Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Молекулярно-генетические методы в системе эпидемиологического надзора за инфекциями, связанными с оказанием медицинской помощи (обзор литературы) 22
1.1 Молекулярная эпидемиология возбудителей ИСМП 22
1.2 Генетическая гетерогенность госпитальных популяций актуальных возбудителей инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи и значение горизонтального генетического обмена в формировании госпитальных штаммов 25
1.3 Острова патогенности и их роль в формировании эпидемических свойств у возбудителей инфекционных заболеваний 29
1.4 Роль интегронов и связанных с ними кассет генов в формировании эпидемических свойств у возбудителей инфекционных заболеваний 32
1.5 Применение методов молекулярно-генетического типирования в структуре эпидемиологического надзора за инфекциями, связанными с оказанием медицинской помощи 34
ГЛАВА 2 Материалы и методы 39
Глава 3 Обоснование необходимости использования методов молекулярно-генетического типирования при проведении эпидемиологического наблюдения за ИСМП 118
3.1 Staphylococcus aureus и Acinetobacter baumannii как актуальные возбудители ИСМП в условиях современного мегаполиса 119
3.2 Востребованность методов молекулярно-генетического типирования в рутинной практике эпидемиологического наблюдения за ИСМП в стационарах 125
3.3 Оценка диагностических возможностей молекулярно-генетических методов внутривидового типирования при расследовании вспышек и в процессе эпидемиологического наблюдения за случаями ИСМП 130
3.3.1 Использование RAPD-генотипирования в рамках эпидемио логического наблюдения за ацинетобактерной инфекцией в
стационарах 131
3.3.2 Проспективное наблюдение за клональной структурой MRSA в крупных специализированных стационарах Санкт Петербурга 138
3.3.3 Изучение клональной структуры госпитальных популяций A. baumannii в ходе многоцентрового исследования 149
3.4 Оценка возможности распространения отдельных штаммов S. aureus и A. baumannii между отделениями медицинских организаций и между медицинскими организациями 158
3.5 Генетическая гетерогенность госпитальных популяций возбудителей ИСМП 163
ГЛАВА 4 Эпидемические клоны acinetobacter baumannii и staphylococcus aureus: распространенность и эпидемиологическое значение 191
4.1 Результаты молекулярно-генетического типирования госпитальных и негоспитальных штаммов Staphylococcus aureus 191
4.2 Результаты молекулярно-генетического типирования госпитальных штаммов Acinetobacter baumannii 198
ГЛАВА 5 Роль рекомбинационной и мутационной изменчивости в эволюции эпидемических генотипов A. Baumannii и S. Aureus 204
5.1 Эпидемиологическое значение некоторых мобильных и
мобилизуемых генетических элементов 205
5.1.1 Оперон pgaABCD-полиморфизм и возможность горизонтального
генетического переноса от других микроорганизмов 205
5.1.2 Интегроны I класса 209
5.2 Мутационная изменчивость S. aureus и потенциальная роль мутаторного фенотипа в адаптации стафилококков к факторам госпитальной среды 231
Глава 6 Полногеномное секвенирование как инструментэпидемиологического наблюдения за возбудителями ИСМП 236
6.1 Полногеномное секвенирование штамма A. baumannii 60 Perm 237
6.2 Мозаичный характер генома штамма Acinetobacter baumannii как иллюстрация глобализации распространения мобильных генетических элементов 246
6.3 Значение методов полногеномного секвенирования в структуре эпидемиологического надзора за возбудителями инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи 249
ГЛАВА 7 Концепция молекулярно-генетического мониторинга в системе эпидемиологического надзора за ИСМП 274
Заключение 280
Выводы 286
Практические рекомендации 289
Перспективы дальнейшей разработки темы исследования 290
Список сокращений 291
Список литературы
- Генетическая гетерогенность госпитальных популяций актуальных возбудителей инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи и значение горизонтального генетического обмена в формировании госпитальных штаммов
- Востребованность методов молекулярно-генетического типирования в рутинной практике эпидемиологического наблюдения за ИСМП в стационарах
- Результаты молекулярно-генетического типирования госпитальных штаммов Acinetobacter baumannii
- Мозаичный характер генома штамма Acinetobacter baumannii как иллюстрация глобализации распространения мобильных генетических элементов
Введение к работе
Актуальность темы исследования
К числу глобальных вызовов, с которыми столкнулось человечество в XX столетии, относится широкое распространение устойчивости возбудителей инфекционных заболеваний к лекарственным препаратам [Antimicrobial resistance: global report on surveillance. World Health Organization, 2014], что наиболее ярко проявляется в отношении возбудителей инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи (ИСМП).
ИСМП поражают 5–10% пациентов, находящихся в стационарах, в том числе не менее половины пациентов отделений реанимации и интенсивной терапии [Vincent JL, Rello J, Marshall J, et al. 2009].
Медицинское и социальное значение данной группы заболеваний чрезвычайно велико, так например, лишь с одним из представителей данной группы инфекций – метициллинрезистентным Staphylococcus aureus (MRSA) в США связано около 19 000 смертей ежегодно, что существенно превышает число лиц, погибающих от ВИЧ-инфекции [Klevens R.M., Morrison M.A., Nadle J., et al., 2007].
В России по данным официальной статистики ежегодно регистрируется примерно 30 тыс. случаев ИСМП (что составляет примерно 0,8 на 1 000 пациентов), однако экспертные оценки, основанные на экстраполяции данных статистики зарубежных стран, в частности США, показывают, что их истинное число составляет не менее 2–2,5 млн человек [Покровский В.И., Семина Н.А., Ковалева Е.П., 2006].
Неоднократно отмечался глобальный характер распространения детерминант резистентности к антимикробным препаратам, при этом значительную угрозу представляет возможность выноса за пределы стационаров и распространения в обществе устойчивых к антимикробным препаратам микроорганизмов или генетических структур, содержащих гены антибиотикорезистентности [Otto M., 2013; Pi-tout J.D., 2013]. Госпитальная среда в данном контексте рассматривается как своеобразный «плавильный котел», в котором формируются новые вирулентные и устойчивые к антимикробным препаратам штаммы возбудителей инфекционных заболеваний [Зуева Л.П., Яфаев Р.Х., 2005]. Данное обстоятельство позволяет поставить вопрос о необходимости слежения за госпитальными популяциями условно-патогенных микроорганизмов с целью прогнозирования формирования и распространения новых мультиантибиотикорезистентных эпидемических клонов.
Востребованность слежения за клональной структурой популяций возбудителей ИСМП обусловлена также необходимостью быстрого реагирования на эпидемические вспышки, обусловленные «госпитальными» штаммами, сформировавшимися в стационарах и штаммами, заносимыми в стационары из других медицинских организаций.
Однако теоретические основы проведения подобного мониторинга в системе эпидемиологического надзора за ИСМП не разработаны, в частности не определены принципы рационального использования методов молекулярно-
генетического типирования возбудителей данных инфекций в различных эпидемических ситуациях.
