Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Бактериофаги: факторы эволюции возбудителей внутрибольничных инфекций и эффективные антибактериальные средства (обзор литературы) 17
1.1 Роль бактериофагов в эволюции бактерий 17
1.2 Использование бактериофагов в качестве антибактериального средства 27
1.3 Достоинства бактериофагов как терапевтических препаратов 36
1.4 Недостатки фаготерапии 37
1.5 Бактериофаги как профилактические препараты 39
1.6 Определение фагорезистентности как условие эффективности фаготерапии 40
1.7 Применение бактериофагов для биологической дезинфекции 40
1.8 Бактериофаги для борьбы с бопленками 42
1.9 Примененин отдельных компонентов и ферментов бактериофагов 43
1.10 Антимикробные пептиды 46
Глава 2 Материалы и методы 49
Глава 3 Эпидемиологическая оценка экологии бактериофагов в условиях стационаров 69
3.1 Циркуляция в стационарах бактериофагов Pseudomonas aeruginosa 71
3.2 Циркуляция в стационарах бактериофагов Staphylococcus aureus 84
3.3 Циркуляция в стационарах бактериофагов E.coli 87
3.4 Циркуляция в стационарах бактериофагов Enterococcus spp 89
3.5 Циркуляция в стационарах бактериофагов Klebsiella spp . 90
3.6 Циркуляция в стационарах бактериофагов Proteus spp. 91
3.7 Совместная циркуляция бактерий и бактериофагов в одной экологической нише. 93
3.8 Формирование и функционирование паразитарных экосистем с участием бактериофагов 98
Глава 4 Формирование и функционирование паразитарных экосистем с участием бактериофагов в стационарных условиях 114
4.1 Изучение роли бактериофагов в усилении патогенного потенциала бактерий – возбудителей внутрибольничных инфекций 115
4.2 Изучение роли бактериофагов в росте антибиотикорезистентности госпитальных штаммов 126
4.3 Изучение роли бактериофагов в повышении способности возбудителей внутрибольничных инфекций к эпидемическому распространению 137
4.4 Изучение роли бактериофагов в саморегуляции эпидемического процесса внутрибольничных инфекций 142
Глава 5 Эпидемиологическая оценка бактериофагов как средств борьбы с внутрибольничными инфекциями 148
5.1 Принципы рациональной фаготерапии и фагопрофилактики 148
5.2 Изучение противоэпидемического потенциала вирулентных бактериофагов 155
5.3 Изучение эффективности бактериофагов для предотвращения формирования биопленок и их деструкции 174
Заключение
- Использование бактериофагов в качестве антибактериального средства
- Примененин отдельных компонентов и ферментов бактериофагов
- Циркуляция в стационарах бактериофагов Klebsiella spp
- Изучение роли бактериофагов в повышении способности возбудителей внутрибольничных инфекций к эпидемическому распространению
Введение к работе
Актуальность темы исследования
Инфекции, связанные с оказанием медицинской помощи (ИСМП) являются одной из самых актуальных проблем современного здравоохранения в силу широкого распространения, негативных последствий для здоровья пациентов, персонала медицинских учреждений и экономики государства. Пациенты с ИСМП находятся в стационаре в 2–3 раза дольше, чем аналогичные пациенты без признаков инфекции. Это является причиной роста стоимости лечения в 3– 4, а риска летального исхода – в 5–7 раз (Покровский В.И. и соавт., 2012).
Изучение проблемы ИСМП, в особенности внутрибольничных инфекций (ВБИ), неразрывно связано с необходимостью изучения биологических свойств их возбудителей, в частности вопросов эволюции госпитальных штаммов.
Бактериофаги (фаги) играют чрезвычайно важную роль в эволюции бактерий и в реализации их патогенного потенциала. Бактериофаги могут осуществлять горизонтальный генетический обмен между штаммами микробов путем лизогенной конверсии или трансдукции. В ходе лизогенной конверсии может происходить изменение биологических свойств бактериальной клетки вследствие заражения ее умеренным бактериофагом. Некоторые фаги передают бактериям гены, повышающие вирулентность микроорганизмов, способность их к адаптации к условиям окружающей среды, играя, тем самым, важную роль в их эволюции (Brssow H. et аl., 2004).
Феномен фаговой трансдукции может сопровождаться, в частности, приобретением бактериями генов устойчивости к антибактериальным препаратам (Schicklmaier P. et аl., 1995; Brssow H. et аl., 2004; Mazaheri Nezhad Fard R. et аl., 2011; Varga M. et аl., 2012).
Подобные изменения биологических свойств бактерий под воздействием бактериофагов могут сопровождаться ростом патогенного потенциала микробов и их способности к эпидемическому распространению, а также снижением эффективности антибиотикотерапии вызванных ими инфекционных заболеваний.
Эти обстоятельства диктуют необходимость глубокого изучения вопросов эволюции возбудителей ИСМП под влиянием бактериофагов.
Вместе с тем, бактериофаги могут быть использованы как эффективные средства лечения и профилактики ИСМП. Это особенно актуально в виду угрожающих масштабов распространения антибиотикорезистентности у возбудителей ИСМП. При сохранении нынешней тенденции ситуация в борьбе с инфекционными заболеваниями в скором времени может стать такой же, какой
была до открытия антибиотиков. В этой связи ВОЗ и органы здравоохранения во всем мире привлекают внимание к необходимости скорейшего решения проблемы лекарственной устойчивости, призывая, в том числе, всемерно поддерживать усилия по разработке новых решений для борьбы с инфекционными заболеваниями в условиях спада темпа разработок новых антибиотиков многими фармацевтическими компаниями.
В сложившихся условиях одним из эффективных компонентов борьбы с бактериальными инфекциями, в тот числе вызванными антибиотикорезистент-ными штаммами, может явиться использование бактериофагов.
