Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Актуальные проблемы гнойных бактериальных менингитов .11
1.1. Эпидемиология и вакцинопрофилактика гнойных бактериальных менингитов в мире .11
1.2. Лабораторная диагностика гнойных бактериальных
менингитов 23
1.3. Генотипирование возбудителей гнойных бактериальных менингитов 31
1.4. Эпидемиология и вакцинопрофилактика гнойных бактериальных менингитов в Российской Федерации 39
Собственные исследования
Глава 2. Материалы и методы исследования 46
2.1. Материалы исследования .46
2.2. Методы исследования .54
2.2.1. Статистические методы 54
2.2.2. Исследование культуры от больных гнойными бактериальными менингитами 57
2.2.3. Генетические методы исследования культуры, клинического и аутопсийного материала от больных гнойными бактериальными менингитами 61
2.2.4. Метод мультилокусного секвенирования-типирования штаммов
N. meningitidis 64
Глава 3. Эпидемиологическая характеристика гнойных бактериальных менингитов в российской федерации 66
3.1. Заболеваемость гнойными бактериальными менингитами .66
3.2. Распределение месячных показателей заболеваемости гнойными бактериальными менингитами 74
3.3. Возрастная характеристика заболевших гнойными бактериальными менингитами 81
3.4. Этиологическая характеристика возбудителей гнойных бактериальных менингитов 84
3.5. Серогрупповая характеристика штаммов N. meningitidis... 90
3.6. Распределение заболевших гнойными бактериальными менингитами по полу 94
3.7. Социальный статус заболевших гнойными бактериальными менингитами 95
3.8. Заболеваемость гнойными бактериальными менингитами среди городских и сельских жителей 96
3.9. Летальность от гнойных бактериальных менингитов .97
3.10. Смертность от гнойных бактериальных менингитов 102
РЕЗЮМЕ .106
Глава 4. Лабораторная диагностика гнойных бактериальных менингитов в российской федерации резюме 123
Глава 5. Мультилокусное секвенирование-типирование российских штаммов N.meningitidis .124
5.1. Мультилокусное секвенирование-типирование штаммов N.meningitidis серогруппы А 131
5.2. Мультилокусное секвенирование-типирование штаммов N.meningitidis серогруппы В и С. 133
5.3. Мультилокусное секвенирование-типирование штаммов N.meningitidis серогруппы W -135 .138
6 5.4. Антигенный профиль штаммов N.meningitidis 139
Резюме .145
ГЛАВА 6. Современные подходы к эпидемиологическому мониторингу за гнойными бактериальными менингитами в российской федерации .147
Заключение 151
Выводы 159
Список литературы
- Генотипирование возбудителей гнойных бактериальных менингитов
- Генетические методы исследования культуры, клинического и аутопсийного материала от больных гнойными бактериальными менингитами
- Этиологическая характеристика возбудителей гнойных бактериальных менингитов
- Мультилокусное секвенирование-типирование штаммов N.meningitidis серогруппы W
Введение к работе
Актуальность темы
Разработка и внедрение в практику здравоохранения вакцин против инфекций, вызываемых менингококком, пневмококком и гемофильной палочкой типа b, которые являются основными возбудителями гнойных бактериальных менингитов (ГБМ), стало очевидной реальностью и привело к значительному снижению трагического влияния этих заболеваний на популяцию людей (Bottomley et al., 2012; Swartz, 2004). Опыт стран с активной позицией специфической иммунопрофилактики инвазивных бактериальных инфекций, включающих прежде всего ГБМ, указывает на важность и необходимость организации системы эпидемиологического мониторинга, основанного на данных лабораторной диагностики. Представляя собой сходный симптомокомплекс клинических проявлений, ГБМ полиэтиологичны по своей природе (А.А. Демина, 1985; Н.Н. Костюкова и соавт., 1992; И.С. Королева, 2000). Определение этиологического агента является приоритетной задачей для специалистов различной медицинской профессиональной направленности, отвечающих за результаты лечения, за состояние эпидемиологического статуса территории и адекватность применяемых профилактических и противоэпидемических мероприятий. Между тем учет ГБМ, за исключением генерализованной формы менингококковой инфекции (ГФМИ) в рамках государственной статистической отчетности на территории Российской Федерации (РФ) не проводится и определить эпидемиологические характеристики не представляется возможным. В РФ лабораторная диагностика ГБМ регламентируется Методическими Указаниями 4.2.1887-04 «Лабораторная диагностика менингококковой инфекции и гнойных бактериальных менингитов». Уровень лабораторного подтверждения диагноза составляет в среднем лишь 36%. Более 60% случаев ГБМ остаются этиологически нерасшифрованными (И.С. Королева и соавт., 2002-2009). В современных условиях все убедительнее обосновывается необходимость использования молекулярно-генетических методов в мониторинге за возбудителями инфекционных заболеваний. Так, в единую систему объединена международная интернет-база, включающая сведения об основных возбудителях ГБМ на уровне локусов гена, что дает уникальную возможность проводить эпидемиологические сопоставления, выявлять опасные клоны и прогнозировать возможное эпидемическое неблагополучие. В РФ не налажена система мониторинга за молекулярно-генетическими свойствами основных возбудителей ГБМ. Известны исследования, проведенные лишь на отдельных территориальных образованиях страны (К.О. Миронов и соавт., 2011; Н.Г. Анпилова и соавт., 2012).