Настоящая работа посвящена разработке системы молекулярно-
генетического мониторинга за инфекциями, обусловленными двумя типичными нозокомиальными патогенами – Staphylococcus aureus и Acinetobacter baumannii. Интенсивная циркуляция данных возбудителей в стационарах различного профиля, многообразие клинических форм инфекций, склонность к клональному распространению делает инфекции, обусловленные этими микроорганизмами, удобными моделями для изучения закономерностей эпидемического процесса ИСМП и позволяет рассчитывать на возможность экстраполяции полученных результатов на госпитальные инфекции, обусловленные другими возбудителями.
Оценивая медико-социальную значимость инфекций ацинетобактерной и стафилококковой этиологии, необходимо отметить их лидирующую роль в структуре ИСМП в современный период. Так, по данным многоцентровых исследований, Staphylococcus aureus является ведущим возбудителем внутрибольнич-ных инфекций в России и зарубежом, при этом наибольшую опасность представляет распространение метициллин-резистентных штаммов золотистого стафилококка (MRSA), частота которых в отдельных стационарах в России достигает 78 % [Jones M.E., 2004, Сидоренко С.В., 2004; Dekhnich A. et al., 2011].
В число ведущих грамотрицательных возбудителей ИСМП на территории России входит также Acinetobacter baumannii [Мартинович А.А., Эйдельш-тейн М.В., 2014]. Отмечено, что частота внутрибольничных ацинетобактерных инфекций растет во всем мире. Так, если в 80-ые годы прошлого столетия регистрировались единичные случаи заболеваний, вызванных ацинетобактерами, то к настоящему времени бактерии этой группы являются причиной до 10% внутри-больничных инфекций. [Harngbeger H. et al., 1999]. Необходимо отметить, что инфекции, обусловленные данным возбудителем, характеризуются высокой летальностью, достигающей 75% при сепсисе [Lizaso D. et al., 2008].
Очевидно, что противоэпидемические и профилактические мероприятия в отношении инфекций, обусловленных MRSA и Acinetobacter baumannii должны основываться на оценке популяционной структуры данных возбудителей, в частности, необходимо, чтобы применяемые вмешательства были эффективны в отношении госпитальных и эпидемических штаммов (клонов), что определяет актуальность темы настоящего исследования.
Степень разработанности темы исследования
В настоящее время в отношении большинства возбудителей внутриболь-ничных инфекций, включая перечисленные выше микроорганизмы, установлен факт их клонального распространения в стационарах отдельных географических регионов и целых континентов.
Так, например, с помощью различных молекулярно-генетических методов типирования установлено, что в отличие от метициллинчувствительных S.aureus, подавляющее большинство клинических изолятов метициллинрезистентных стафилококков (MRSA) принадлежат к ограниченному числу генетических линий или клонов. Использование для типирования метода секвенирования внутренних
фрагментов 7 «housekeeping» генов (метод мультилокусного секвенирования – MLST), позволило установить принадлежность этих клонов всего лишь к 5 филогенетическим линиям или клональным комплексам: CC5, CC8, CC22, CC30, CC45. Наиболее диверсифицированными являются клональные комплексы CC8/239 и CC5, которые содержат различные эпидемические штаммы и клоны, такие как «архаичный» эпидемический клон (ST8), португало-бразильский эпидемический клон (MLST тип 239), иберийский (MLST тип 247), японо-американский (MLST тип 5) и другие. В стационарах России ранее было выявлено эпидемическое распространение штаммов MRSA, генетически родственных EMRSA-1 (бразильскому клону), португало-бразильскому и иберийскому клонам [Дмитриенко О.А. и соавт., 2008].
В мировой литературе также описаны эпидемические клоны A. baumannii [Koeleman J.G.M., Stoof J., van der Bijl M.W. et al., 2001; Lolans K., Rice T.W., Munoz-Price L.S., Quinn J.P., 2006]. Так, например, зафиксирована вспышка ацинетобактерной инфекции, обусловленная одним клоном карбапенем-устойчивого A. baumannii, охватившая в период с июля по сентябрь 1999 года 15 нью-йоркских госпиталей. [Landman D., Quale J.M., Mayorga D., 2002]. Межгоспитальный перенос полиантибиотикорезистентных ацинетобактеров зафиксирован в Сан-Пауло (Бразилия) и Йоханнесбурге (ЮАР) [Marais E., de Jong G., Fer-raz V. et al., 1996].
Использование комбинации генотипических методов (AFLP-анализ и пульс-электрофорез) позволило выявить эпидемическое распространение в стационарах Зарубежной Европы и Северной Африки всего лишь трех клонов поли-антибиотикорезистентного ацинетобактера, вызывающих эпидемические вспышки. [Nemec A., Janda L., Melter O. & Dijkshoorn L., 1999; van Dessel H., Dijks-hoorn L., van der Reijden T., Bakker, 2003]. Для этих трех клонов выявлена определенная географическая приуроченность: если клон 1 встречается в скандинавских странах, а также Польше, Италии, Южной Африке, клон 2 был выявлен только на юге Европы (Испания, Португалия, Турция) и в Южной Африке, клон 3 был найден в Нидерландах, Франции и Испании. Эпидемические клоны ацинето-бактера обнаруживались также в России. В частности, эпидемический клон данного возбудителя был идентифицирован при генетическом типировании методом RAPD-ПЦР в сочетании с ПДРФ-ПЦР анализом вариабельного участка интегрона I класса в стационарах географически удаленных регионов РФ (СПб и Краснодар), [Соломенный А.П., Яфаев Р.Х., Гончаров А.Е., 2005, 2007].
Таким образом, на сегодняшний день, имеются основания для предположения о широкой циркуляции в госпитальных условиях эпидемических штаммов золотистого стафилококка и ацинетобактера, что обуславливает необходимость внедрения методов оценки клональной структуры госпитальных популяций этих микроорганизмов в системе эпидемиологического надзора за ними. Данная система, на наш взгляд, должна учитывать возможность микроэволюционных изменений возбудителей, происходящих в ходе их внутрибольничного и межбольничного распространения.
Наиболее доступной для анализа характеристикой популяции возбудителя, отражающей ее микроэволюционные изменения, является частота идентифика-
ции в ней штаммов, обладающих факторами патогенности, ассоциированными с возможностью реализации эпидемического потенциала. Многочисленные эпидемиологические исследования зафиксировали факты изменения вирулентности популяции возбудителя на протяжении эпидемического цикла (острой или хронической эпидемической вспышки). Так, например, В.Д. Беляковым (1975) описано быстрое повышение вирулентности популяции Streptococcus pyogenes при распространении в организованных коллективах. Последующие исследования [Beres B., Sylva G.L., Sturdevant D.E. et al., 2004] позволили предположить, что переход к эпидемическому распространению происходит у стрептококка группы А серотипа М3 при накоплении мутаций в гене, кодирующем М-белок.
Основанная на эпидемиологических наблюдениях теория саморегуляции паразитарных систем [Беляков В.Д., Голубев Д.Б., Каминский Г.Д., Тец В.В., 1987] постулирует возможность направленной самоперестройки гетерогенной популяции паразита в ходе эпидемического процесса, сопровождающейся изменениями вирулентности. Применительно к некоторым условно-патогенным микроорганизмам – возбудителям внутрибольничных инфекций (Pseudomonas aeruginosa, Serratia marscescens) изменения вирулентности в ходе эпидемической вспышки были описаны [Зуева Л.П., 1984, Любимова А.В., Зуева Л.П., 2004], однако молекулярные события, лежащие в основе таких изменений, практически не изучались. В то же время, увеличение степени вирулентности, очевидно, отражает процесс отбора более вирулентных субпопуляций из изначально гетерогенной популяции возбудителя. Показано, например, что значительный рост числа инва-зивных стафилококковых инфекций кровотока в центральном регионе Франции в 2006 году связан с увеличением доли штаммов, несущих ген белка токсического шока (tst) [Van der Mee–Marquet N. et al., 2007].
