Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

ДЕНСИТОМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ НЕКОТОРЫХ НАРКОТИЧЕСКИХ СРЕДСТВ И ПСИХОТРОПНЫХ ВЕЩЕСТВ В ХИМИКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ Кормишин Василий Алексеевич

ДЕНСИТОМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ НЕКОТОРЫХ НАРКОТИЧЕСКИХ СРЕДСТВ И ПСИХОТРОПНЫХ ВЕЩЕСТВ В ХИМИКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ
<
ДЕНСИТОМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ НЕКОТОРЫХ НАРКОТИЧЕСКИХ СРЕДСТВ И ПСИХОТРОПНЫХ ВЕЩЕСТВ В ХИМИКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ ДЕНСИТОМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ НЕКОТОРЫХ НАРКОТИЧЕСКИХ СРЕДСТВ И ПСИХОТРОПНЫХ ВЕЩЕСТВ В ХИМИКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ ДЕНСИТОМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ НЕКОТОРЫХ НАРКОТИЧЕСКИХ СРЕДСТВ И ПСИХОТРОПНЫХ ВЕЩЕСТВ В ХИМИКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ ДЕНСИТОМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ НЕКОТОРЫХ НАРКОТИЧЕСКИХ СРЕДСТВ И ПСИХОТРОПНЫХ ВЕЩЕСТВ В ХИМИКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ ДЕНСИТОМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ НЕКОТОРЫХ НАРКОТИЧЕСКИХ СРЕДСТВ И ПСИХОТРОПНЫХ ВЕЩЕСТВ В ХИМИКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ ДЕНСИТОМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ НЕКОТОРЫХ НАРКОТИЧЕСКИХ СРЕДСТВ И ПСИХОТРОПНЫХ ВЕЩЕСТВ В ХИМИКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ ДЕНСИТОМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ НЕКОТОРЫХ НАРКОТИЧЕСКИХ СРЕДСТВ И ПСИХОТРОПНЫХ ВЕЩЕСТВ В ХИМИКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ ДЕНСИТОМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ НЕКОТОРЫХ НАРКОТИЧЕСКИХ СРЕДСТВ И ПСИХОТРОПНЫХ ВЕЩЕСТВ В ХИМИКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ ДЕНСИТОМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ НЕКОТОРЫХ НАРКОТИЧЕСКИХ СРЕДСТВ И ПСИХОТРОПНЫХ ВЕЩЕСТВ В ХИМИКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ ДЕНСИТОМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ НЕКОТОРЫХ НАРКОТИЧЕСКИХ СРЕДСТВ И ПСИХОТРОПНЫХ ВЕЩЕСТВ В ХИМИКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ ДЕНСИТОМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ НЕКОТОРЫХ НАРКОТИЧЕСКИХ СРЕДСТВ И ПСИХОТРОПНЫХ ВЕЩЕСТВ В ХИМИКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ ДЕНСИТОМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ НЕКОТОРЫХ НАРКОТИЧЕСКИХ СРЕДСТВ И ПСИХОТРОПНЫХ ВЕЩЕСТВ В ХИМИКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ
>

Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Кормишин Василий Алексеевич. ДЕНСИТОМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ НЕКОТОРЫХ НАРКОТИЧЕСКИХ СРЕДСТВ И ПСИХОТРОПНЫХ ВЕЩЕСТВ В ХИМИКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ: диссертация ... кандидата фармацевтических наук: 14.04.02 / Кормишин Василий Алексеевич;[Место защиты: Самарский государственный медицинский университет].- Самара, 2014.- 145 с.

Содержание к диссертации

Введение

ГЛАВА 1. Современное состояние химико- оксикологических исследований наркотических редств

1.1 Основные аспекты проблемы злоупотребления наркотическими средствами 12

1.2 Механизм действия и особенности токсикокинетики наркотических средств, производных опиатов, фенилалкиламинов, барбитуратов 15

1.3 Посмертное распределение и перераспределение соединений исследуемых групп в организме человека 28

1.4 Особенности анализа изучаемых соединений в трупном материале 29

1.4.1Методы изолирования наркотических средств из трупного материалаЗО

1.4.2 Методы анализа, используемые в судебно-химической практике 34

1.5 Хроматографические методы анализа 36

Выводы и предпосылки к работе 44

Экспериментальная часть

ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования

2.1 Реагенты, стандартные растворы и объекты исследования 46

2.2 Методы исследования 50

2.2.1 Тонкослойная хроматография 50

2.2.2 Денситометрический анализ 51

ГЛАВА 3. Денситометрический анализ анализируемых веществ в условиях модельного эксперимента