Степень разработанности темы исследования
В настоящее время известно, что бактериофаги вносят существенный вклад в эволюционные процессы бактерий. В частности, в ходе лизогенизации бактерии умеренные фаги встраиваются как профаг в бактериальный геном. Считается, что профаги составляют значительную часть генома, приобретенной многими бактериями в ходе горизонтального генетического обмена (Brssow H. et аl., 2004). Известна роль бактериофагов в формировании патогенных свойств у многих патогенных и условно-патогенных бактерий. К настоящему времени изучено множество бактериофагов, играющих значительную роль в кодировании факторов вирулентности у бактерий (Elsabbagh H. et аl., 1993; Dobrindt U. et аl., 2003; Tth I. et аl., 2003; Brssow H. et аl., 2004; Hagan E.C. et аl., 2010; Yasmin A. et аl., 2010; Toba F.A. et аl., 2011).
Фаговая трансдукция описана у многих бактерий (Brssow H. et аl., 2004; Schicklmaier P. et аl., 1995). Известно множество примеров передачи бактериофагами генов устойчивости к антибиотикам. Например, бактериофаги мети-циллинорезистентных штаммов Staphylococcus aureus могут передавать гены устойчивости к пенициллину и тетрациклину (Varga M. et аl., 2012), а фаги энтерококков способны переносить гены устойчивости к тетерациклину и гента-мицину (Mazaheri Nezhad Fard R. et аl., 2011).
Несмотря на широкое разнообразие исследований по участию фагов в кодировании факторов вирулентности у бактерий, отсутствуют исследования по изучению фагоопосредованной эволюции госпитальных штаммов – возбудителей ВБИ. Наибольшее распространение вирулентные и антибиотикорезистент-ные варианты возбудителей могут получать в относительно замкнутых искусственных экосистемах, в частности в госпитальной среде. Стационары представляют собой своеобразные резервуары, в которых, благодаря широким возможностям циркуляции различных штаммов бактерий и возможностям для горизонтального генетического обмена, формируются новые варианты возбудителей, в том числе госпитальные штаммы, обладающие повышенным патоген-
ным потенциалом развития инфекционного процесса, способностью к адаптации к условиям окружающей среды медицинских учреждений и, соответственно, способностью к эпидемическому распространению. В этой связи изучение вопросов эволюции госпитальных штаммов возбудителей ВБИ под влиянием бактериофагов приобретает высокую актуальность.
Бактериофаги, как средства для лечения и профилактики инфекционных заболеваний, привлекают к себе внимание с момента их открытия. К настоящему времени в отечественной и зарубежной медицинской и научной практике накоплен обширный опыт применения бактериофагов в качестве антибактериальных препаратов (Кисина В.И. и соавт., 1996; Перепанова Т.С., 1996; Лазарева Е.Б. и соавт., 2001; Акимкин В.Г., Покровский В.И., 2002; Хайруллин И.Н. и соавт., 2002; Асланов Б. И. и соавт., 2003; Лазарева Е.Б., 2003; Дарбеева О.С. и соавт., 2004; Парфенюк Р.Л., 2004; Бондаренко А.В. и соавт., 2005; Мирошни-ков К.А. и соавт., 2006; Захарова Ю.А. и соавт., 2007; Акимкин В.Г. и соавт., 2010; Дроздова О.М., Брусина Е.Б., 2010; Дрюккер В.В., Горшкова А.С., 2012; Зуева Л.П. и соавт., 2012; Зурабов А.Ю. и соавт., 2012; Loeffler J.M. et al., 2001; Grski A. et al., 2003; Rhoads D.D. et al., 2009; Wright A. et al., 2009; Kutateladze M., Adamia R., 2010; Sarker S.A, 2012; Barbier F. et al., 2013; Hoe S. et al., 2013; McCallin S., et al., 2013; Sulakvelidze A., 2013).
Несмотря на данное обстоятельство, крайне мало исследований по оценке эпидемиологической эффективности применения бактериофагов против ИСМП. Из существующих работ можно отметить исследования по нозокоми-альному сальмонеллезу у взрослых (Акимкин В.Г., Покровский В.И., 2002), элиминации P.aeruginosa из внешней среды стационара (Дроздова О.М., Бруси-на Е.Б., 2010), элиминации K.pneumoniae из отделения реанимации новорожденных (Власова А.В., 2013).
Кроме того, не существует четко сформулированных принципов рациональной фаготерапии и фагопрофилактики с использованием исключительно вирулентных бактериофагов. Разработка концепции рациональной фаготерапии особенно важна в свете представленных выше эволюционных механизмов формирования патогенного потенциала бактерий под влиянием умеренных фагов.
Большую актуальность в настоящее время приобретает проблема формирования биопленок возбудителями ВБИ. Особого внимания заслуживает вопрос о возможности применения бактериофагов для борьбы с ними. К настоящему времени имеется ряд работ по оценке эффективности фагов против формирования биопленок (Lu T. K., Collins J. J., 2007; Weiling Fu et al., 2010; Chibeu A. et al., 2012; Liao K.S. et al., 2012; Seth A.K. et al., 2013). Наибольшую важность
представляет возможность использования фагов для борьбы с биопленками на устройствах для инвазивных медицинских манипуляций, в частности, сосудистых и мочевых катетерах. Несмотря на проводимые исследования, направленные на решение проблемы биопленок бактерий – возбудителей ВБИ, этот вопрос остается крайне актуальным.
Цель: оценка роли бактериофагов в эволюции возбудителей внутриболь-ничных инфекций и противоэпидемического потенциала бактериофагов.
Задачи:
-
Выявить экологические закономерности циркуляции бактериофагов возбудителей ВБИ в стационарах различного профиля и влияние этого явления на формирование саморегулирующихся паразитарных экосистем «пациенты-бактерии-фаги».
-
Оценить распространенность фагоопосредованных генов вирулентности в популяциях возбудителей ВБИ, циркулирующих в стационарах различного профиля.
-
Провести оценку распространенности генов вирулентности в популяциях бактериофагов, циркулирующих в стационарах различного профиля.
-
Оценить влияние генов вирулентности, кодируемых бактериофагами в составе паразитарных экосистем, на изменение патогенного и эпидемического потенциала возбудителей ВБИ.
-
Разработать и обосновать принципы рационального применения бактериофагов для борьбы с ВБИ.
-
Оценить эпидемиологическую эффективность рационального использования бактериофагов в стационарах различного профиля.
-
Оценить эффективность литических бактериофагов для профилактики и деструкции формирования биопленок P.aeruginosa.