В связи с данной проблемой активно изучается роль горизонтального генетического обмена, широко распространенного в госпитальных популяциях возбудителей внутрибольничных инфекций [Dzidic S. et al, 2003].
Предполагается, что эволюционно успешные (в т.ч. эпидемические) варианты условно-патогенных микроорганизмов содержат участки генома с генами вирулентности, которые являются мобильными генетическими элементами (МГЭ) и могут передаваться от одного штамма к другому. Данные генетические элементы, называемые «островами патогенности», имеются, в том числе у эпидемических клонов стафилококков. Для S. aureus в базе данных PAI DB ) представлен 61 аллельный вариант островов патогенно-сти, несущих многочисленные гены суперантигенов (sea-seq), лейкоцидинов, гемолизинов и других факторов патогенности.
Анализ результатов полногеномного секвенирования по GC – составу, частоте содержания кодонов и динуклеотидов, позволил отнести 28 регионов хромосомы клинически значимого штамма A. baumannii ATCC 17978 к вероятным геномным островам. В дальнейшем [Smith M.G., Gianoulis T.A., Pukatzki S., et al., 2007] на экспериментальных моделях было показано, что 16 участков – геномных островов, действительно имеют значение в реализации патогенных свойств ацинетобактера. Данные геномные острова, обладающие свойствами островов патогенности, идентифицированы также в геноме эпидемического штамма
A. baumannii ACICU отнесенного к паневропейскому клональному комплексу II [Iacono M. et al., 2008] .
Таким образом, геномы клинически значимых штаммов A. baumannii и S. aureus содержат многочисленные участки, связанные с вирулентностью.
Учитывая, что вирулентные характеристики возбудителей инфекционных заболеваний нередко сопряжены со способностью к реализации механизма передачи (т.е. связаны с контагиозностью), представлялось важным в рамках данного исследования оценить эпидемиологическое значение штаммов указанных возбудителей, обладающих различным набором факторов патогенности. Кроме того, исследования были направлены на изучение потенциального эпидемиологического значения других факторов, определяющих геномный полиморфизм A. baumannii и S. aureus. В частности, оценивались частоты обнаружения штаммов, несущих интегроны I класса. Данная группа мобилизуемых генетических элементов представляет собой природные устройства для захвата и переноса генных кассет, содержащих гены устойчивости к антимикробным препаратам [Domingues S., da Silva G.J., Nielsen K.M., 2015; Ploy M.C., Lambert T., Couty J.P., Denis F., 2000].
Цель: разработать новый компонент системы эпидемиологического надзора за внутрибольничными инфекциями на локальном, региональном и глобальном уровнях – молекулярно-генетический мониторинг за эпидемическими клонами Acinetobacter baumannii и Staphylococcus aureus.
Задачи:
-
Оценить клональную структуру штаммов S. aureus, A. baumannii, вызывающих случаи внутрибольничных инфекций в лечебно-профилактических учреждениях, методами молекулярно-генетического типирования.
-
Оценить масштабы распространения отдельных филогенетических линий исследуемых бактерий, циркулирующих в российских стационарах.
-
Провести анализ распространенности и эпидемиологической значимости штаммов исследуемых бактерий, имеющих мобильные генетические элементы (острова патогенности, интегроны I класса), оценить распространенность штаммов S. aureus с повышенной частотой мутаций.
-
Предложить тактику применения методов генотипирования S. aureus, A. baumannii для идентификации эпидемических клонов в системе эпидемиологического надзора на локальном, региональном и глобальном уровнях.
-
Обосновать целесообразность применения метода полногеномного се-квенирования в структуре эпидемиологического надзора за возбудителями инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи.
Научная новизна
Разработана стратегия применения методов молекулярно-генетического типирования возбудителей инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи, в различных эпидемических ситуациях и предложена концепция молекулярно-генетического мониторинга в системе эпидемиологического надзора за но-зокомиальными инфекциями на локальном, региональном и национальном (глобальном) уровнях.
Выявлены наиболее распространенные в российских стационарах филогенетические линии (международные эпидемические клоны) Staphylococcus aureus и Acinetobacter baumannii а также получены новые данные, характеризующие эпидемиологическую значимость международных эпидемических клонов данных патогенов.
Установлено, что для представителей международных эпидемических клонов изучаемых микроорганизмов характерно наличие определенных островов па-тогенности (SAPI1, vSa и vSa у эпидемических MRSA и островов патогенно-сти, ассоциированных с геном ацинетобактина basI и геном калиций-зависимого гемолизина-токсина rtx у эпидемических клонов ацинетобактера).
Установлено, что длительно персистирующие в стационарах эпидемические клональные линии Acinetobacter baumannii, как правило, представлены штаммами, несущими в составе генома интегроны I класса.
Впервые проведено полногеномное секвенирование и аннотирование генома российского эпидемического штамма Acinetobacter baumannii клональной линии II и раскрыты особенности его генотипа, определяющие патогенный и эпидемический потенциал.
Теоретическая и практическая значимость работы
Теоретическая значимость работы связана с получением новых данных о структуре госпитальных популяций Staphylococcus aureus и Acinetobacter bau-mannii, представляющих ценность для использования в системе эпидемиологического надзора за данными возбудителями. В результате сопоставления особенностей генетической структуры популяций Staphylococcus aureus и Acinetobacter baumannii циркулирующих в стационарах на обширной географической территории сформировано представление о генетических особенностях, которыми обладают высококонтагиозные возбудители инфекций, связанные с оказанием медицинской помощи. К таким особенностям можно отнести ярко выраженную кло-нальную структуру их популяций, а также наличие способности к реализации вирулентных свойств наряду с возможностью накопления резистома, высокую адаптивную способность за счет рекомбинационных и мутационных генетических преобразований.
Получены данные, подтверждающие предположение о том, что эволюция эпидемических клонов условно-патогенных микроорганизмов идет в направлении оптимизации организации генома, включая тонкую настройку механизмов реализации патогенного генотипа за счет изменения структуры островов пато-генности, а также отбора штаммов с повышенной частотой мутаций.
Данные о геномном полиморфизме, затрагивающем отдельные гены факторов патогенности, использованы в практических целях, в частности предложены способы идентификации генотипов, свойственных госпитальным штаммам. Данные практические решения реализованы в изобретениях: «Способ выявления госпитальных штаммов» (патент RU 2404254, 20.07.2010), «Способ определения генотипов золотистого стафилококка» (патент RU 252649, 20.08.2014).
Разработана стратегия применения методов молекулярно-генетического ти-пирования возбудителей инфекций, связанных с оказанием медицинской помо-
щи, в различных эпидемических ситуациях и предложена концепция молекулярно-генетического мониторинга в системе эпидемиологического надзора за нозо-комиальными инфекциями на локальном, региональном и национальном (глобальном) уровне.