Цель работы
Разработка и апробация системы эпидемиологического мониторинга за гнойными бактериальными менингитами в Российской Федерации.
Задачи исследования
1. Наладить учет случаев ГБМ по персонифицированной системе сбора информации на всех территориальных образованиях РФ и выявить эпидемиологические особенности ГБМ.
2. Разработать анкетные формы по вопросам лабораторной расшифровки диагноза ГБМ и провести анкетирование бактериологических лабораторий ведущих лечебно-профилактических учреждений здравоохранения в субъектах РФ, занимающихся диагностикой ГБМ.
3. Оценить состояние этиологической диагностики ГБМ и предложить комплекс организационных мер по повышению ее результативности.
4. Изучить молекулярно-генетические свойства N.meningitidis различных серогрупп, выделенных от больных ГФМИ, и внедрить систему биомониторинга за N. meningitidis на территории РФ.
5. Разработать принцип организации системы эпидемиологического мониторинга за ГБМ в РФ.
Научная новизна
1. Определена неизвестная ранее эпидемиологическая характеристика ГБМ в РФ на основании персонифицированных данных, полученных со всех территориальных образований РФ.
2. Дана оценка состоянию лабораторной диагностики ГБМ, установлены факторы, влияющие на ее результативность, и в результате комплекса предложенных организационных мер достигнуто повышение уровня лабораторного подтверждения диагноза ГБМ в РФ.
3. Получено подтверждение продолжающегося межэпидемического периода МИ в РФ на основании изучения генетических характеристик N. meningitidis методом мультилокусного секвенирования-типирования (МЛСТ).
4. Обнаружены новые сиквенс-типы N. meningitidis, выявленные впервые в мире.
5. Предложен принцип организации системы эпидемиологического мониторинга за ГБМ в РФ, основой которой являются: персонифицированный учет каждого случая ГБМ, результативная лабораторная диагностика и характеристика штаммов N. meningitidis с помощью МЛСТ.
Практическая значимость
1. Предложен комплекс организационных мер, направленных на повышение результативности лабораторной диагностики ГБМ.
2. Даны рекомендации по внедрению системы мониторирования генетических характеристик N.meningitidis различных серогрупп на территории РФ для прогнозирования эпидемического неблагополучия в отношении менингококковой инфекции.
Внедрение результатов в практику
Подготовлены и изданы информационно-рекомендательные документы, способствующие внедрению системы эпидемиологического мониторинга за ГБМ на территории РФ:
1) Информационное письмо Роспотребнадзора №01/9620-0-32 от 29.06.2010 «О взаимодействии территориальных органов Роспотребнадзора с Референс-центром по мониторингу за бактериальными менингитами».
2) Информационное письмо Роспотребнадзора №01/10303-12-32 от 12.09.2012 «О результатах мониторинга за заболеваемостью менингококковой инфекцией и бактериальными менингитами в Российской Федерации в 2011 г».
3) Информационное письмо Роспотребнадзора №01/7690-12-32 от 11.07.2012 «О подготовке материалов к коллегии по бактериальным менингитам».
4) Информационно-аналитический обзор Российского Референс-Центра по мониторингу за бактериальными менингитами «Менингококковая инфекция и гнойные бактериальные менингиты», 2012 год.
5) Приказ №1001 Роспотребнадзора от 31.12.2013 «О проведении научно-практического семинара для эпидемиологов и специалистов лабораторной сети по вопросам эпидемиологического надзора и лабораторной диагностики гнойных бактериальных менингитов».
Публикации
Основные материалы диссертации опубликованы в 31 научной работе, из них 5 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.