Научная новизна
Впервые выявлены экологические аспекты циркуляции различных видов бактериофагов в госпитальных условиях и сформулирована теория формирования саморегулирующихся устойчивых паразитарных экосистем «пациенты-бактерии-фаги». Впервые сформулированы положения теории формирования, функционирования и саморегуляции таких экосистем.
Впервые проведена оценка влияния бактериофагов, входящих в указанные экосистемы, на формирование патогенного и эпидемического потенциала госпитальных штаммов – возбудителей ВБИ.
Впервые разработаны и обоснованы рациональные принципы эффективного использования бактериофагов для противоэпидемических целей в рамках борьбы с внутрибольничными инфекциями.
Теоретическая и практическая значимость
В результате использования совокупности методов получены новые теоретические знания об экологических закономерностях циркуляции бактериофагов в стационарах, сосуществование которых с госпитальными штаммами может приводить к формированию устойчивых паразитарных экосистем. Выявлено, что указанное явление играет значительную роль в эволюции госпитальных штаммов.
Учитывая высокую актуальность ВБИ и глобальное распространение резистентности к антибиотикам, возникает необходимость в использовании дополнительных средств борьбы с бактериальными инфекциями в госпитальных условиях. Такими дополнительными, а в ряде случаев альтернативными или единственными средствами являются бактериофаги, применение которых может быть высокоэффективным способом борьбы с ВБИ. Использование на практике разработанных подходов позволяет добиться значительного эпидемиологического эффекта в отношении ВБИ в стационарах различного профиля.
Методология и методы исследования
Структура и организация работы были определены ее целью, которая, с одной стороны, заключалась в оценке роли бактериофагов в эволюции госпитальных штаммов, а с другой – в оценке эпидемиологической эффективности рациональной фаготерапии. Данная работа представляет собой совокупность эпидемиологических, микробиологических, молекулярно-генетических и статистических методов. Основными методологическими характеристиками работы являются целостность, комплексность, системность, объективность и валид-ность.
Исследование проводилось в ряде лечебно-профилактических организаций различного профиля: травматологических, урологических, хирургических, гинекологических, онкологических, ожоговых стационарах, отделениях реанимации новорожденных. Помимо пациентов в указанных стационарах, проводилось исследование биологического материала, полученного от людей из вне-больничной популяции.
География исследований достаточно широка: проводилась изучение биологических свойств возбудителей ВБИ, выделенных из образцов биологического материала, полученных из ряда регионов России.
В работе обобщен обширный объем данных, полученных за многолетний период с 1997 г. по 2016 г.
Положения, выносимые на защиту:
1. В стационарах, наряду с циркуляцией штаммов-возбудителей ВБИ,
происходит интенсивная циркуляция их бактериофагов, что приводит к форми-
рованию паразитарных экосистем «пациент-возбудитель инфекции-
бактериофаг».
-
Бактериофаги в составе паразитарных экосистем играют значительную роль в эволюции госпитальных штаммов, приводящей к усилению их патогенного и эпидемического потенциала.
-
Рациональная модель использования бактериофагов с лечебной и противоэпидемической целями – применение исключительно литических фагов, не содержащих генов вирулентности.
-
Рациональная фаготерапия является высокоэффективным способом борьбы с ВБИ в условиях неуклонно растущей резистентности к антибиотикам. Рациональное использование бактериофагов позволяет добиться значительного противоэпидемического эффекта.
Степень достоверности результатов исследования
В ходе выполнения работы был использован комплекс современных и оригинальных методов и способов сбора, описания и анализа данных.
Достоверность и обоснованность научных положений, выводов и рекомендаций обеспечены системным подходом, обширностью и разнообразием материала, накопленным за длительный период, и применением современных эпидемиологических, микробиологических, молекулярно-генетических и статистических методов. На обширном фактическом материале с эпидемиологических позиций изучены фагоопосредованные механизмы формирования патогенного и эпидемического потенциала госпитальных штаммов; выдвинуты положения теории формирования тройственных паразитарных систем в стационарах, дополняющие теорию саморегуляции эпидемического процесса бактериальных инфекций; разработана концепция рациональной фаготерапии и оценена эпидемиологическая эффективность применения бактериофагов для борьбы с ВБИ.
Апробация результатов исследования
Основные положения диссертационной работы были представлены на
научных мероприятиях Всероссийского и международного уровней:
VIII съезде Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2002 г.); 3-й Российской научно-практической конференции с международным участием «Современные проблемы эпидемиологии, диагностики и профилактики внутрибольничных инфекций» (Санкт-Петербург, 2003); Научно-практической конференции с международным участием «Современные средства иммунодиагностики, иммуно- и экстренной профилактики актуальных инфекций», Санкт-Петербург, 2004; Российской научно-практической конференции «Узловые вопросы борьбы с инфекцией» (Санкт-Петербург, 2004); Все-
российской научной конференции «Эпидемиология, лабораторная диагностика и профилактика вирусных инфекций» (Санкт-Петербург, 2005); 7-м СевероБалтийском Международном конгрессе по инфекционным заболеваниям (7th Nordic-Baltic Congress on Infectious Diseases) «Current Challenges and New Opportunities», Латвия (Рига, 2006); IX съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2007); Российской научно-практической конференции «Инфекции, вызываемые условно-патогенными микроорганизмами» (Москва, 2007); Всероссийской научной конференции «Проблемы современной эпидемиологии. Перспективные средства и методы лабораторной диагностики и профилактики актуальных инфекций» (Санкт-Петербург, 2009); Научно-практической конференции «Актуальные проблемы медицины и биологии» (Санкт-Петербург, 2010); II Международном конгрессе «Стратегия и тактика борьбы с внутри-больничными инфекциями на современном этапе развития медицины» (Москва, 2011); Всероссийском ежегодном конгрессе «Инфекционные болезни у детей: диагностика, лечение и профилактика» (Санкт-Петербург, 2011); I конференции «Профилактическая медицина-2011» (Санкт-Петербург, 2011); II конференции «Профилактическая медицина-2012» (Санкт-Петербург, 2012); Всероссийской научной конференции «Отечественная эпидемиология в XXI веке: приоритетные направления развития и новые технологии в диагностике и профилактике болезней человека» (Санкт-Петербург, 2012); X съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2012); 15-м Международном конгрессе по инфекционным заболеваниям (15th International Congress on Infectious diseases) (Таиланд, Бангкок, 2012); Всероссийской научно-практической конференции по медицинской микробиологии и клинической микологии (XV Кашкинские чтения) (Санкт-Петербург, 2012); Всероссийской научно-практической конференции по медицинской микробиологии и клинической микологии (XVI Кашкинские чтения) (Санкт-Петербург, 2013); VI международном Конгрессе «Рациональная фармакотерапия 2013» (Санкт-Петербург, 2013); Научно-практической конференции «От эпидемиологии к диагностике актуальных инфекций: подходы, традиции, инновации» (Санкт-Петербург, 2014); научно-практической конференции «Современные возможности бактериофаготерапии» (Пермь, 2014); Всероссийской научно-практической конференции специалистов по контролю инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи (Москва, 2014); Второй научно-практической конференции с международным участием «Бактериофаги: теоретические и практические аспекты применения в медицине, ветеринарии и пищевой промышленности» в рамках Третьего Санкт-Петербургского междуна-
родного экологического форума «Окружающая среда человека: фундаментальные, клинические и экологические аспекты современной микробиологии» (Санкт-Петербург, 2014); Республиканской конференции «Вопросы эпидемиологии и профилактики инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи» (Сыктывкар, 2014); Медицинском форуме «Беломорские зори» (Архангельск, 2014); Научно-практической конференции «Актуальные вопросы инфекционной патологии» (Екатеринбург, 2014); Областной научно-практической конференции «Бактериофаги в борьбе с инфекциями в медицинских организациях» (Нижний Новгород, 2014); Региональной конференции «Профилактика инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи» (Калининград, 2014); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием специалистов по контролю инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи (Москва, 2015); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием специалистов по контролю инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи (Казань, 2016).