Нуклеотидная последовательность генома карбапенем-резистентного штамма A. baumannii Perm, отнесенного ко II пандемической клональной линии, размещена в международной базе Genbank (GenBank Acc. № ). В GenBank также депонированы последовательности геномов штамма A. baumannii 28 (GenBank Acc. № MAFT00000000), Acinetobacter lwoffii 51m (Acc. № LZDF00000000), Serratia liquefaciens 72 (Acc. № MQRG00000000), Serratia fonti-cola 5l (Acc. № MQRH00000000), Serratia marcescens subsp. marcescens 99 (Acc. № MQRI00000000), Serratia marcescens subsp. marcescens 189 (Acc. № MQRJ00000000), Enterococcus faecium strain 4686 (Acc. № MQRF00000000), фрагментов 16S ДНК штаммов Psychrobacter faecalis 90 и 97 под номерами KJ398192 и KJ398193, соответственно.
Методология и методы исследования
В работе применен комплекс эпидемиологических, микробиологических и молекулярно-генетических методов. Эпидемиологический метод включил в себя проспективное эпидемиологическое наблюдение за ИСМП, обусловленными S. aureus и A. baumannii в нескольких лечебно-профилактических учреждениях, характеризовавшихся высоким риском перекрестного инфицирования пациентов (два травматологических и ожоговый стационар).
Кроме того, в 2007–2013 годах было проведено многоцентровое исследование, направленное на изучение клональной структуры данных микроорганизмов в лечебно-профилактических учреждениях ряда регионов России и Казахстана. В данное исследование были включены культуры микроорганизмов, выделенных микробиологическими лабораториями 25 лечебно-профилактических учреждений 11 регионов России и Казахстана в течение 2005–2011 годов. В общей сложности было изучено 1177 культур.
В рамках настоящего исследования было также изучено несколько штаммов бактерий семейства Moraxellaceae, к которому в настоящее время относится род Acinetobacter , в частности штамм Acinetobacter lwoffii 51m, выделенный при исследовании палеонтологического материала (туша шерстистого мамонта (Mammuthus primigenius)) и два штамма Psychrobacter faecalis из орнитогенного местообитания на побережье Антарктиды. Кроме того, в работе проведен сравнительный геномный анализ геномов нескольких природных штаммов условно-патогенных микроорганизмов, также впервые секвенированных и аннотированных. В частности, секвенирован геном штамма Serratia fonticola str. 5l (выделен из туши ископаемого «омолойского» лося (Alces alces)), Serratia plymutica str.tumat (выделен из туши щенка периода плейстоцена), Serratia liquefaciens 72 (выделен из биосубстрата колонии пингвинов Адели на острове Токарева в Антарктиде). Помимо природных штаммов полногеномному секвенированию подверглись также госпитальные штаммы Serratia marcescens subsp. marcescens
(99,189,716) и ванкомицин-резистентный эпидемический штамм Enterococcus faecium 4686.
Положения, выносимые на защиту:
-
Применение в системе эпидемиологического надзора за инфекциями, связанными с оказанием медицинской помощи, комплексного молекулярно-генетического мониторинга, включающего в себя использование методов быстрого внутривидового типирования, основанных на полимеразной цепной реакции, позволяет наиболее эффективным образом устанавливать эпизоды внутри-госпитального и межгоспитального распространения возбудителей внутриболь-ничных инфекций.
-
Эпидемические клоны MRSA и Acinetobacter baumannii, в основном, представлены штаммами, содержащими мобильные генетические элементы, связанные с реализацией патогенного потенциала (острова патогенности, интегроны I класса). Идентификация вариабельных участков данных генетических структур может быть использована в качестве генетического маркера в системе эпидемиологического наблюдения за циркуляцией госпитальных штаммов S. aureus и A. baumannii.
-
Полногеномное секвенирование в системе молекулярно-генетического мониторинга за ИСМП может быть использовано для эффективной оценки патогенного потенциала и резистома изолятов, представляющих госпитальные штаммы и эпидемические клоны, выявления филогенетических связей между эпидемическими клонами, циркулирующими в различных географических регионах.
Степень достоверности результатов исследования
Достоверность полученных результатов обусловлена системным подходом с применением современных эпидемиологических, микробиологических, молекулярно-генетических и статистических методов, обширностью и разнообразием репрезентативного материала, полученным за длительный период и включающим результаты эпидемиологического наблюдения за 1177 пациентами с внутриболь-ничными инфекциями различной этиологии, высокой чувствительностью и специфичностью использованных молекулярно-генетических методов исследования (ПЦР, секвенирование, электрофорез в пульсирующем поле, секвенирование нового поколения), использованием современных электронных баз данных молекулярно-генетического типирования (mlst.net, spa-server), а также баз данных нук-леотидных последовательностей DDBJ/EMBL/GenBank .
Апробация результатов исследования
Основные положения диссертационной работы были представлены на научных конференциях и симпозиумах международного и всероссийского уровня, в частности, на следующих мероприятиях:
6-м международном симпозиуме биологии Acinetobacter (6th International Symposium on the Biology of Acinetobacter) (Dublin, Ireland, 2004); 7-м международном симпозиуме биологии Acinetobacter (7th International Symposium on the. Biology of. Acinetobacter) (Barcelona, Spain, 2006), 7-м Северо-Балтийском Международном конгрессе по инфекционным заболеваниям (7th Nordic-Baltic Congress
on Infectious Diseases) «Current Challenges and New Opportunities» (Riga, Latvia, 2006); 8-м Северо-Балтийском Международном конгрессе по инфекционным заболеваниям (7th Nordic-Baltic Congress on Infectious Diseases) «Well-Known Infections» (Санкт-Петербург, 2008), Всероссийской научно-практической конференции «Инфекционные осложнения при иммунодепрессиях» (Санкт-Петербург, 2010), XII Международном конгрессе по антимикробной терапии (Москва, 2010); региональном заседании Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов, иммунологов и паразитологов (Санкт-Петербург, 2010), I Всероссийской с международным участием школе-конференции молодых ученых «Современные проблемы микробиологии, иммунологии и биотехнологии» (Пермь, 2011); Международном совещании по борьбе с новыми болезнями и их надзору (International Meeting on Emerging Diseases and Surveillance) (IMED 2011) (Vienna, Austria, 2011); XIII-м Международном конгрессе по бактериологии и прикладной микробиологии (XIII International Congress of Bacteriology and Applied Microbiology) “The Unlimited The World of Microbes” IUMS 2011 (Sapporo, Japan, 2011); 15-м Международном конгрессе по инфекционным заболеваниям (15th International Congress on Infectious diseases) (Таиланд, Бангкок, 2012); Всероссийской научно-практической конференции по медицинской микробиологии и клинической микологии (XV Каш-кинские чтения) (Санкт-Петербург, 2012); Международной конференции: "Руководство ВОЗ по практическому выполнению гигиены рук в Балтийском регионе" (BARN Hand Hygiene Conference WHO guidelines for Hand Hygiene Practical Implementation in the Baltic Region (Riga, Latvia, 2013); Всероссийской научно-практической конференции по медицинской микробиологии и клинической микологии (XVI Кашкинские чтения) (Санкт-Петербург, 2013); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Эпидемиология в XXI веке: новые горизонты профилактики» (Кемерово 2013); IV конгрессе с международным участием «Экология и здоровье человека на Севере» (Якутск, 2013); III международном конгрессе по профилактике инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи ( Москва, 2013); Всероссийской научно-практической конференции по медицинской микробиологии и клинической микологии (XVII Кашкинские чтения) (Санкт-Петербург, 2014); III Санкт-Петербургском международном экологическом форуме "Окружающая среда и здоровье человека: фундаментальные, клинические и экологические аспекты современной микробиологии" (Санкт-Петербург, 2004); Всероссийской научно-практической конференции специалистов по контролю инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи, с международным участием (Москва, 2014); III Российском конгрессе с международным участием "Молекулярные основы клинической медицины - возможное и реальное", посвященного 75-летию со дня рождения Е.И. Шварца (Санкт-Петербург, 2015); 25-м Европейском конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным болезням (25th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases) (Copenhagen, Denmark, 2015); Российско-китайской научно-практической конференции по медицинской микробиологии и клинической микологии (XVIII Кашкинские чтения), (Санкт-Петербург, 2015); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Контроль и профилактика инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи» (Москва, 2015); 5-м Международном семинаре (The 5th Baltic
Antibiotic Resistance collaborative Network Workshop) «Planning for the future of the BARN Network» (2015);
Научно-практической конференции «Актуальные вопросы клинической микробиологии» в рамках VI Конгресса с международным участием "Экология и здоровье человека на Севере" (Якутск, 2015); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Здоровье медицинского персонала и обеспечение эпидемиологической безопасности медицинской деятельности», НАСКИ 2016 (Омск, 2016); Российско-китайской научно-практической конференции по медицинской микробиологии и клинической микологии (XIX Кашкинские чтения) (Санкт-Петербург, 2016); Ежегодной Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Обеспечение эпидемиологической безопасности и профилактика инфекций в хирургии» (Казань, 2016).
