. dantchenkoi, P. eriwanensis, P. interjectus, P. rjabovianus, P. valiabadi, P. aroaniensis и P. humedasae рассматриваются в качестве самостотельных видов, что соотвествует первой классификации (филогенетическая концепция вида). Поэтому предлагаем использовать эту классификацию (табл. 6, левая колонка) в качесвте основной.