Апробация диссертации
Основные результаты работы доложены на:
-
Научно-практических конференциях молодых ученых и специалистов Федерального бюджетного учреждения науки «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» (ФБУН ЦНИИЭ) Роспотребнадзораx: «Диагностика, профилактика и лечение инфекционных болезней» 24-25 ноября 2009 года, «Актуальные вопросы эпидемиологии, клиники, диагностики, лечения и профилактики респираторных инфекций» 28 октября 2010 года, «Новые научные достижения молодых ученых в эпидемиологии, клинике, диагностике, лечении и профилактике инфекционных болезней» 31 октября 2013 года.
-
III Научно-практической школе-конференции молодых ученых и специалистов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора «Современные технологии обеспечения биологической безопасности», Оболенск, 31 мая – 2 июня 2011 года.
Апробация состоялась 26 июня 2014 года на заседании апробационного совета при ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора.
Личный вклад
Автором лично и при его непосредственном участии были выполнены эпидемиологические, лабораторные, математико-статистические, некоторые молекулярно-биологические исследования; подготовлены материалы для издания информационно-рекомендательных документов, публикаций.
Структура и объем работы
Генотипирование возбудителей гнойных бактериальных менингитов
Гнойные бактериальные менингиты (ГБМ) являются широко распространенными заболеваниями, наносящими огромный медико-социальный ущерб как в развитых, так и развивающихся странах [7,8,18,19,98,106,113,121]. Эти заболевания отличаются не только высокими показателями заболеваемости, смертности и летальности, но и частыми осложнениями, затрудняющими нормальное развитие и полноценную жизнь переболевшего менингитом. Заболевание может развиться в любом возрасте, но наиболее часто встречается в первые два года жизни. Патофизиология менингеальной инфекции хорошо изучена [74,114,115]. Факт того, что наиболее распространенные возбудители ГБМ (менингококк, пневмококк, гемофильная палочка) - это инкапсулированные бактерии не случаен. Данное качество позволяет им вторгаться в организм человека путем колонизации носоглотки, инвазии ее слизистой оболочки, диссеминации в кровотоке с уклонением от детекции и уничтожения системой комплемента человека, преодоления гемато-энцефалического барьера и проникновения в спинно-мозговую жидкость и менингеальные оболочки. При этом бактерии вызывают гнойное воспаление оболочек головного и спинного мозга [60,71]. Существуют иные пути для достижения патогеном мягких мозговых оболочек – это прямое проникновение в них в результате травмы или операции, и диссеминация из инфекционного очага параменингеальных структур. Клиническая картина включает в себя резкое повышение температуры, головную боль, фотофобию, ригидность затылочных мышц шеи, общее недомогание, нарушение сознания, летаргию, судороги, рвоту [8,18,19,66,98,106,116]. По данным Durand ML, при исследовании 493 больных ГБМ взрослых, 2/3 из них демонстрировали «классическую триаду» клинических проявлений - температура, ригидность затылочных мышц и нарушение сознания, при этом лихорадка отмечалась у 95% больных [62]. В других исследованиях «классическая триада» была менее выражена и наблюдалась в 21-51% случаев, но все случаи заболевания включали в себя по крайней мере один из трех симптомов [95,105]. В случае менингококкцемии на теле больного появляется петехиальная сыпь. Осложнения от ГБМ являются очень суровыми, но использование сильных антимикробных препаратов и схем интенсивной терапии может улучшить исход. Непосредственные осложнения включают в себя шок, кому, судороги, двустороннее кровоизлияние в надпочечники, остановку сердца и дыхания [62]. Отсроченные осложнения - параличи, умственная недостаточность, глухота, слепота, смерть [66]. По данным Karen Edmond инвалидизация среди выживших составляет 12-35% [63].
Помимо основных, другие микроорганизмы (стафилококк, стрептококк, листерия, кишечная палочка, грибы и др.) также играют важную роль, в частности при менингитах новорожденных [71].