Результаты диссертационной работы внедрены и реализованы:
– при разработке методических документов: федеральных клинических рекомендаций (Гончаров А.Е. Молекулярно-генетический мониторинг в системе эпидемиологического надзора за инфекциями, связанными с оказанием медицинской помощи: федеральные клинические рекомендации / А.Е. Гончаров, Л.П. Зуева, В.В. Колоджиева, Л.А. Кафтырева, С.А. Егорова, М.А. Макарова. – Нижний Новгород : Ремедиум Приволжье, 2016. – 48 с. Согласованы профильной комиссией Минздрава России по эпидемиологии 20 ноября 2014 г., протокол № 4). Утверждены на общем собрании членов некоммерческого партнерства «Национальная ассоциация специалистов по контролю инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи» (НП «НАСКИ») 19.11.2014 (Протокол №6)).
– при подготовке учебных пособий: Зуева Л.П. Введение в молекулярную эпидемиологию инфекционных заболеваний: учебное пособие / Л.П. Зуева, А.Е. Гончаров, О.В. Нарвская. – СПб. : Изд-во СЗГМУ им. И.И. Мечникова, 2013. – 88 с., утверждено в качестве учебного пособия методическим советом СЗГМУ им. И.И. Мечникова; Госпитальная эпидемиология. Руководство к практическим занятиям : учеб. пособие / под ред. Л.П. Зуевой. – М. : ГЭОТАР-Медиа, 2015. – 416 с., рекомендовано в качестве учебного пособия ГБОУ ВПО «Первый Московский государственный медицинский университет им И.М. Сеченова»
– в системе додипломной и последипломной подготовки на кафедре эпидемиологии, паразитологии и дезинфектологии ФГБОУ ВО «Северо-Западный государственный медицинский университет имени И.И. Мечникова» Министерства здравоохранения Российской Федерации (191015, Санкт-Петербург, ул. Ки-рочная, д. 41, тел: (812) 303-50-00) (Акт внедрения от 30.12.2016 г.);
– в практической деятельности: при разработке нового биопрепарата «Ди-фаг», обладающего широким антибактериальным спектром в отношении инфекций, вызванных Acinetobecter baumannii и Pseudomonas aeruginosa (Акт внедрения ФГУП НПО «Микроген» Минздрава России от 28.10.2015 г.).
– при выполнении государственного контракта № 16.740.11.0348 от 07 октября 2010 г по теме: "Молекулярная эпидемиология Acinetobacter baumannii и разработка теоретических основ эпидемиологического надзора за ацинетобактерной инфекцией", государственного контракта №8157 по теме «Молекулярная эпидемиология инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи, распростра-
ненных среди коренного населения Крайнего Севера России», гранта Российского фонда фундаментальных исследований 12-04-31195 по теме: «Острова пато-генности популяций Staphylococcus aureus из географически удаленных регионов Евразии».
Апробация диссертационной работы проведена на совместном совещании кафедры эпидемиологии, паразитологии и дезинфектологии ФГБОУ ВО «СевероЗападный государственный медицинский университет имени И.И. Мечникова» Минздрава России и отдела молекулярной микробиологии ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины» (протокол совещания № 12 от 22 декабря 2016 г.).
Организация и проведение диссертационного исследования одобрены Комитетом по вопросам этики при ФГБОУ ВО «Северо-Западный государственный медицинский университет имени И.И. Мечникова» Минздрава России (протокол №6 от 14.06.2016 г.).
По материалам диссертации опубликовано 46 печатных работ, в том числе 32 статьи в рецензируемых научных журналах, входящих в перечень ВАК Мино-брнауки России, получено два патента на изобретения.
Личное участие автора в получении результатов
Автором лично выполнено планирование и организация всех эпидемиологических микробиологических и молекулярно-генетических исследований, проведены эпидемиологические расследования отдельных случаев и вспышек инфекций в стационарах, осуществлены обработка и анализ данных, разработка методических документов. Самостоятельно проведено большинство лабораторных исследований, статистическая обработка материалов, анализ и интерпретация полученных результатов. Идентификация интегронов I класса осуществлялась совместно с к.б.н. с.н.с. А.П. Соломенным (Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН). Расследование вспышки ацинетобактерной инфекции в отделении реанимации новорожденных проводилось совместно с д.м.н. проф. А.В. Любимовой (ФГБОУ ВО СЗГМУ им. И.И. Мечникова Минздрава России).
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 323 страницах машинописного текста, состоит из введения, главы обзора литературы, главы материалов и методов, пяти глав собственных исследований, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, который включает 218 наименований, в том числе 62 работу отечественных и 156 зарубежных авторов. Работа содержит 56 таблиц, иллюстрирована 28 рисунками и 5 приложениями.
Генетическая гетерогенность госпитальных популяций актуальных возбудителей инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи и значение горизонтального генетического обмена в формировании госпитальных штаммов
Генетическое типирование микроорганизмов прочно вошло в общемировую эпидемиологическую практику в качестве наиболее достоверного и воспроизводимого варианта внутривидового типирования, позволяющего выявить эпидемиологические связи, оценить значимость различных источников инфекции. Вместе с тем, представляется привлекательным использование методов молекулярно-генетического типирования для изучения перестроек клональной структуры популяции возбудителя, соответствующих различным проявлениям эпидеми 26 ческого процесса. К настоящему времени прогностическая ценность монитори-рования изменений генетической структуры популяции возбудителя, несомненна, что отражено, в частности, в положениях теории саморегуляции паразитарных систем [44,53]. Изменения генотипа возбудителя в ходе локальных вспышек были отмечены ранее [115].