Результаты диссертационной работы внедрены и реализованы:
– в практической деятельности: часть собранной в ходе исследования коллекции фагов и бактерий использованы в разработке нового уникального препарата «Дифаг», обладающего широким антибактериальным спектром в отношении инфекций, вызванных Acinetobacter baumannii и Pseudomonas aeruginosa (Акт внедрения ФГУП НПО «Микроген» Минздрава России от 28.10.2015 г.);
– в системе додипломной и последипломной подготовки на кафедре эпидемиологии, паразитологии и дезинфектологии ФГБОУ ВО «Северо-Западный государственный медицинский университет имени И.И. Мечникова» Министерства здравоохранения Российской Федерации (191015, Санкт-Петербург, ул. Кирочная, д. 41, тел: (812) 303-50-00) (Акт внедрения от 22.11.2016 г.);
– при разработке методических документов: методических рекомендаций «Принципы использования бактериофагов для борьбы с инфекциями, связанными с оказанием медицинской помощи» (утверждены Первым заместителем Председателя Комитета по здравоохранению Правительства Санкт-Петербурга, 2013 г.); федеральных клинических рекомендаций «Рациональное применение бактериофагов в лечебной и противоэпидемической практике» (согласованы Профильной комиссией Минздрава России по эпидемиологии (протокол №3 от 21.04.2014); утверждены на общем собрании членов некоммерческого партнерства «Национальная ассоциация специалистов по контролю инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи» (НП «НАСКИ») (протокол №5 от 21.04.2014 г.); федеральных клинических рекомендаций «Принципы организа-
ции периоперационной антибиотикопрофилактики в учреждениях здравоохранения» (согласованы Профильной комиссией Минздрава России по эпидемиологии (протокол №4 от 20.11.2014 г.); утверждены на общем собрании членов НП «НАСКИ» (протокол №6 от 19.11.2014 г.); федеральных клинических рекомендаций «Эпидемиологическое наблюдение за инфекциями, связанными с оказанием медицинской помощи» (согласованы Профильной комиссией Минздрава России по эпидемиологии (протокол №4 от 20.11.2014 г.); утверждены на общем собрании членов НП «НАСКИ» (протокол №6 от 19.11.2014 г.);
– при подготовке учебников: «Эпидемиология» (СПб., 2005); «Эпидемиология» (М., 2013); методических разработок к практическим занятиям и лекциям по госпитальной эпидемиологии;
– при выполнении государственных заданий: «Изучение эпидемиологии, микробиологический мониторинг внутрибольничный грибковой инфекций, актуальных госпитальных штампов возбудителей внутрибольничных инфекций»; «Эндолизины бактериофагов Enterococcus faecium: эволюция и биотехнологический потенциал».
Апробация диссертационной работы проведена на совещании кафедры эпидемиологии, паразитологии и дезинфектологии ФГБОУ ВО «СевероЗападный государственный медицинский университет имени И.И. Мечникова» Минздрава России (протокол совещания № 8 от 30 июня 2016 г.).
Организация и проведение диссертационного исследования одобрены Комитетом по вопросам этики при ФГБОУ ВО «Северо-Западный государственный медицинский университет имени И.И. Мечникова» Минздрава России (протокол №5 от 11.05.2016 г.).
По материалам диссертации опубликованы 42 научные работы, в том числе 24 статьи в журналах, входящих в перечень научных рецензируемых изданий, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки Российской Федерации, оформлен 1 патент на изобретение.
Личное участие автора в получении результатов
Автором лично были определены цель и задачи, разработана методология и этапы комплексного научного исследования, выполнены сбор данных, систематизация, логическое построение работы и анализ полученных результатов, сформулированы научные положения, выводы и практические рекомендации.
Автор принимал непосредственное участие в сборе штаммов микроорганизмов и бактериофагов; организовывал выполнение всех запланированных исследований; проводил самостоятельно и совместно эпидемиологические, бактериологические и молекулярно-генетические исследования; самостоятельно разработал положения теории формирования и саморегуляции тройственных пара-
зитарных экосистем; разработал принципы рационального применения бактериофагов с лечебной и противоэпидемической целями.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 226 страницах текста и состоит из введения, обзора литературы, главы материалов и методов, 3 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, включающего 92 источника отечественных и 169 иностранных авторов. Работа иллюстрирована 31 рисунком и 56 таблицами.