Среди бактериальных менингитов менингококковая инфекция (МИ) вызывает наибольшую озабоченность в мире из-за эпидемий, создающих сложные ситуации не только для стран (территорий), пораженных эпидемическим менингитом, но и для соседних стран [3,6]. С 40-х годов XX века и до настоящего времени эпидемии менингита в Африке по своему размаху представляют исключительное явление, не описанное ранее в каких-либо других странах. Эта зона высокой заболеваемости, относящаяся к субэкваториальному поясу и расположенная между Сахарой с севера и экваториальным лесом с юга, была названа в 1963 году исследователем Lapeyssonnie «менингитным поясом» [33]. В обзорах по менингиту в Африке отмечается связь эпидемических подъемов с засушливым периодом года, скученностью людей в закрытых помещениях, возникновением песчаных бурь, в результате которых нарушается слизистая носоглотки, что способствует проникновению бактерии. Эпидемии МИ встречаются не только на африканском континенте. Известны крупные вспышки и эпидемии в СССР, Бразилии, на Кубе, в Иране, Ираке, Непале, Китае, Индии, Монголии, Саудовской Аравии, в европейских странах (Англия, Норвегия), в Новой Зеландии. Показатель заболеваемости в межэпидемический период в развитых странах составляет от 1 до 10 на 100 тыс. населения, в то время как в развивающихся странах - 20 на 100 тыс. населения. Уровень заболеваемости в период эпидемий характеризуется показателями от 500 на 100 тыс. населения и выше [57].
По данным литературы гемофильная палочка и пневмококк выдвигаются на ведущие позиции в этиологии эндемического менингита. Уровень заболеваемости менингитом, вызванным гемофильной палочкой типа b в странах Запада составляет 1-3 на 100 тыс. населения, хотя нужно отметить, что во многих странах регулярного и полноценного статистического учета этой формы менингита нет. Свыше 90% случаев заболевания регистрируется среди детей до 5 лет, с пиками заболеваемости в странах умеренного климата осенью и весной. Значимость инфекций, вызванных гемофильной палочкой, не ограничивается лишь бактериальным менингитом, нужно принимать во внимание и широко распространенные пневмонии этой этиологии и другие заболевания (бактериемия, отит, целлюлит, эпиглоттит, септический артрит и др.).
Менингиты пневмококковой этиологии распространены в мире повсеместно. Показатели заболеваемости в западных странах составляют 1-2 на 100 тыс. населения, в развивающихся – 20 на 100 тыс. населения. В регионах умеренного климата заболеваемость повышается в холодное время года. Наивысшие показатели заболеваемости этой формой менингита отмечаются у детей до 1 года, с последующим снижением в старших возрастных группах и вновь высоким уровнем заболеваемости среди пожилых лиц. Отмечают большую частоту заболеваний пневмококковым менингитом среди лиц мужского пола, с соотношением к заболеваемости у лиц женского пола 3:1. Среди факторов риска менингита, вызванного пневмококком, - травмы черепа, нарушение иммунного статуса организма вследствие его заболевания или его специфического лечения. Особая категория «группы риска» - это лица с функциональной аспленией. Такие лица чрезвычайно подвержены пневмококковой инфекции, которая принимает у них острый характер с развитием не только менингита, но и сепсиса. Необходимо отметить, что летальность при пневмококковом менингите в несколько раз выше, чем при менингитах, обусловленных менингококком или гемофильной палочкой. Также как и при гемофильной инфекции проблема заболеваний пневмококковой этиологии не ограничивается менингитами. Большое значение имеют пневмонии и отиты, обусловленные этим микроорганизмом. Однако, данные по развивающимся странам в отношении распространенности пневмококковых менингитов также отрывочны [57].
В XX веке впечатляющий эффект на эпидемиологию ГБМ оказали антимикробные препараты. До их использования исход болезни для больных ГБМ был трагическим. [84]. К примеру, в 20-х годах XX века 77 случаев заболеваний менингитом, вызванным гемофильной палочкой типа b (Хиб-менингит) из 78 в Детском Госпитале Бостона закончились летально (летальность 99%). Исход пневмококкового менингита также был трагичен: все 300 случаев заболеваний закончились летально. В первом десятилетии XX века летальность от менингококкового менингита составляла 75-80%. Внедрение антимикробной терапии поспособствовало впечатляющему снижению показателей летальности от ГБМ, тем самым к концу XX века они составили для Хиб-менингита 5%, для пневмококкового менингита 20%, для менингококкового менингита 10% (рис.1). По мнению Morton N. Swartz, будущий прогресс в снижении показателей заболеваемости и смертности в отношении ГБМ может быть больше связан с профилактическими, нежели чем с терапевтическими мерами.
Генетические методы исследования культуры, клинического и аутопсийного материала от больных гнойными бактериальными менингитами
В настоящее время для профилактики пневмококковых отитов существует полисахаридная вакцина против 10 серотипов пневмококка (10-valent pneumococcal conjugate vaccine, Synflorix), при этом 8 из них конъюгированы с протеином D нетипируемой гемофильной палочки [95]. Эффективность этой вакцины доказана и при гемофильном отите, но пока нет данных об ее эффективности против менингита, вызванного нетипируемой гемофильной палочкой. В литературе отмечается важная роль гемофильной палочки типа a как этиологического агента бактериальных менингитов в некоторых сообществах коренных американцев [69]. Таким образом, необходим непрерывный мониторинг за гемофильной инфекцией и биологическими характеристиками гемофильной палочки.