Удобной моделью для изучения взаимосвязи между клональной структурой популяции микроорганизмов и характеристиками эпидемического процесса представляется госпитальная экосистема [60], в которой, ввиду складывающихся в стационарах специфических условий (концентрация в одном месте иммуно-компромиссных пациентов, интенсивное перекрестное инфицирование, широкое использование антибиотиков), можно предположить наибольшую интенсивность формирования новых генетических вариантов возбудителей.
В отношении возбудителей госпитальных инфекций представляется важным вопрос о том, наблюдаются ли какие-либо изменения в генетической структуре популяции в ходе локальной вспышки, вызванной одним штаммом, занесенным в стационар.
В ряде исследований, обзор которых приведен в публикации [18], зафиксирована подобная внутриклональная изменчивость. Так, например, в процессе исследования клинических изолятов метициллин-резистентных стафилококков (далее MRSA) было выявлено большое разнообразие пульс-электротипов и подтипов, циркулирующих в стационарах. Показано, что среди 183 изолятов единственного эпидемического штамма, определенного методом пульсэлектрофореза («штамм А») из 8 португальских больниц, было выявлено 28 подтипов [79]. Подобный феномен наблюдался и в одной из барселонских больниц, в которой штамм, обусловивший вспышку, «генерировал» восемь отличных друг от друга подтипов. Данный феномен удавалось наблюдать только in vivo, поскольку изучаемые культуры стафилококков, сохраняли свой пульсэлектротип после астрономически большого числа делений in vitro при пассировании на неселективных средах. [196]. Молекулярная природа подобной внутриклональной изменчивости в нстоящее время неизвестна. По-видимому, изменения паттернов пульс 27 электрофореза подразумевают приобретение или потерю продолжительных участков ДНК (например, при встраивании или потери транспозонов или умеренных бактериофагов). Установлено, что эти события происходят в эпидемически «спокойный» период эпидемического процесса, в частности в спокойные периоды хронических эпидемий, когда отмечена наибольшая генетическая гетерогенность бактериальной популяции. Данные ситуации контрастируют с появлением одиночных доминирующих клонов при острых вспышках. [161]. Таким образом, в отношении госпитальной стафилококковой инфекции мы наблюдаем чередование периодов повышенной генетической гетерогенности с периодами клонально-го распространения.
При использовании для анализа эволюционных изменений генома мети-циллин-резистентного стафилококка комбинации двух методов генотипирова-ния: пульс-электрофореза и метода RAPD – ПЦР [111] было установлено, что локальные вспышки стафилококковой инфекции обусловлены субклональными изменениями, когда внутри одного пульс-электротипа отмечается генерация вариантов, различающихся по профилю RAPD-типирования, при этом различия между штаммами, вызвавшими локальные вспышки в различных стационарах более существенны и могут быть зафиксированы обеими методами типирования.
Таким образом, можно предположить, что изменения, наблюдаемые в ходе эпидемического процесса в бактериальной популяции, проявляются не только в изменении регуляции экспрессии генов вирулентности (т.е. изменении фенотипа), но и в серьезных генетических перестройках, что может быть зафиксировано с использованием таких методов генотипирования, как RAPD. Подобные геномные перестройки в бактериальных популяциях могут возникать вследствие горизонтального генетического обмена.
Генетическими элементами, с приобретением которых могут быть связаны изменения в эпидемиологии возбудителя, являются плазмиды, умеренные бактериофаги, IS-элементы и транспозоны.
В литературе описаны случаи, когда формирование локального вспышеч-ного вспышечного варианта возбудителя (госпитального или эпидемического штамма) происходило вследствие приобретения возбудителем дополнительной информации путем горизонтального генетического обмена, в том числе, между разными видами и родами микроорганизмов.
Несмотря на то, что биологическая роль плазмид, содержащих детерминанты устойчивости к антибактериальным препаратам, хорошо известна, исследований, в которых была бы зафиксирована передача плазмид в ходе эпидемического процесса «в режиме реального времени» немного.
В работе [216] описано 2 последовательные вспышки, произошедшие в реанимационном отделении стационара: хроническая, обусловленная Enterobacter cloacae и острая, вызванная Acinetobacter baumannii. В культурах обоих микроорганизмов была обнаружена одна и та же плазмида SHV-12, детерминирующая синтез -лактамазы расширенного спектра действия и определяющая устойчивость к цефалоспоринам и аминогликозидам, т.е. можно предположить, что формированию госпитального штамма ацинетобактер способствовал горизонтальный генетический обмен с приобретением плазмиды.
В другом исследовании [77] в качестве вероятной причины появления кар-бапенем-устойчивого штамма Klebsiella pneumonia в ходе локальной вспышки в реанимационном отделении указывадось встраивание в геном возбудителя ин-серционной вставки IS26, приведшее к выключению синтеза поринового белка OmpK36.
Возможная эпидемиологическая роль транспозонов была продемонстрирована на примере вспышки инфекции, обусловленной ванкомицин-резистентными энтерококками, охватившей 2 гематологических отделения (детское и взрослое) в многопрофильной больнице города Гданьска (Польша). Возникновение вспышки связывают с приобретением непатогенными штаммами энтерококков транспозо-на Tn1546, содержащего гены устойчивости к ванкомицину. Транспозон обнаруживался во вспышечных штаммах нескольких пульс-электротипов в различных генетических вариантах [144].
Востребованность методов молекулярно-генетического типирования в рутинной практике эпидемиологического наблюдения за ИСМП в стационарах
Идентификация интегронов I класса Наличие интегронов класса 1 показывали посредством амплификации вариабельного и 3 -консервативного сегментов [26,175] . Данные исследования проводились совместно с с.н.с. А.П. Соломенным в лаборатории водной микробиологии Института генетики и экологии микроорганизмов УрО РАН.
Молекулярно-генетическое типирование грамположительных бактерий методом ПЦР со «случайными» праймерами» (RAPD-ПЦР)
Генетическое типирование грамположительных микроорганизмов (Staphy-lococcus spp., Enterococcus spp.) проводили методом RAPD-ПЦР (Martin et al, 109 2005) [112] с использованием универсального праймера R5 (5 -AACGCGCAAC-3 ) в концентрации 50 пмоль/мкл. Идентификация клональных комплексов Acinetobacter baumannii Идентификация клональных комплексов Acinetobacter baumannii осу ществлялась методом мультиплексной ПЦР согласно [207]. Мультиплексное VNTR-типирование (MLVA) Acinetobacter baumannii Типирование ацинетобактеров методом MLVA проводили согласно условиям реакции и с использованием праймеров, предложенных C. Pourcel et al (2011) [136]. Процедура 454-пиросеквенирования геномов штаммов Acinetobacter baumannii Pеrm и 28, Staphylococcus aureus 1399 Для приготовления геномных библиотек использовали следующую процедуру выделения ДНК.
