Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 10
1.1. Атипичные варианты микроорганизмов и механизмы их возникновения 10
1.2. Биологические особенности атипичных вариантов микроорганизмов .".22
1.3. Антибиотикочувствительность и фагочувствительность атипичных вариантов микроорганизмов 30
1.4. Современные методы молекулярно генетического анализа S.typhi 33
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 37
2.1. Бактериальные штаммы, питательные среды и реактивы 37
2.2. Изучение биохимических свойств исследуемых культур 37
2.3. Изучение антигенной структуры ис следуемых культур S.typhi 38
2.4. Определение фаговара исследуемых культур 38
2.5: Определение чувствительности штаммов S.typhi к антибиотикам 39
2.5.1 Определение минимальной ингибирующей концентрации антибиотика методом разве дения в твердой питательной среде 39
2.6. Выделение хромосомной ДНК з
2.7. Электрофорез ДНК в агарозном геле 40
2.8. Расщепление ДНК рестриктазами 40
2.9. Экспресс- ПЦР в модификации А.Н. Суворова и соавт 40
2.10. Метод риботипирования 41
2.11. Гибридизация ДНК перенесенного из агарозного геля 41
2.12. Эпидемиологические методы исследования 42
2.13.Статистическая обработка 42
Результаты собственных исследований и их обсуждение
Глава 3. Общая характеристика штаммов s.typhi и структурный анализ заболеваемости брюшным тифом 43
ГЛАВА 4. Сравнительная характеристика типичных и и различных атипичных штаммов s typhi 52
4.1. Морфологические свойства, антигенная структура, ферментативная активность исследуемых штаммов S.typhi 52
2.2. Антибиотикочувствительность и фагочувствительность исследуемых штаммов S.typhi 57
ГЛАВА 5. Молекулярно-генетический анализ хромосомной днк исследуемых штаммов 63
ГЛАВА 6. Заключение 71
Выводы 78
Список литературы
- Биологические особенности атипичных вариантов микроорганизмов
- Изучение биохимических свойств исследуемых культур
- Определение минимальной ингибирующей концентрации антибиотика методом разве дения в твердой питательной среде
- Морфологические свойства, антигенная структура, ферментативная активность исследуемых штаммов S.typhi
Биологические особенности атипичных вариантов микроорганизмов
Широкое использование антибиотиков и химиотерапевтических препаратов, без учета специфики их воздействия на возбудителя заболевания, существенным образом изменило клиническое течение некоторых болезней и в ряде случаев привело к возникновению измененных вариантов микроорганизмов, что сильно повлияло на результаты бактериологических анализов (19,36,63,78,86,117). Это привело к возникновению исследований, направленных на выявление роли измененных и необычных агентов в инфекционной патологии (60,62,68,75,140).
К необычным агентам относят микроорганизмы, частично или полностью утратившие клеточную стенку (сферопласты и протоплас-тические варианты), но сохранившие способность размножаться и передавать потомству присущие им признаки, в том числе дефектность и отсутствие клеточной стенки (нестабильные и стабильные L-формы бактерий) (25,40,46,48).
Исследованиями последнего десятилетия показано, что L-формы образуются независимо от вида бактерий (112,137,149,151,157).
По данным авторов (62,63,93,163,171,172) существует много факторов, способствующих переходу бактерий в атипичные формы. Превращение бактерий в атипичные формы зависит от видовых особенностей, состояния популяций, среды культивирования, фактора воздействия и его дозировки. Образуются эти формы в бактериальных культурах, независимо от их видовой принадлежности, при воздействиях, блокирующих синтез основных компонентов клеточной стенки (как это имеет место при образовании сферопластов), либо при ее разрушении соответствующими ферментами в условиях повышенной осмотической концентрации среды под влиянием различных воздействий физического (Х-лучи), химического (соли, аминокислоты) или биологического порядка (бактериофаги, иммунные сыворотки), при условии культивирования на полужидких и полутвердых средах, содержащих нормальную лошадиную сыворотку (123, 130,131,144,145).