Использование семивалентной конъюгированной пневмококковой вакцины PCV7 (7-valent pneumococcal conjugate vaccine) против 7 серотипов пневмококка (4, 6B, 9V, 14, 18C,1 9F, 23F) привело к резкому и почти 100% снижению заболеваемости пневмококковым менингитом среди детей до 5 лет [91,92].
Большое разнообразие серотипов на разных территориях, изменчивость генетических характеристик штаммов, а также возможность эффекта переключения капсулы привело к формированию вакцин второго поколения. Были разработаны вакцины с девятью, десятью, одиннадцатью, тринадцатью конъюгатами (включая серотипы 1, 3, 5, 6А, 7F, 19A), при этом 10-валентная и 13-валентная вакцины достигли лицензирования [91]. Действительно, в то время как PCV7 охватывала 80-90% серотипов, вызывающих пневмококковую инфекцию у маленьких детей в США и Австралии, в странах Западной Европы и Африки охват вакциной мог упасть до 70-75%, а в странах Латинской Америки и Азии – до 50-65% [95]. Необходимо отметить важное значение PCV7 вакцины, которая индуцирует популяционный иммунитет за счет снижения назофарингеального носительства 7 серотипов пневмококка [56]. При этом отмечается снижение заболеваемости пневмококковым менингитом неиммунизированных взрослых на 30%, что могло бы дать надежду на локальную ликвидацию инфекции [92,97]. Однако, в связи с широким распространением путешествий по всему миру и вышеупомянутой изменчивости пневмококковых штаммов, следует продолжать вакцинацию и осуществлять качественный эпидемиологический и генетический мониторинг пневмококкового менингита. Необходимость создания универсальной вакцины, охватывающей все 93 серотипа пневмококка, привела в возникновению нового поколения белковых пневмококковых вакцин [104]. В этих целях осуществляются глобальные исследования секвенирования всего генома тысяч инвазивных и носоглоточных штаммов пневмококка [81].
Преимущественно шесть серогрупп менингококка (A, B, C, W-135, X, Y) вызывают инвазивную менингококковую инфекцию по всему миру. В этой связи определена их высокая эпидемиологическая важность [110]. На сегодняшний день доступны полисахаридные и конъюгированные вакцины против менингококка серогрупп A, C, W-135, Y, а в 2013 году лицензирована мультикомпонентная вакцина против менингококка серогруппы В.
В современных условиях разработана, зарегистрирована и активно применяется новая конъюгированная вакцина против менингококка серогруппы А в африканском менингитном поясе, что является обнадеживающей моделью профилактики заболевания в случае проведения масштабной вакцинации. В 2001 году были установлены партнерские отношения между ВОЗ и Program for Appropriate Technology in Health (РАТН), которые при поддержке Фонда Билла и Мелинды Гейтс образовали Meningitis Vaccine Project (MVP), нацеленный на разработку, испытание и лицензирование вакцины для стран суб-сахарной Африки [73]. Была создана вакцина MenAfriVac, вакцинация которой началась в 2010 году в странах менингитного пояса [107]. Эта вакцина, рекомендованная для детей и молодых взрослых от 1 года до 29 лет привела к впечатляющему снижению заболеваемости МИ, вызванной менингококком серогруппы А в Африке. Охват вакцинацией населения был высок, достигая, например, в Буркина Фасо 100%. Из-за недавних эпидемий МИ, вызванной менингококком серогрупп W-135 и Х, возникла необходимость разработки мультивалентной вакцины, включающей расширенный спектр серогрупп [54,61,86]. Оценка эффективности вакцинации и анализ течения эпидемического процесса МИ в Африке требует непрерывного эпидемиологического надзора.