Бактериальные клетки осаждали центрифугированием, отмывали от питательной среды, осадок растворяли в Трис-глюкозном буфере (50 mM Трис-HCl, pH=7,5; 8% глюкозы). Клетки лизировали добавлением лизоцима (лизостафина при лизисе S.aureus) (1 мг/мл), EDTA до концентрации 10mM и SDS до 1%. Де-протеинизацию ДНК осуществляли с помощью протеиназы К (0,5 мг/мл). Затем ДНК обрабатывали фенолом, смесью фенола с хлороформом и хлороформом. К раствору, содержащему ДНК, добавляли 2 объема 96% этанола и осаждали центрифугированием при 15000 об/мин в течение 5 минут. Осадок ДНК растворяли в ТЕ буфере.
Приготовление библиотек случайных фрагментов ДНК (ShotGun) проводили по стандартному протоколу, предлагаемому производителем («454/Roche») c последующим секвенированием на приборе «GS Junior».
Штамм Acinetobacter baumannii 28 секвенирован сотрудниками лаборатории К.А. Мирошникова (Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН) на приборе «GS Junior».
Секвенирование геномов Serratia spp. и Enterococcus faecium str.4686
Секвенирование проводилось с использованием технологии Illumina на приборе MiSeq с использованием набора реагентов MiSeq Reagent Kit v2 для получения в среднем 50 кратного покрытия генома.
Библиотеку фрагментов ДНК готовили с использованием набора реагентов Illumina Nextera XT DNA Sample Prep Kit (Illumina, США) согласно инструкции производителя. Качество полученной библиотеки оценивали с помощью анализатора Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, США) и ПЦР в режиме реального времени согласно инструкции Sequencing Library qPCR Quantification Guide (Illumina). Ампликоны метили с использованием Nextera XT Index Kit (Illumina) согласно инструкции производителя. Секвенирование и последующее аннотирование генома штамма Enterococcus faecium str.4686 проводилось совместно с В.В. Колоджиевой.
Мультиплексное VNTR-типирование (MLVA) Staphylococcus aureus
Клональную принадлежность изучаемых культур определяли методом MLVA по 5 локусам с использованием праймеров, предложенных A. Sabat et al. (2003) [166], при этом амплификацию локусов clfA и clfB, spa и sspA проводили в мультиплексном формате, а локус sdrCDE амплифицировали отдельно.
Определение клональных комплексов Staphylococcus aureus
Для отнесения изучаемых штаммов Staphylococcus aureus к одной из шести широко распространенных филогенетических линий (СС8/239, СС5, СС1, СС45, СС22, СС30) использовали комбинацию из трех мультиплексных ПЦР с прайме-рами к участкам генов системы модификации-рестрикции hsdS1 и hsdS2, различающихся у штаммов различных клональных комплексов согласно методике, предложенной Cockfield JD et al. (2007) [181].
Электрофорез в пульсирующем поле
Электрофорез в пульсирующем электрическом поле проводили в лаборатории Шведского института контроля за инфекциями (SMI, Solna) совместно с Barbro Ols-son-Liljequist с использованием эндонуклеазы рестрикции SmaI согласно [126] по протоколу, единому для европейских лабораторий, участвующих в проекте HARMONY (http://www.harmony-microbe.net/). Результаты пульс-электрофореза сопоставляли с паттернами типирования, приведенными в международной базе данных проекта HARMONY (http://www.harmony-microbe.net/microtyping.htm).
Идентификация микроорганизмов методом секвенирования генов 16S рибосомального оперона
Для видовой идентификации микроорганизмов проводилось секвенирование амплифицированных фрагментов генов 16S rDNA с использованием праймеров fD1 (5 -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ) и rP2 (5 -ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3 ) согласно методике, предложенной W.G. Weisburg и соавт. (1991) [61]. Полученные при секвенировании последовательности были выравнены с использованием алгоритма BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), и сопоставлены с последовательностями имеющимися в GenBank, с использованием программы EZtaxon (http://www.ezbiocloud.net/eztaxon) .
Дизайн праймеров для полимеразной цепной реакции и секвенирова-ния фрагментов островов патогенности золотистого стафилококка
Последовательности пяти островов патогенности (SAPI1, SAPI2, SAPIbov1 vSa, vSa), представленные в базе данных GenBank на сайте National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank), были использованы для дизайна праймеров к фрагментам генов вирулентности, входящим в состав этих островов патогенности (таблица 5).
Результаты молекулярно-генетического типирования госпитальных штаммов Acinetobacter baumannii
В 10 из 14 медицинских организаций (71,43%) были выявлена циркуляция штаммов MRSA, охватывающая несколько отделений данных стационаров. В то же время, учитывая значительные уровни сочетанной резистентности к антибиотикам других фармакологических групп, наблюдаемых у российских MRSA [14], не представляется возможным определить с использованием антибиотико-типирования в качестве основного метода внутривидового типирования, локали-зованность эпидемических очагов в изучаемых стационарах и надежно установить эпидемические связи между случаями ИСМП, зарегистрированными в различных отделениях.
Таким образом, полученные данные позволяют заключить, что имеющаяся система эпидемиологического наблюдения за ИСМП ацинетобактерной и стафилококковой этиологии, основанная на анализе антибиотикограмм, является не достаточно эффективной и должна быть дополнена использованием методов внутривидового типирования с большей разрешающей способностью, из которых наиболее перспективными, с нашей точки зрения, являются методы молекулярно-генетического типирования. В связи с этим, дальнейшая часть исследований была направлена на разработку оптимального алгоритма применения методов молекулярно-генетического типирования в структуре эпидемиологического надзора за внутрибольничными инфекциями.
Необходимость быстрого принятия решений при оперативном анализе эпидемиологической ситуации в стационаре предполагает использование быстрых и экономически малозатратных методов молекулярно-генетического типирования, одним из которых является RAPD-генотипирование, примеры практического использования которого приведены в настоящей работе.
Оценка диагностических возможностей молекулярно-генетических методов внутривидового типирования при расследовании вспышек и в процессе эпидемиологического наблюдения за случаями ИСМП
Для доказательства существования эпидемиологических связей между источником инфекции, факторами передачи и последующими случаями заболеваний используют методы внутривидового типирования микроорганизмов. При этом исходят из предположения, что штаммы возбудителя, выделенные от источника инфекции, с объектов внешней среды, являющихся факторами передачи и от всех заболевших в очаге, связанных с источником инфекции, являются идентичными по своим биологическим свойствам (фенотипическим и генотипическим), в отличие от штаммов, не связанных с изучаемой эпидемической цепочкой.
В настоящее время, фенотипические (немолекулярные) методы типирова-ния считают слишком вариабельными, трудоемкими и медленными для успешного применения в эпидемиологической практике [147]. В то же время многообразие методов молекулярно-генетических методов, разработанных в настоящее время, достаточно велико, в связи с чем актуальным является вопрос о рациональном выборе метода генотипирования для практического использования при эпидемиологическом наблюдении за ИСМП в лечебно-профилактических организациях.
В настоящем исследовании мы использовали в качестве основного метода внутривидового типирования, применяемого для первичной кластеризации штаммов Acinetobacter baumannii, метод RAPD-генотипирования. В отдельных исследованиях [176, 149] показано, что данный метод практически не уступает по разрешающей способности пульс-электрофорезу, однако значительно превосходит его по простоте осуществления и скорости получения результатов. Для внутривидового типирования Staphylococcus aureus была использована методика мультилокусного VNTR – анализа (MLVA) [166]. Предпочтение этой методике было отдано в связи с тем, что в проведенных ранее исследованиях [87,210] показана ее высокая дискриминирующая способность, сопоставимая с таковой при применении пульс-электрофореза, в связи с чем она рекомендована для применения при расследовании вспышек внутрибольничных инфекций и слежения за внутри- и межгоспитальным распространением Staphylococcus aureus.