На сегодня известно, что трансформация бактерий в L-форму зависит от трех условий: 1. Действия факторов, вызывающих нарушение синтеза или разрушение муреиновой структуры клеточных стенок. 2. Защиты от лизиса бактерий, лишенных ригидного слоя. 3. Создания условий для их размножения вЬ-форме (135,186,187). Известен универсальный L-трасформирующий эффект пенициллина. Он нарушает перекрестные соединения пептидных цепей муреина, так как в муреиновом слое у Гр (-) и Гр (+) бактерий есть одинаковые структуры. L-формы могут индуцироваться пенициллином у тех и других (110,186).
Способность некоторых антибиотиков индуцировать образование L-форм позволяет условно делить их на несколько групп: 1) Универсальные факторы индукции L-формы, вызывающие их образование независимо от видовой принадлежности микроорганизма (пенициллин). 2) Антибиотики, оказывающие избирательное L-трансформирующее действие независимо от видовой принадлежности микроорганизма. Так, например, бацитрацин вызывает индукцию L-формы стрептококков (104,106,124,135). Бацитрацин, винкомицин, ристомицин вызывает образование L-форм у N. meningitidis. Стрептомицин, избирательно вызывая образование L-форм у холерного вибриона, не вызывает образование L-форм у Salmonella. 3) Антибиотики, у которых не отмечен L-трансформирующий эффект: тетрациклин, канамицин и хлорамфеникол (136,145,148,155,159,209). Биологически активные вещества - лизин и лизоцим, а также и аутолитические ферменты - вызывают L-трансформацию только у некоторых видов бактерий (19,152). Сходен с действием лизоцима L-индуцирующий эффект антисыворотки и комплемента на S. typhi (137). Весьма активными факторами L-трасформации являются некоторые аминокислоты: D-метионин, фенила-ланин, аргинин, глицин и некоторые аминосодержащие соединения, например, карбоксиметоксиламин. Установлено L-индуциру-ющее действие метионина, аргинина и глицина, а также пептона на S.typhi (162,168).
Еще в середине прошлого века было установлено, что карбоксиметоксиламин способствует образованию L-форм S typhi murium, S. typhi и других бактерий. L-трансформирующее действие этого вещества проявляется в узких границах концентраций. При концентрации 0,1% рост бактерий полностью задерживается; 0,05% ведет к набуханию клеток, к превращению их в большие тела, которые вскоре дезинтегрируются и гибнут; 0,025% и 0,012%) карбоксиметоксилина способствует превращению бактерий в большие тела, из которых потом образуются L-формы (177).
Из физических факторов, способствующих L-индукции, можно отметить действие Х-лучей на отдельных представителей группы протея (48) и ультрафиолетовых лучей, которые индуцируют образование L-формы у сальмонелл (5,6,64,90,98).
Вслед за открытием L-форм бактерий были обнаружены фильтрующие формы. Данные литературы (45,49,50,51,110), посвященные сравнительному анализу биологических свойств фильтрующих и L-форм бактерий, позволяют сформулировать следующие положения: «Фильтрующие формы, образующиеся при распаде бактериальных клеток, во многом сходны с субмикроскопическими структурными элементами L-форм. Одинаковые размеры, обуславливающие их прохождение через бактериальные фильтры и осаждения при центрифугировании на больших скоростях, сходство морфологии, замедленный процесс регенерации и неполная реверсия биологических признаков исходных культур - свойства, сближающие фильтрующиеся формы бактерий с фильтрующими элементами L-форм» (43,81).
Электронномикроскопическое изучение культур S.typhi, выращивавшихся в течение 7 и 20 суток при 37С (44), позволило выявить значительные морфологические изменения, резко отличающие эти культуры от молодых 8 часовых культур (40, 41).
Значительные изменения морфологии бактериальных клеток, сопровождающиеся образованием фильтрующихся форм, происходят под влиянием различных физических воздействий (54,64,90,98).
Фильтрующиеся формы обнаруживались в фильтратах культур, выращивавшихся при низких температурах, сохранявшихся в течение 1-2 суток в рефрижираторе, подвергавшихся попеременному замораживанию и оттаиванию, прогревавшихся до 56С и выше . Механическое разрушение бактерий в шюттель-аппарате, плазмоптизирующее действие дистиллированной воды, а также комбинированное действие разных физических факторов нередко завершается образованием фильтрующихся форм (5,6,20,39,43).