С момента активного введения в национальные календари прививок конъюгированной вакцины против МИ, вызванной менингококком серогруппы С, а также тетравалентной конъюгированной вакцины против МИ, вызванной менингококком серогрупп А, С, W-135, Y, разработка вакцин, защищающих против МИ, обусловленной менингококком серогруппы В, становится основной задачей в борьбе с МИ [81]. Сложность в использовании полисахаридных вакцин против МИ, вызванной менингококком серогруппы В, заключается в перекрестной реактивности антител к модифицированному полисахариду менингококка серогруппы В с гликопротеинами нервных клеток человека [65]. Полисахарид менингококка серогруппы В, как вакцинный кандидат, может приводить к развитию аутоимммунных заболеваний у вакцинированных лиц [5]. Существующие белковые вакцины против МИ, вызванной менингококком серогруппы В, являются строго серотип-, субтипспецифичны и эффективны для профилактики МИ на ограниченной территории. 29 мая 2013 года на 31st Annual Meeting of the European Society For Paediatric Infectious Diseases (ESPID) в Милане (Италия), была представлена первая лицензированная мультикомпанентная вакцина для борьбы с МИ, вызванной менингококком серогруппы В, - BEXSERO (Novartis) [50,71,76,88,99,117]. Вакцина содержит 4 антигена – factor H binding protein (fHbp), neisserial adhesin A (NadA), neisserial heparin binding antigen (NHBA) и порин PorA серосубтип P1.4, выбранных по причине их иммуногенности и обнаружении у большинства повсеместно циркулирующих штаммов менингококка серогруппы В [109]. В клинических испытаниях, включающих 7800 лиц от 2 месяцев и старше, BEXSERO вызвала сильный иммунный ответ у детей всех возрастных групп, включая маленьких детей от 2 месяцев, которые являются группой риска, а также у подростков и взрослых [51,94].
Этиологическая характеристика возбудителей гнойных бактериальных менингитов
Идентификация и классификация бактерий, вызывающих инфекционные заболевания, относятся к числу ключевых задач как прикладной, так и фундаментальной микробиологии и эпидемиологии. Задача краткосрочного и локального эпидемиологического расследования – являются ли штаммы, изолированные в конкретном очаге заболевания идентичными, генетически родственными или не взаимосвязанными. Задача долгосрочного и глобального эпидемиологического расследования – как связаны штаммы, циркулирующие на данной территории, со штаммами, распространенными на других территориях или в другом отрезке времени. Итогами таких расследований должно стать выяснение закономерностей распространения, циркуляции и эволюции патогенных штаммов и клонов, а также создание методов эпидемиологического надзора и прогноза, учитывающих эти закономерности [32].
Для определения фенотипических свойств возбудителей используют серологические методы классификации, основанные на выявлении антигенных детерминант молекул, представленных на бактериальной поверхности, -полисахаридов, белков, липополисахарида и т.д. Менингококки подразделяются на серогруппы (по полисахариду), подтипы (по липополисахариду), пневмококки – на серотипы, гемофильная палочка – на серотипы (по полисахариду). Однако серологические методы имеют ряд ограничений. Первое заключается в явлении взаимодействия с системами иммунитета, приводящего к воздействию на поверхностные молекулы сильного селективного давления. Механизмы, приводящие к мутациям и горизонтальному переносу генов обеспечивают широкую вариабельность поверхностных макромолекул: родственные штаммы могут иметь различные серотипы, в то время как штаммы, имеющие одинаковый серотип, не обязательно являются генетически близкими. Вторым весомым ограничением является необходимость выделения живой культуры бактерий, что далеко не всегда возможно. В этой связи актуальность приобретают генетические методы типирования. Так, используются методы генотипирования по одному гену, основанные на амплификации определенного гена с помощью ПЦР и дальнейшей идентификации ампликона следующими способами: гель-электрофорез, рестрикционный анализ, ПЦР с иммуноферментным детектированием и др. К сожалению, любые методики, работающие только с одним геном, упускают существенную информацию и, следовательно, недостаточно пригодны для классификации бактерий и филогенетических исследований.
Другим методом генотипирования является генотипирование по всему геному. К этой группе относят гель-электрофорез в пульсирующем поле (ППГЭ), ПЦР-амплификацию со случайными праймерами или праймерами, комплементарными повторяющимся последовательностям. Формальной характеристикой штамма, исследованного данными методами, является электрофоретическая картина-паттерн, т.е. специфический набор полос на электрограмме препарата ДНК штамма. Паттерн почти уникален, то есть при сравнении двух штаммов получаются одинаковые паттерны – это указывает на их идентичность. Различие в паттернах двух штаммов однозначно указывает на различие их геномов. Ограничение этих методов в том, что различие в электрофоретических паттернах не раскрывает природы, локализации и биологического смысла различия, требующего исследования иными методами. Методы получения паттернов трудно стандартизировать, а степень их различия не всегда пропорциональна степени различия штаммов. Эти методы не рекомендуется использовать для анализа долгосрочной эволюции возбудителей или сравнения штаммов, циркулирующих на разных территориях.