Ниже приведены некоторые примеры, демонстрирующие эффективность использования указанных методов генотипирования для решения практических задач, стоявших перед госпитальными эпидемиологами стационаров.
Метод RAPD-генотипирования неоднократно применялся нами для решения вопроса об отнесении выделенных в стационаре изолятов A. baumannii, к госпитальным штаммам, циркулирующим в пределах одного или нескольких отделений стационара.
В частности, RAPD-генотипирование случайной выборки из 6 культур ацинетобактеров, выделенных от пациентов многопрофильного стационара г. Калининграда в 2006–2007 гг. позволило выявить два значимых с эпидемиологической точки зрения факта: во-первых, на основании идентичности профилей RAPD-типирования (рисунок 2 и таблица 17) был установлен факт внутриболь-ничного инфицирования пациентов отделения реанимации и интенсивной терапии в июле 2007 года, во- вторых, в двух отделениях стационара (общей хирургии и челюстно-лицевой хирургии.) были выявлены изоляты, идентичные как по профилю RAPD-генотипирования, так и по чувствительности к антимикробным препаратам, на основании чего было предположено внутрибольничное распространение госпитального штамма ацинетобактера из отделения в отделение с переводимыми пациентами.
Мозаичный характер генома штамма Acinetobacter baumannii как иллюстрация глобализации распространения мобильных генетических элементов
Данный генотип появился в г. Санкт-Петербурге не позднее 2008 года, когда впервые штамм данного spa-сивенстипа был выявлен у пациента с ВИЧ-инфекцией [52,59]. В целом же, со spa-типами, ассоциируемыми с СС8 (t008, t024), связано не менее 70% всех изученных нами случаев нозокомиальных MRSA-инфекций.
Идентифицированные в г. Караганда и в г. Москве при вспышках внутри-больничной инфекции штаммы spa-сиквенстипа t030 обнаруживают филогенетическое родство штаммам клонального комплекса 239. Штаммы данного сиквен-стипа являются преобладающими в стационарах Китая [178]. Кроме того, ранее отмечалось, что российские штаммы MRSA данного spa-типа, циркулирующие на Дальнем Востоке представляют собой гибридные варианты генетического материала, полученные в результате генетического обмена штаммов клональных комплексов CC8/239 и CC30 [85].
Штаммы других эпидемических клональных комплексов встречались с меньшей частотой. Так, циркуляция штаммов spa-типа t041, филогенетически родственного эпидемическому клональному комплексу СС5, была обнаружена только в одном из стационаров Санкт-Петербурга.
Показано, что тип мобильной SCCmec- кассеты обнаруживает корреляцию со spa-типом (таблица 29). Так, клональный комплекс CC8, в основном, представлен штаммами spa-типа t008, несущим SCCmecIV, среди культур СС239 преобладали штаммы spa-типа t030 с мобильной кассетой SCCmecIII.
Учитывая, что отдельные spa-сиквенстипы могут быть однозначно ассоциированы с тремя наиболее распространенными клональными комплексами (СС8, СС239, СС5) мы посчитали целесообразным оценить эпидемиологическую зна 196 чимость отдельных клональных комплексов, исходя из их распространенности и размеров эпидемических кластеров (вспышек), сформированных в отдельных стационарах (таблица 30). Для отнесения культур к клональным комплексам СС8иСС239 (суммарно) и СС5 была также дополнительно использована методика мультиплексной ПЦР, предложенная J.D. Cockfield et al. (2007) [181].
Клональ-ный комплекс Всего культур Количество географических регионов, в которых обнаруживался Количествопораженных стационаров Число эпидемиологически связанных случаев Медианныйразмеркластера встационаре СС8 132 5 11 26, 8, 19, 8, 5, 4, 16, 50 12 (4-50) СС239 37 4 6 13, 2, 4, 16 8,5 (2-16) СС5 4 1 1 4 4 Примечание. – цифры обозначают число случаев в каждом эпидемиологическом кластере (вспышке), т.е. эпизоде циркуляции отдельного сиквенстипа в стационаре.
В структуре госпитальных популяций Staphylococcus aureus преобладают клоны, отнесенные к клональным комплексам CC8 и СС239. С данными клональ-ными комплексами связано 76,3 и 21,4% внутрибольничных MRSA-инфекций.
Исходя из рассмотрения представленной в таблице информации, очевидно также, что клональный комплекс СС8 является не только наиболее широко распространенным, но и наиболее актуальным с эпидемиологических позиций, в связи с тем, что он был представлен в стационарах наибольшего количества географических регионов и был способен обуславливать значительные эпидемические кластеры (до 50 эпидемиологически связанных случаев в стационаре).
Кроме того, проведенное spa-сиквенстипирование позволило предположить необычные эпидемиологические связи между удаленными географическими регионами.
Так, например, spa-сиквенстип t932, циркулировавший в городе Кемерово, ранее обнаруживался в стационарах Ближнего Востока [156], что не исключает возможности завоза данного генотипа MRSA c лицами, совершающими туристические поездки в данный регион.
В отличие от госпитальных штаммов MRSA, демонстрирующих четкую кло-нальную структуру с преобладанием небольшого числа spa-типов, популяция мети-циллин-чувствительных стафилококков является более генетически гетерогенной.
В пользу данного утверждения свидетельствует проведенная оценка степени генетической гетерогенности госпитальной и негоспитальной популяций с использованием индекса Симпсона. Значение этого показателя для госпитальной популяции MRSA составило 0,472 (95% ДИ=0,467–0,478), для негоспитальной – 0,091 (95% ДИ=0,059–0,133).
Статистически значимые различия в сравниваемых показателях отражают, по-видимому, закономерное уменьшение степени генетической гетерогенности популяции S. aureus в процессе адаптации к условиям медицинской среды стационаров. Эффект снижения генетической гетерогенности популяции возбудителя при освоении новой экологической ниши известен как «эффекта бутылочного горлышка» («bottleneck effect») [83, 201].
Невысокая степень генетического разнообразия госпитальных MRSA, поддерживается, по-видимому, также за счет активной циркуляции в стационарах наиболее адаптированных генотипов и их межгоспитального распространения. Данное обстоятельство определяет необходимость изучения биологических (в т.ч. генетических) факторов, определяющих адаптивный потенциал эпидемических клонов золотистого стафилококка.
Обращает на себя внимание тот факт, что эпидемические ситуации, происходящие в амбулаторных условиях, связаны с другими генотипами, чем те, которые вызывали эпидемические вспышки в стационарах. Так, кластер из пяти случаев стафилококковой инфекции, возникший в амбулаторных условиях в 2006 году (хирургическая клиника в Санкт-Петербурге, где проходили амбулаторное лечение военнослужащие) был обусловлен MSSA spa-типа t435 [30]. Тяжелые случаи инфекций кожи и мягких тканей, обусловленные штаммами этой филогенетической линии отмечались ранее в педиатрическом стационаре в г. Риги (Латвия) [90].