Использование бактериофагов в качестве антибактериального средства
Всестороннее изучение бактериофагов предоставило возможность решения широкого спектра задач в вирусологии, микробиологии, молекулярной биологии и других областях фундаментальных и прикладных исследований. Исследования с использованием фагов позволили более широко рассмотреть взаимоотношения вируса с клеткой-хозяином.
Вирусы бактерий были открыты независимо в 1915 году Frederick Twort и в 1917 Flix d Herelle, последний и ввёл в научный обиход термин – бактериофаги. В настоящее время термин «бактериофаги» используют не только для обозначения вирусов, поражающих эукариоты, но и археи. Хотя из-за существенных различий в последнем случае правильнее говорить о «вирусах архей» или «архей-фагах» (“Archaeal phages,” “Archaeal viruses,”) [152].
Frederick Twort и его брат, доктор C.C. Twort пытались найти способ культивирования вирусов на искусственных питательных средах. Они работали с вирусом вакцины против оспы, которая часто была инфицирована стафилококками. Случайно был выявлен фактор, обладающий способностью лизиро-вать стафилококки, который можно было передать от одной культуры к другой. В дальнейшем удалось показать, что выделенный агент проходит через непроницаемые для бактерий фильтры и требует для своего размножения живые бактериальные клетки. Результаты были опубликованы в 1915 году в журнале Lancet как информация о заразном бактериолитическим агенте «contagion the bacteriolytic agent».
d Herelle первым установил, что неизвестный литический агент является вирусом, предложил для его обозначения термин “bacteriophage” – бактериофаг и указал на возможность его применения для лечения инфекционных заболеваний.
Отдельно следует отметить российского ученого Н.Ф. Гамалею, который первым наблюдал и описал явление растворения (лизиса) бактерий, которое в настоящее время известно под названием лизогения, обусловленная активацией умеренного бактериофага. В 1898 году он описал внезапное разрушение Bacillus antracis в дистиллированной воде, после чего жидкость приобретала способность лизировать свежие культуры сибиреязвенной бациллы и предположил, что бактерии образуют бактериолизин, который специфически действует на микроорганизмы того же вида.
На ранних этапах развития молекулярной биологии фаги интенсивно изучались в качестве простых модельных систем. В последующие годы достижения в области исследования фагов позволили расширить представления о них, как о факторах формирования вирулентных свойств у многих патогенных и условно-патогенных бактерий. Считается, что бактериофаги являются самыми распространенными существами на планете. По приблизительным подсчетам, их количество составляет от 1030 до 1032 [35]. Было подсчитано, что такое большое количество циркулирующих в природе бактериофагов, сосуществующих с бактериями в одних и тех же экологических нишах, обеспечивает ежесекундно около 1025 фаговых инфекций бактериальных клеток на всей планете [202]. Этот процесс взаимодействия продолжается уже минимум три миллиарда лет.
В этой связи становится понятным, что в условиях такого тесного сосуществования, фаги вносят существенный вклад в эволюционные процессы, происходящие в популяциях различных видов бактерий.
Бактериофаги обладают способностью изменять геном бактерий в результате реализации двух типов взаимодействия с бактериальной клеткой: трансдукции и лизогенной (фаговой) конверсии. Феномен фаговой трансдукции был описан среди большинства бактерий [122, 162, 223].
Лизогенная конверсия имеет важное значение в формировании патогенных свойств многих микробов. В процессе лизогенизации, умеренные фаги встраиваются как профаг в бактериальный геном. В результате лизогенной конверсии у большинства бактерий существенная часть генома представлена профагом.
Ряд исследований показывает, что во многих случаях лизогенная конверсия является следствием наличия специфических элементов – так называемых моро-нов, находящихся в геноме профага [121, 123, 148]. Ряд моронов детерминируют факторы вирулентности бактерий, придавая им, например, свойство токсинообра-зования. В частности, было показано, что фаги CTXphi, несущие в своем геноме мороны, кодирующие ген ctx, ответственны за продукцию токсина возбудителями холеры. Процесс формирования токсигенных вариантов холерного вибриона из нетоксигенных штаммов с участием бактериофага CTX продолжается и в настоящее время [150, 143].
Кроме того, мороны кодируют ген токсина Шига у энтерогеморрагических штаммов E.coli и штаммов S. flexneri [121, 215]. Распространение моронов чаще всего происходит в пределах одного вида бактерий [121, 148]. Предполагается, что они являются уникальными самостоятельными генетическими элементами, использующими бактериофаги для своего распространения [121, 215]. Эта гипотеза находит свое подтверждение при рассмотрении других мобильных генетических элементов, внедряющихся в бактериофаги, - интронов второго типа. Однако последние связаны с H-N-H эндонукле-азами, придающими им подвижность. В отличие от интронов второго типа, моро-ны нуждаются в генах подвижности и не способны к самостоятельному распространению без участия, в частности, бактериофагов [215]. Для полного понимания природы моронов требуются дополнительные исследования.
Реализация феномена лизогенизации дает значительное элективное преимущество для бактериальной клетки. Еще в 1951 году было продемонстрировано, что приобретение токсигенности Corynebacterium diphteriae обусловлено ли-зогенизацией, а утрата профага ведет к обратному процессу превращения токси-генного штамма в нетоксигенный [159].
Современные достижения в сфере генетики микроорганизмов продемонстрировали исключительную роль фагов в эволюционной перестройке бактерий [37, 95, 121, 215, 241]. В результате изменения физиологии бактериальной клетки под влиянием лизогенной конверсии может измениться ее антигенная структура, появиться способность к токсинообразованию, измениться тип питания, чувствительность к лизогенизирующему и другим фагам [62].
Taylor показал в своих исследованиях, что лизогенизация обладает способностью инициировать мутации у бактерий и является важным фактором их эволюции [237].
Многие из запрограммированных бактериофагами факторов вирулентности вносят значительный вклад в устойчивость лизогенизированной бактерии в окружающей среде [121, 123].
Бактериофаги, внося изменения в архитектуру генома бактерий, способствуют генетическому разнообразию бактериальных популяций. Геном клетки-хозяина находится в постоянном процессе реорганизации. К настоящему времени расшифровано большое количество профаговых последовательностей, являющихся составной частью бактериальных геномов. Накопленная современному периоду информация об изменениях в структуре геномов бактерий представляется всего лишь малой частью реального участия фагов в обеспечении генетического разнообразия патогенных и условно-патогенных бактерий [121, 215, 148, 239].