При длительном воздействии дистиллированной воды на культуру S.typhi в ней преобладают огромные клетки неправильной и сферической формы, содержащие как бы обрывки гранулярных масс разрушенного клеточного содержимого. При выращивании культур в условиях, не соответствующих их нормальным физиологическим потребностям, например, на средах, содержащих высокие концентрации углеводов или солей, а также при воздействии разнообразных химических агентов возникают измененные формы бактериальных клеток, распадающихся на субмикроскопические фильтрующиеся гранулы (79,99,104,105,137,199).
Воздействия различных агентов также вызывают значительные морфологические изменения бактериальных клеток (152). Например, под влиянием 96 этилового спирта, хлороформа, толуола и других веществ можно наблюдать фрагментацию протоплазмы, образование гранул, растворение отдельных фрагментов и сохранение пустых клеточных оболочек в виде чехлов. Однако из фильтратов культур, подвергшихся длительному воздействию химических агентов, выделить атипичные формы удается очень редко (115,127,135,146,155).
Изучение биохимических свойств исследуемых культур
В работе использованы 228 штаммов S.typhi, выделенные от больных брюшным тифом в различных районах Республики Таджикистан. Из имеющихся в коллекции для исследования культур S.typhi, 63 штамма были отнесены к морфологически атипичным вариантам и 64 были идентифицированы как биохимически атипичный вариант, а остальные 101 культур характеризовались как типичные штаммы S.typhi. Морфологически атипичные варианты S.typhi были изолированы из патологического материала (кровь, испражнение) больных с бактериологически неподтвержденным диагнозом брюшного тифа, которым диагноз был поставлен врачами - инфекционистами на основании клинических данных.
Для выделения морфологически атипичных вариантов S.typhi посев исследуемого материала производили в полужидкой среде следующей прописи: бульон Готтингера, 0,3% агара, 20% нормальной лошадиной сыворотки и от 32 до 2000 ед./мл пенициллина. Культивирование производилось в анаэробных условиях при 37 С в течение 4-7 дней.
К биохимически атипичным вариантам были отнесены брюшнотифозные сальмонеллы, ферментирующие лактозу в поздние сроки инкубации. Их выращивали на МПБ, L-бульоне, 1% МПА, средах Эндо, Левина и висмут-сульфит агаре в течение 18-24 часов при 37 С. При культивировании в жидкой среде содержимое пробирок и колб постоянно перемешивалось путем встряхивания.
Сахаролитические свойства бактерий оценивали на средах Гисса в отношении углеводов: глюкозы, лактозы, мальтозы, сахарозы, рамнозы, ксилозы, арабинозы; спиртов: маннита, сорбита, инозита, дульцита. Результаты учитывали ежедневно в течение 21 дня инкубации при 37 С. Способность расщеплять соли органических кислот определяли на среде с Д-тартратом по прописи Кауфмана (130).
Декарбоксилирование лизина оценивали на среде, предложенной Фальковым (130), утилизацию цитрата определяли по росту на цитратном агаре Симмонса. О способности расщеплять мочевину судили по росту на 1 % мочевине с индикатором бромтимолблау.
Подвижность бактерий оценивали при культивировании на 0,3% агаре после засева в пробирку с полужидким агаром и инкубирования при 37 С в термостате.
На разных этапах исследования проводили микроскопирование окрашенных по Грамму препаратов при увеличении х900. В мазках оценивали наличие характерных грамотрицательных палочек.
Антигенную характеристику культур устанавливали по общепринятой схеме агглютинации на стекле с соответствующими монорецепторными сыворотками к О-, Н- и Vi- антигенам производства Санкт-Петербургского института вакцин и сывороток. Интенсивность реакции оценивали в крестах по трехбальной системе (68,130).