В настоящее время метод мультилокусного секвенирования типирования (МЛСТ), предложенный в 1994-1996 годах M. Maiden, B. Spratt и M. Achtman, является основным для типирования и характеристики популяций некоторых видов патогенных бактерий, в том числе и менингококка, пневмококка и гемофильной палочки. Методика МЛСТ заключается в последовательном выполнении следующих действий. Сначала выбирается некоторое количество фрагментов бактериальных генов (МЛСТ-локусов), обычно от 5 до 12, предпочтительно «нейтральных», не кодирующих известные факторы вирулентности и патогенности, но являющихся маркерами филогенетического родства. После выбора МЛСТ-локусов определяется их нуклеотидная последовательность. Каждая уникальная последовательность является аллелем локуса и обозначается цифрой. Набор аллелей исследуемых локусов образует аллельный профиль (последовательность из цифр, соответствующих аллелям), который определяет сиквенс-тип штамма (СТ), то есть штаммы с одинаковыми аллельными профилями относятся к одному СТ. Взаимосвязи СТ и генетическое расстояние между ними оцениваются с помощью методов кластерного анализа, реализуемых посредством специализированного компьютерного обеспечения, в том числе через интернет в режиме on-line. Результаты МЛСТ объединяются в базы данных, которые располагаются на общедоступных интернет-сайтах (Интернет-база данных - Интернет-БД). Интернет-БД содержат данные об охарактеризованных штаммах, включающие СТ, эпидемиологические данные (время, место и источник выделения), клональные комплексы, объединяющие СТ. Запрос в Интернет-БД позволяет эпидемиологу классифицировать обнаруженный штамм как известный или новый, отнести его к тому или иному СТ, и, если возможно, к тому или иному клональному комплексу, то есть получить эпидемиологическую характеристику исследуемого штамма. Преимуществами методам МЛСТ перед другими методами являются однозначная интерпретация полученных результатов и абсолютная сопоставимость данных, полученных разными исследователями. С помощью МЛСТ возможно объединять и сопоставлять результаты с помощью интернета, а постепенное накопление данных в общей Интернет-БД позволяет проводить глобальный эпидемиологический анализ распространения патогенных штаммов в разное время, на разных территориях и среди пациентов с различными клиническими проявлениями. МЛСТ можно проводить непосредственно амплифицируя соответствующие локусы из клинического материала (стерильные жидкости организма) без выделения и хранения бактерий, что сокращает время и позволяет провести типирование в отсутствии жизнеспособного возбудителя. Методика определения СТ, а также форма их представления и анализа поддаются почти абсолютной стандартизации, позволяя сопоставлять и интегрировать данные независимо работающих лабораторий в единую, общедоступную Интернет-БД. Основным недостатком метода МЛСТ является относительно высокая стоимость этапа секвенирования, что затрудняет возможность широкого использования метода отечественными эпидемиологами. Но в связи с развитием генетических технологий стоимость МЛСТ снижается и будет продолжать снижаться, что в последующем поможет ввести этот метод в рутину специализированных лабораторий [32].
На сегодняшний день созданы МЛСТ-технологии для генотипирования основных возбудителей ГБМ – N. meningitidis, S. pneumoniae, H. influenzae. В рамках настоящей работы проведено генотипирование циркулирующих на территории РФ штаммов менингококка, как наиболее распространенного этиологического агента ГБМ, а также как возбудителя, способного вызывать вспышки, эпидемии и пандемии. Схема МЛСТ штаммов менингококка была предложена и внедрена в широкую эпидемиологическую практику M. Maiden и соавторами (1996 год). Для МЛСТ используются нуклеотидные последовательности семи генов: adk (функция кодируемого белка – аденилаткиназа), gdh (глюкозо-6-фостфат дегидрогеназа), aroE (шикимат дегидрогеназа), abcZ (предположительно – АВС переносчик), pdhC (субъединица пируват дегидрогеназы), pgm (фосфоглюкомутаза), fumC (фумарат гидратаза).
Мультилокусное секвенирование-типирование штаммов N.meningitidis серогруппы W
Далее апликатором с поверхности агара снимали культуру менингококка и тщательно растворяли в каплях физиологического раствора на стекле. После этого, если не выявлялась спонтанная агглютинация с физиологическим раствором, в три подготовленные части добавляли антисыворотки к менингококку серогрупп А, В, С (по капле) и перемешивали. Учет реакции проводили через 1-2 минуты. Образование крупных хлопьев на фоне полного просветления агглютинационного поля указывал на положительную реакцию специфического взаимодействия антигена и антитела и позволяло определить серогруппу менингококка. Отсутствие реакции с одной из основных серогрупповых антисывороток указывал на необходимость продолжения проведения аналогичных исследований с другими специфическими антисыворотками (X, Y, W-135, 29E, Z).