Кроме изменений в структурах бактериальных геномов, изучение коэволюции профагов и лизогенизированных бактерий продемонстрировала ряд явлений, связанных также с изменением самих профагов. Так, например, различные штаммы одного вида микроорганизмов могут в процессе эволюции приобретать специфичные наборы связанных (родственных) профагов.
Предполагается, что высокое разнообразие профагов существует благодаря частому обмену генетическим материалом, содержащим профаги, между различными штаммами одного вида бактерий. Кроме того, разнообразие профагов поддерживается случайным захватом мобильных генетических элементов из других видов микроорганизмов [121].
Таким образом, можно констатировать наличие древнейшей связи между бактериями и бактериофагами, в ходе которой происходит постоянная коэволюция. Такое сосуществование выгодно, как для популяций бактерий, так и для популяций их бактериофагов.
К настоящему времени накопился определенный объем данных, позволяющих с уверенностью говорить о значительном влиянии бактериофагов на биологические свойства бактерий.
Примененин отдельных компонентов и ферментов бактериофагов
Затем готовили ряд последовательных 10-кратных разведений фага (по той же методике, как при титровании фага по Аппельману). Количество чашек с агаром, пробирок с 0,7% полужидким агаром должно соответствовать количеству пробирок с разведением бактериофага.
В пробирки с 0,7% агаром, расплавленным на водяной бане и остуженным до 45С, добавляли по 1 мл каждого разведения титруемого бактриофага и по 0,2мл бульонной экспоненциально растущей культуры чувствительной к фагу бактерии. Содержимое пробирок тщательно перемешивалось и разливалось вторым слоем в чашки с 1,5% агаром. После застывания питательной среды чашки инкубировали при 37С 18–24 часа.
После окончания инкубации подсчитывали количество негативных колоний фага – бляшек и с учетом разведения фага рассчитывали количество бляшкообра-зующих единиц (БОЕ) в 1 мл.
Широкая встречаемость в изученных стационарах возбудителей ВБИ с низкой чувствительностью к фагам или с полной фагорезистентностью требовало детального изучения некоторых биологических характеристик циркулирующих штаммов, в частности, лизогении. В связи с этим, был проведен ряд экспериментов для определения лизогенных штаммов среди циркулирующих в стационарах изолятов. Эксперименты заключались в индукции профага из предполагаемых ли-зогенных штаммов и, при наличии литической активности у индуцированного образца, судили о факте лизогенности. Опыт проводили на культурах всех 6 видов изучаемых бактерий (70 штаммов P.aeruginosa, 60 штаммов S.aureus, по 30 штаммов E.coli и Enterococcus spp., 20 штаммов Klebsiella spp., 9 штаммов Proteus spp.). Для проведения индукции использовались культуры штаммов в сахарном бульоне, выращенные до середины логарифмической фазы роста. Индукция штаммов проводилась сублетальными дозами ципрофлоксацина [90]. Полученная смесь размешивалась в течение 5 минут при 250 оборотах в минуту на орбитальном шейкере, затем инкубировалась при температуре 37C 2–4 часа. Раствор фильтровался бактериальными фильтрами с диаметром пор 0,2нм «Minisart» («Sartori-us AG», Германия). Фильтрат тестировался на литическую активность на индика 56 торных культурах, обладающих заведомо широким спектром чувствительности к бактериофагам. После обработки индуцируемых культур антибиотиком многие образцы обладали литической активностью. Однако, предполагая, что негативное пятно на твердой среде с газоном индикаторной культуры могло быть не результатом лизиса индуцированным фагом, а следствием действия антибиотика, мы в последующем проводили два пассажа фильтратов на чувствительных индикаторных культурах. После пассажей литическая активность сохранялась не у всех образцов, а лишь у некоторых, при этом у последних отмечалось не только сохранение активности, но даже усиление, что подтверждало факт наличия в материале индуцированного фага.
Формирование лизогенности, способствующего приобретению устойчивости к фагам, может приводить к изменению некоторых биологических свойств бактерий, в том числе и к изменению чувствительности к антибиотикам в сторону снижения. Нами был проведен эксперимент по изучению влияния лизогенизации бактерий на изменение антибиотикорезистентности. Для этого высокочувствительные к фагам нелизогенные культуры P.aeruginosa, S.aureus и E.coli были подвергнуты искусственной лизогенизации (исходная нелизогенность подтверждалась отсутствием индукции, проведенной по описанной выше методике). Опыт проводился путем нанесения на газон культуры капель умеренного фага и последующего отбора колоний вторичного роста с негативного пятна на плотной питательной среде. После пересева колоний вторичного роста имел место обильный нормальный рост, который оказывался нечувствительным к использованному для лизогенизации фагу. Для исключения сомнений, что данным путем можно получить лизогенный штамм, мы провели опыт индукции профага из культур вторичного роста путем обработки их ципрофлоксацином. Наличие литической активности у индуцированных фильтратов искусственно лизогенизированных штаммов, при ее отсутствии у исходных, подтверждало факт лизогенизации. Исходные и искусственно лизогенизированные культуры были подвергнуты одномоментному определению чувствительности к антибиотикам. С целью установления клонального родства штаммов возбудителей ВБИ было проведено генетическое типирование штаммов.
Генотипирование выделенных штаммов Pseudomonas spp., E. coli, Klebsiella spp. и Proteus spp. осуществляли методом RAPD-ПЦР (Соломенный А.П. и др., 2004) с использованием универсального праймера M13. Штаммы выращивались на плотной питательной среде АГВ (производство научно-производственного объединения «Питательные среды», филиал ФГУП «НПО Микроген»). Постановка полимеразной цепной реакции проводилась с использованием реактивов и лабораторного пластика производства НПО «СибЭнзим» (Новосибирск). Праймер М13 (5 -GAGGGTGGCGGTTCT-3 ), использовавшийся в качестве зонда для определения гипервариабельных («минисателлитных») участков ДНК, синтезировался ООО «Бигль» (Санкт-Петербург). Стерильная дистиллированная вода для исследований соответствовала требованиям фармакопейного качества.