Фаготипирование штаммов проводили по международной схеме, разработанной в Тбилисском НИИВС (1974). Фаговар устанавливали по определенному рисунку лизиса культуры типовыми фагами. Использовали 3-4-х часовые культуры и бактериофаги в рабочих разведениях. Результаты типирования учитывали через 5-6 и 24 часа. Определение фаговара проводили в соответствии с разработанными схемами, имеющимися в литературе (138).
Чувствительность бактерий к антибиотикам определяли в соответствии с приложением N 1 к приказу МЗ СССР N 250, от 13 марта 1975г. "Об унификации методов определения чувствительности микро-организмов к химиотерапевтическим препаратам". Использовали метод разведения в твердой питательной среде.
Методом разведения в твердой питательной среде определяли МИК 14 противомикробных препаратов: Gm, Cm, Ар, Phd, Km, Zp. В качестве посевного материала использовали суточные бульонные культуры, разведенные физиологическим раствором до 106 КОЕ в 1,0 мл. Устойчивыми к данной концентрации считали культуры, при посеве которых через сутки инкубации при 37С наблюдали сплошной рост на месте капли суспензии бактерий. Последнее разведение антибиотика с полной видимой задержкой роста считали минимальной ингибирующей концентрацией (МИК).
Определение минимальной ингибирующей концентрации антибиотика методом разве дения в твердой питательной среде
Амплификация ДІЖ с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) стала одним из основных методов молекулярной микробиологии, позволяющей решать самые разнообразные задачи в научных исследованиях. Все шире используется метод ПЦР при решении фундаментальных и прикладных вопросов инфекционной патологии. Однако возможности ПЦР, вероятно, еще не исследованы до конца, примером чего может служить разработка, в последние годы, ее новых вариантов для использования в генетическом типировании (106,107). В настоящее время ПЦР-метод широко применяется с целью идентификации возбудителей стрептококковой, туберкулезной инфекции, диагностики заболеваний передающихся половым путем: хламидиозы, микоплазмозы и ряда других инфекций (103,164).Вместе с тем, несмотря на высокую разрешающую способность метода,, многие из существующих вариантов ПЦР трудоемки и не приемлемы для практических лабораторий.
Исходя из этого, а так же из поставленной задачи, нами был проведен анализ хромосомной ДНК сальмонелл, принадлежащих к различным вариантам S. typhi: типичным, биохимически и морфологически атипичным штаммам, методом экспресс ПЦР в модификации А.Н. Суворова и соавт. (1995), используя универсальные ДНК праймеры (192,207). ПЦР проводилась нами с одним из ДНК праймеров: LPI или LE21 с олигонуклеотидными последовательностями CCCCTGTAGACGGCAA и S GGATCCGGGGGGCGGTTCT, соответственно. При таком способе постановки реакции с использованием одного праймера размеры амплифицированных фрагментов зависят от расстояния между участками генома сальмонелл, гомологичными праймеру. В результате такой ПНР, в зависимости от применяемого праймера, обычно образовывается 2 и более фрагментов, которые легко выявляются после гель-электрофореза в агаре. Особый интерес представляло изучение состава плазмид исследованных штаммов S. typhi. В главе 4.2 было показано, что биохимически и морфологически измененные варианты S. typhi характеризуются повышенным уровнем МИК к использованным в работе антибактериальным препаратам, чем типичные (природные) штаммы. Для выяснения их особенностей все биохимически измененные и морфологически атипичные штаммы, а также 20 типичных штаммов с высоким уровнем МИК антибиотиков анализировали на наличие плазмид. Несмотря на использование современных высокочувствительных методов выделения плазмидной ДНК, нам не удалось обнаружить ни одного плазмидосодержащего штамма S. typhi. Следовательно, можно предположить, что резистентность S. typhi, циркулирующих в Таджикистане, к некоторым фармакологическим агентам обеспечивается хромосомными или другими приобретенными факторами.
Следующим этапом генетического исследования стал анализ хромосомной ДНК типичных штаммов S.typhi. Анализ электрофореграммы продуктов экспресс-ПЦР показал, что штаммы, принадлежащие к различным фаговарам, по паттерну ДНК четко различаются между собой (рис.10). Различия заключаются в том, что, наряду с общими амплификационными паттернами, наблюдаются фрагменты, различающиеся по электрофо-ретической подвижности.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что применение одного праймера, в данном случае LE21, позволяет провести не только быструю индикацию, но и идентифицировать штаммы S. typhi, принадлежащие к специфическим фаговарам. На следующем этапе генетического исследования нами была предпринята попытка, использовать ПЦР-анализ с целью выявления атипичных вариантов S. typhi.