Биохимическая активность S.pneumoniae во многом совпадает с активностью других зеленящих стрептококков. Для дифференциальной диагностики следует использовать пробу с оптохином и тесты на чувствительность к желчным кислотам. Для проведения пробы с оптохином на чашку с кровяным агаром засевали исследуемую культуру, и на поверхность помещали диск, содержащий 5 мкг оптохина (БиоМерье, Франция). После инкубации при 37оС в течение 18-24 часов вокруг диска образовывалась зона ингибиции роста 16 мм. Чувствительность к желчным кислотам определялась с помощью желчного теста: на выросшую культуру накладывали бумажный диск, содержащий 20% раствор желчи крупного рогатого скота (НИЦФ, Санкт-Петербург). Чашку инкубировали в термостате 1-2 часа при температуре 37оС. Появление вокруг диска с желчью зоны лизиса колоний (1-2 мм) свидетельствовала о принадлежности культуры к S.pneumoniae.
Окончательное заключение о принадлежности возбудителя к Haemophilus influenzaе основано на определении метаболической и ферментативной активности культуры. Для уточнения биохимических свойств, как и в случае идентификации менингококка, использовали коммерческую тест-систему, разрешенную к применению в РФ, API NH производства «БиоМерье».
Самым доступным и распространенным методом молекулярно-генетической диагностики инфекционных болезней является метод ПЦР. Преимуществом метода является возможность использования для идентификации нежизнеспособной культуры, а также клинического и аутопсийного материала, который не может быть источником культуры. Принцип метода подробно описан выше, в разделе «Обзор литературы». Практическое использование метода ПЦР в России на базе тест-систем, созданных в Центре Молекулярной Диагностики ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора (Москва) показало чувствительность метода не менее 98%, а специфичность – 100% для идентификации возбудителей, принадлежащих к родам Neisseria, Streptococcus, Haemophilus. В рамках настоящей работы проводилось два типа детекции во время выполнения метода ПЦР – электрофоретическая и гибридизационно-флуоресцентная в режиме реального времени (ПЦР-РВ). Как уже известно из литературы детекция методом электрофореза более трудоемка, менее чувствительна и специфична, чем метод ПЦР-РВ, который прост в выполнении и детекция не требует процесса открытия пробирок. Корме того, ПЦР-РВ позволяет определить видовую принадлежность возбудителя, в то время как ПЦР с электрофоретической детекцией выявляет лишь род возбудителя. В рамках данной работы преимущественно использовался ПЦР-РВ.
ДНК выделялась из нежизнеспособной культуральной суспензии, из суспензии аутопсийного материала, и непосредственно из ликвора и крови. Для постановки реакции применяли тест-системы производства ФБУН ЦНИИ эпидемиологии: «АмплиСенс Neisseria spp., Haemophilus spp., Streptococcus spp.-EPh», «АмплиСенс Neisseria meningitidis серогрупп А, В, С -EPh» (электрофоретическая детекция) , «АмплиСенс N.meningitidis / H.influenzae / S.pneumoniae-FL», а также использовалась методика ПЦР-РВ для определения серогрупп менингококка А, В, С, W-135 (гибридизационно-флуоресцентная детекция в режиме реального времени).
Метод полимеразной цепной реакции с электрофоретической детекцией. Амплификацию ДНК проводили в 25 микролитрах раствора. Для повышения эффективности амплификации использовалась техника «горячего старта», которая обеспечивалась разделением нуклеотидов и Taq-полимеразы прослойкой воска. Плавление воска и перемешивание компонентов реакции происходит только при температуре 95оС, что значительно снизило количество не специфически затравленных реакций. Постановка ПЦР проводилась с тест-системами «АмплиСенс Neisseria spp., Haemophilus spp., Streptococcus spp.-EPh» (родоспецифическая), «АмплиСенс Neisseria meningitidis серогрупп А, В, С -EPh» (группоспецифическая). В постановках использовались отрицательные (ОКО и К-) и положительные контроли (К+). Амплификация одновременно нескольких образцов проводилась на амплификаторе Терцик (ДНК-технология) и Maxygene (Gradient Therm-1000, Axygen Sientific) по следующей программе