Геномная ДНК выделялась путем температурной обработки бактериальной суспензии. Культуры отбирались в количестве 1/3 бактериологической петли диаметром 0,3 см с поверхности плотной питательной среды и помещались в пробирку с 250 мкл реагента «ДНК-экспресс» («Литех», Россия) в течение 15 минут при 97С. Содержимое пробирок взбалтывали на вортексе. После центрифугирования в течение 2 минут при 13000 об./мин надосадочная жидкость использовалась сразу в качестве образца ДНК для исследования или замораживалась при минус 20С для последующего исследования.
Циркуляция в стационарах бактериофагов Klebsiella spp
Каким образом могут формироваться и поддерживаться такие экосистемы? При изучении экологических закономерностей циркуляции в стационарах бактерий и их бактериофагов важно понимание механизмов их совместного существования. Для существования такой системы ее взаимодействующие компоненты должны обладать определенными биологическими свойствами, благодаря которым происходит ее самосохранение, поддержание и эволюция.
С одной стороны, в бактериальной популяции клетки бактерии-хозяина должны обладать свойствами, благодаря которым они могут существовать в одной экологической нише со своими естественными «врагами». Таким свойством, придающим иммунитет к инфицированию фагом, является лизогения бактерий. В результате лизогенизации и встраивания профага в геном бактериальной клетки, последняя приобретает устойчивость к повторному заражению таким же или другими родственными бактериофагами.
Явление лизогении в природных экосистемах широко распространено. Не менее половины изученных к настоящему времени геномов бактерий несут в своем составе профаговые последовательности. Частота лизогении может варьировать от вида бактерии, достигая, например, 100% у Pseudomonas spp. Одним из подтверждений распространенности лизогении в природе может служить нарастание концентрации морских бактериофагов в летнее время, и объяснением этому явлению, вероятно, является индукция профагов из лизогенных бактерий под воздействием тепла и ультрафиолетового излучения [172].
Накопленные знания подсказывают, что в определенных условиях (особенно в неблагоприятных) лизогения становится предпочтительной формой взаимодействия бактериофагов и бактерий. Лизогения является стратегией выживания как для фага, так и для бактерий [215]. Это особенно актуально в госпитальной среде, в которой микроорганизмы подвергаются жесткому прессингу в условиях постоянного воздействия факторов, связанных с оказанием медицинской помощи. Лизогенные варианты, обладая селективным преимуществом, часто вытесняют нелизогенные штаммы. Лизогенизация, придавая иммунитет к повторному инфицированию фагом, делает такие штаммы бактерий конкурентоспособными в рамках конкретных экологических ситуаций, в то время как нелизогенные штаммы могут быль элиминированы из госпитальной среды под влиянием активных против них фагов. Показано, что лизогенные штаммы могут обладать более высокой метаболической активностью и способностью к росту, по сравнению с нелизогенными [141, 142]. Лизогения является высокоразвитым состоянием бактерий, которое подразумевает коэволюцию их совместно с бактериофагами, выгодную для обеих взаимодействующих популяций [178].
Кроме того, высокую степень конкурентоспособности придают гены вирулентности, кодируемые фагами в лизогенных штаммах, которые, благодаря этому, лучше адаптируются к организму человека и получают широкое эпидемическое распространение в госпитальной среде (подробнее об этом говорится в следующей главе).
Продукция шига-токсина у определенных штаммов E.coli (STEC-штаммы) представляют собой пример эффективного случая лизогении. Эти штаммы обычно бессимптомно встречаются в кишечнике крупного рогатого скота, в то время как у человека E.coli O157:H7 (STEC O157) является возбудителем тяжелых кишечных инфекций. Имеющиеся данные свидетельствуют о том, что эти штаммы эволюционировали за последние 50 с небольшим лет от энтеропатогенной E.coli O55:H7 путем приобретения двух профагов, кодирующих шига-токсины Stx1 и Stx2, основные факторы патогенности STEC-штаммов [227]. В настоящее время, в результате проведенных опытов по секвенированию, стало известно, что изоляты О157:Н7 содержат большое количество профагов. Изучение различных штаммов E.coli O157 выявило высокую степень их геномного разнообразия, в основном из-за обширного структурного и позиционного разнообразия профагов [156].
В ходе наших исследований удалось определить, что лизогения широко распространена среди изученных нами штаммов возбудителей ВБИ в различных стационарах.
В этой части работы по оценке степени распространенности лизогении были изучены штаммы P.aeruginosa, S.aureus, E.coli, Enterococcus spp., Klebsiella spp. и Proteus spp., наиболее часто встречавшихся в изученных стационарах. Эксперимент заключался в попытке индукции профагов из предположительно лизогенных штаммов. Индукция проводилась путем обработки ципро-флоксацином штаммов, выращенных в жидкой среде до середины логарифмической фазы роста. Индуцированный фильтрат проверялся на наличие литической активности в отношении индикаторных культур, состоящих из набора штаммов с широким спектром чувствительности к бактериофагам, а также из самих индуцированных штаммов. Сохранение литической активности у индуцированого субстрата после двух пассажей на индикаторных культурах (для исключения ложно-положительного результата) должно было свидетельствовать об удачном опыте индукции и, соответственно, лизогенности конкретного штамма.
Проводя опыты по индукции, мы исходили из предположения, что не все выделенные штаммы, возможно, являются лизогенными, поскольку часть из них проявляла чувствительность практически ко всем исследованным бактериофагам (фаговары I различных видов бактерий в таблицах 3.2, 3.4, 3.6, 3.8, 3.10, 3.12), а все остальные штаммы, и в особенности полностью резистентные к бактериофагам, могут быть лизогенными. Если это утверждение правильно, то попытка индукции профага удалась бы с разной степенью эффективности со всеми изученными культурами, за исключением высокочувствительных к фагам штаммов.
Изучение роли бактериофагов в повышении способности возбудителей внутрибольничных инфекций к эпидемическому распространению
Представленные данные показывают, что в популяциях бактерий определенная часть получает большее распространение в стационарах, по сравнению с другой. Результаты этой части работы свидетельствуют о том, что приобретение штаммами вирулентности за счет фагоопосредованных генов дает им конкурентное преимущество перед другими штаммами в способности вызывать патологический процесс у пациентов в больничных условиях. Это выражается в более частом развитии ВБИ и, соответственно, в более интенсивном эпидемическом распространении этих штаммов в госпитальной среде.