Анализ результатов исследований показал, что с помощью метода экспресс-ПЦР можно выявить и идентифицировать не только морфологически или биохимически типичные штаммы сальмонелл, но также этот метод позволяет выявлять штаммы, отклоняющиеся по биохимическим
и морфологическим свойствам от видовой характеристики S.typhi. С этой целью мы изучали штаммы, не обладающие полным антигенным набором, выявление и идентификация которых необычайна сложна (рис.11). Установлено, что хромосомная ДЬЖ штамма, принадлежащая к L-форме S. typhi (дорожка 2), Vi-инагглютинабельного (дорожка 3) и биохимически атипичного вариантов (дорожка 4), которые были выделены из одного эпидемического очага, дают картину амплификации, сходную с картиной, полученной при амплификации ДНК контрольного штамма (дорожка 5). В качестве контрольного мы взяли штамм S. typhi, который по основным дифференцирующим признакам соответствовал характеристике S. typhi. Наряду с ПЦР-анализом хромосомной ДНК исследуемых штаммов, большой практический интерес представляют результаты риботипирования исследованных штаммов (рис.12.).
Так, сравнительному анализу были подвергнуты 3 штамма S. typhi, принадлежащие фаговарам 43, 46, 27, по 3 штамма биохимически и морфологически измененных вариантов, а также 1 штамм Vi-инагглютина-бельной брюшнотифозной сальмонеллы. Штамм S. typhi фаговар 46, Vi-инагглютинабельный штамм и по одному штамму биохимически и морфологически измененных вариантов были выделены из одного эпидемического очага. Штамм фаговара 43 с двумя атипичными штаммами и фаговар 27 также с аналогичными штаммами были изолированы из других, эпидемически не связанных между собой семейных очагов. При постановке риботипирования в качестве зонда использовался фрагмент гена 23 SPHK рибосомального оперона E.coli, меченный дигоксигенином. При анализе гибридизации ДНК штаммов у всех них, как и предполагали, удалось увидеть по 6 гибридизирующихся фрагментов. Однако анализ электрофореграмм показал, что хромосома ДНК фаготиповой принадлежности отличаются по электрофоретической подвижности. Вместе с тем, ДНК атипичных штаммов, выделенных из различных семейных очагов брюшнотифозной инфекции,
Морфологические свойства, антигенная структура, ферментативная активность исследуемых штаммов S.typhi
Сравнительный анализ антибиотикограмм типичных и атипичных вариантов сальмонелл показывает, что штаммы без нарушения метаболитической системы и клеточной стенки характеризуются широким диапазоном МИК, чем штаммы S. typhi с нарушениями этих свойств. Так, среди исследованных естественных или типичных культур встречались штаммы с дозой МИК для трех, использованных в работе антибиотиках, равной 2 мкг/мл. Тогда как этот показатель для биохимически измененных штаммов составлял 16 мкг/мл и больше. МИК всех чувствительных к использованным в работе антибиотикам морфологически атипичных штаммов была 32 мкг/мл и выше.
Полученные результаты дают основание заключить, что высокая доза МИК биохимически и морфологически измененных вариантов S. typhi, по-видимому, в какой-то мере связана с изменением метаболитической активности или с нарушениями механизма доступа антибактериального препарата к молекуле - мишени морфологически атипичных штаммов, т. е. штаммов с нарушенной клеточной стенкой. Здесь следует отметить, что результаты наших исследований по некоторым параметрам совпадали с данными других исследователей. Еще в начале 60-х годов авторы (46,48,49) отметили сохранение ферментативных систем у представителей L-форм S. typhimurium, ослабление ферментации мальтозы и приобретение способности ферментировать сахарозу у L - форм S. typhi. О приобретении способности ферментировать вещества, не расщепляемые культурами исходных (типичных) видов бактерий, свидетельствуют также данные других авторов (10,15,18,19), выделенные ими штаммы, которые либо не обладали признаками, свойственными S. typhi, либо дополнительно расщепляли лактозу, сахарозу или левулезу. Однако эти авторы и другие исследователи не приводят данные о генетической структуре и особенностях хромосомной ДНК измененных вариантов брюшнотифозных сальмонелл. Поэтому следующим этапом нашего исследования стал генетический анализ хромосомной ДНК как типичных, так и атипичных штаммов S. typhi.