По всей вероятности, способность к более интенсивному эпидемическому распространению этих штаммов являются результатом не столько наличия конкретно тех генов, которые были изучены в данном исследовании, сколько сам факт лизогении у таких бактерий, способствующей их адаптации к условиям госпиталь 142 ной среды и, соответственно, большему эпидемическому «успеху». Такие штаммы могут заноситься из одних лечебных учреждений в другие, образуя клональные линии микробов, склонных к широкому эпидемическому распространению.
На протяжении длительного времени, прошедшего с момента формулировки В.Д. Беляковым (1987) теории саморегуляции паразитарных систем, по-прежнему остается актуальным вопрос о молекулярно-генетических механизмах, которые лежат в основе самоперестройки популяции возбудителя. Накопленные к настоящему моменту знания расширили наши представления о регуляции вирулентных свойств у целого ряда бактерий, что, в частности, позволило объяснить включение генов факторов вирулентности в зависимости от внешних условий, в которых оказывается возбудитель инфекции. В свое время было также высказано предположение о том, что значительная роль в регуляторных процессах принадлежит элементам, способным транслоцироваться и встраиваться в негомологичные участки хромосомы различных микроорганизмов - IS-элементам, транспозо-нам, умеренным фагам [71].
Результаты наших исследований, продемонстрированные выше, свидетельствуют о значительном влиянии бактериофагов на изменение вирулентных свойств бактерий-хозяев, сосуществующих в одной экологической нише в госпитальных условиях. В этой связи становится понятным, что качественные и количественные изменения в популяции бактериофагов влекут за собой сопутствующие изменения и самоперестройку биологических свойств бактерий, что в свою очередь отражается на характеристиках эпидемического процесса инфекций, вызванных данными микроорганизмами.
Нами было изучено влияние интенсивности циркуляции бактерий, несущих в своем геноме фаговые гены на интенсивность эпидемического процесса ВБИ. В урологических стационарах проводили сравнительный анализ частоты внутри 143 больничных ИМП и интенсивности циркуляции штаммов кишечной палочки с фагоопосредованными генами вирулентно. Была выявлена выраженная зависимость между частотой ИМП, обусловленных кишечной палочкой, и частотой выделения (интенсивностью циркуляции) штаммов E. coli с наличием гена c2418 (рисунок 4.12).
Значение непараметрического коэффициента корреляции Спирмена (r = 0,72, p 0,01) позволяет судить о сильной степени корреляции, характеризующей положительную взаимосвязь между изучаемыми явлениями – нцидентностью ВБИ, вызванынных E. coli, и интенсивностью циркуляции E. coli с наличием гена c2418. Представленные данные являются иллюстрацией того, что штаммы E.coli, приобретая определенные свойства в составе экосистем «бактерии-фаги», влияют на активизацию эпидемического процесса ВБИ, обусловленного данным микроорганизмом.
Вместе с тем, такой же анализ установил слабую положительную свяь между частотой ИМП и частотой встречаемости Enterococcus spp. с фаговыми генами gp2 и yopX (r=0,26 и r=0,15, соответственно). Нами была проведена оценка сопутствующих изменений в динамике интенсивности эпидемического процесса ВБИ, вызванных S.aureus и P.aeruginosa, при изменениях в динамике интенсивности циркуляции их бактериофагов.
Оценка корреляционных взаимосвязей между динамикой эпидемического процесса ВБИ, вызванных S.aureus, и динамикой выделения его бактериофагов в травматологическом стационаре (рисунок 4.13) показала, что с ростом активности циркуляции бактериофагов в госпитальной среде, большинство из которых, как было показано выше, умеренные, происходит активизация эпидемического процесса (r=0,86).
Идентичные результаты были получены также при изучении взаимосвязи между активностью циркуляции синегнойных бактериофагов и интенсивностью эпидемического процесса ВБИ, обусловленных P.aeruginosa (рисунок 4.14). ЗО 25 15 О
Коэффициент корреляции r=0,75 убедительно свидетельствует о выраженной связи между активностью циркуляции в стационаре синегнойных фагов и динамикой эпидемического процесса ВБИ, обусловленных P.aeruginosa.
Анализируя полученные данные о значении фагов в составе описываемых паразитарных экосистем, становится очевидным, что наряду с влиянием на способность у бактерий к эпидемическому распространению, они играют значимую роль в саморегуляции эпидемического процесса ВБИ.
Взаимодействие бактериофагов и их хозяев на популяционном уровне представляется значимым фактором, определяющим внутреннюю саморегулирующуюся активность паразитарных экосистем. Бактериофаги в составе паразитарных экосистем, оказывая существенное влияние на генетическое разнообразие бактерий, способствуют изменению их вирулентных свойств, которое выражается в изменении интенсивности эпидемического процесса. При этом, чем выше селективный прессинг популяции фагов на бактерии, тем выше вероятность наступления эволюционных событий в популяции бактерий, приводящих к усилению вирулентных свойств последних. По сути, фаги в госпитальных условиях являются одним из существенных компонентов биологического фактора эпидемического процесса. Играя важную роль в эволюции актуальных в госпитальных условиях свойств у бактерий, бактериофаги в составе паразитарных экосистем оказывают существенное влияние на саморегуляцию эпидемического процесса.
Таким образом, удалось продемонстрировать, что микробные сообщества в качестве неотъемлемого компонента паразитарных экосистем в госпитальных условиях включают преимущественно умеренные бактериофаги. Циркуляция таких бактериофагов в паразитарных экосистемах в условиях стационаров обладает значительным селективным влиянием на популяцию госпитальных штаммов – возбудителей ВБИ путем формирования у последних повышенной вирулентности, дополнительной антибиотикорезистентности и склонности к агрессивному эпидемическому распространению. Наличие выраженных колебаний в динамике популяции умеренных бактериофагов может оказывать влияние на саморегуляцию эпидемического процесса ВБИ, вызванных изученными микроорганизмами.