В связи с этим была проверена возможность использования и эффективность экспресс-ПЦР анализа, разработанного А.Н. Суворовым и соавт., 1995 . Молекулярно-генетическому исследованию с использованием в качестве ДНК праймеров LP1 и LE21 была подвергнута хромосомная ДНК типичных, биохимически измененных и морфологически атипичных (L -форм) брюшнотифозных сальмонелл. Об эффективности ПЦР-анализа с целью генетического типирования или идентификации микроорганизмов сообщают многочисленные авторы (161,188,191,198). Высокая специфичность метода ПНР позволяет определять видовую принадлежность не только живых бактериальных клеток, но и обнаружить и идентифицировать нежизнеспособные микроорганизмы.
Информативными оказались результаты использования экспресс-ПЦР анализа при идентификации типичных штаммов сальмонелл, относящихся к различным фаговарам. Установлено, что применение одного праймера, в данном случае LE21, позволяет характеризовать и идентифицировать штаммы S. typhi, принадлежащие к специфическим фаговарам. Так, ДНК штаммов, принадлежащих к различным фаговарам, давали различную картину электрофореграмм. При сравнении результатов, наряду с общими амплификационными паттернами, наблюдались фрагменты, различающиеся по электрофоретической подвижности, что позволяет установить не только серотиповую, но и определить фаготиповую принадлежность штаммов S. typhi, т. е. проводить генотипирование брюшнотифозных сальмонелл, что соответственно имеет большое эпидемиологическое значение.
Анализ результатов дальнейших исследований показал, что ПЦР анализ позволяет выявлять и генотипировать не только морфологически или биохимически типичные штаммы S. typhi. С помощью этого метода можно выявлять и характеризовать штаммы, отклоняющиеся от видовой характеристики этих микроорганизмов. Так, биохимически измененные L-формы и Vi - инагглютинабельные штаммы S. typhi, изолированные из одного эпидемического очага давали электрофореграмму, сходную с амплификационной картиной ДНК контрольного штамма с известной фаготиповой принадлежностью (типичный штамм), также выделенного из этого же очага. Учитывая тот факт, что выделение и установление видовой или серотиповой принадлежности атипичных вариантов, в частности L-форм, чрезвычайно сложно, ПЦР анализ можно рекомендовать как эффективный метод микробиологической и эпидемиологической диагностики при брюшном тифе, вызванном атипичными вариантами S. typhi.
Проведенный молекулярно-генетический анализ хромосомной ДНК брюшнотифозных сальмонелл показывает, что, наряду с ПЦР, немаловажное значение при атипичном варианте возбудителя и атипичном клиническом проявлении брюшного тифа имеют рестрикционный и гибридизационный анализ хромосомной ДНК брюшнотифозных сальмонелл. По данным литературы (96,97,98,166), риботипирование и гибридизационный анализ позволяют выявить и идентифицировать сальмонеллы различной серотипо-вой принадлежности S. typhi, paratiphi A, S. infantis и др.
Результаты наших исследований позволяют заключить, что, используя молекулярный ДНК зонд pSSl, можно установить фаготиповую принадлежность S. typhi и при наличии компьютерных образцов идентифицировать трудно выявляемые атипичные штаммы. Так, атипичные штаммы, которые бактериологическими методами выделялись с большим трудом и требовали больших финансовых расходов, были легко идентифицированы как фаго-типы 46, 43 и 27. В целом, такой подход позволит существенно упростить и ускорить существующую на сегодня эпиддиагностику и проводить эффективные противоэпидемические мероприятия.