3.1 Анализ методом тонкослойной хроматографии 54

3.2 Денситометрический анализ 55

3.2.1 Растровые манипуляции 58

3.2.2 Определение градуировочных характеристик методики денситометрического анализа 59

3.3 Определение метрологических характеристик методики денситометрического анализа 70

Выводы 78

ГЛАВА 4. Апробация методики полуколичественного денситометрического определения ряда наркотических средств, психотропных и лекарственных веществ на образцах мочи

4.1 Выбор биологического объекта для исследования 80

4.2 Выбор условий изолирования исследуемых веществ из биоматериала 80

4.2.1 Природа объекта исследования и его количество 81

4.2.2 Физико-химические свойства экстрагируемых веществ 82

4.2.3. Природа экстрагента, его количество, величина рН среды, а также природа соединения, используемого для изменения величины рН среды 88

4.2.4. Изолирование баклофена из мочи 89

4.3 Методика пробоподготовки исследуемых соединений 91

4.4. Схема денситометрического анализа 92

4.4. Результаты исследования и степень извлечения соединений 94

Выводы 94

ГЛАВА 5. Практическое применение и оценка экономической эффективности разработанных методик денситометрического анализа

5.1 Определение опиатов, барбитуратов, фенилалкиламинов и ряда других лекарственных веществ в экспертном материале. Сравнение результатов денситометрического анализа с результатами других методов 96

5.2 Сравнительная оценка стоимости анализа и затрачиваемого времени на исследование метода ТСХ с применением денситометрии по сравнению с другими скрининговыми методами 101

Выводы 103

Общие выводы 104

Список литературы 106

Приложения 121

Введение к работе

Актуальность темы. Проблема экспертизы смертельных отравлений наркотическими средствами является актуальной и насущной. Причина этого широкое распространение употребления наркотиков в подростковой и молодежной среде, высокой летальностью среди наркоманов, резким ростом количества наркоманов по всей России, высоким уровнем заболеваемости наркоманов ВИЧ, гепатитами В и С.

В последние годы произошли существенные изменения в спектре потребляемых наркотических средств. Получил распространение феномен «полинаркомании» или осложненной наркомании, то есть использование лекарственных «коктейлей», в состав которых входит до 5 наименований психо-активных веществ. В связи с этим возросло число случайных и умышленных интоксикаций лекарственными и наркотическими средствами различных фармакологических групп. Состав «коктейлей» неоднороден и зависит от местной региональной ситуации, круга общения, материального обеспечения и других факторов. При употреблении «коктейлей» доза каждого из принятых веществ может не достигать токсического уровня, но при этом сильно искажается картина отравления и нередко употребление многокомпонентной смеси приводит к летальному исходу (Саакаян М.В., 2007; Григорец Ф.И., 2010).

В работе химиков - экспертов весьма актуальным является получение быстрой и достоверной информации о наличии токсикантов в биологическом материале на этапе скрининга. Этому требованию в полной мере отвечает метод тонкослойной хроматографии (ТСХ). ТСХ является одним из основных методов, используемых в рамках химико-токсикологического анализа в качестве метода предварительного исследования. Широкое применение ТСХ связано с высокой производительностью, простотой, достаточной специфичностью метода. Денситометрия, в свою очередь, обеспечивает ТСХ возможность полуколичественного определения анализируемых веществ и документирования результатов (Симонов Е.А., Изотов Б.Н., Фесенко А.В., 2000).

Однако высокая стоимость специализированного аналитического оборудования, в частности сканирующих денситометров и программного обеспечения, большинству лабораторий экспертных учреждений не позволяет использовать в полном объеме возможности ТСХ.

Цели и задачи работы. Целью настоящего исследования является оптимизация предварительного исследования в химико-токсикологическом анализе на опиаты, барбитураты, фенилалкиламины и ряд других лекарственных веществ.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Определение аналитических характеристик: пределов обнаружения, значений Rf, величин интенсивности окраски и флуоресценции ряда токсикантов (фенобарбитала, барбитала, барбамила, морфина, кодеина, эфедрина, верапамила, доксиламина, амитриптилина, димедрола, баклофена) методом ТСХ с применением программы для денситометрии «ТСХ-менеджер».

2. Установление характера градуировочных зависимостей для полуколичественного денситометрического определения фенобарбитала, барбитала, барбамила, морфина, кодеина, эфедрина, верапамила, доксиламина, амитриптилина, димедрола, баклофена, а также провести оценку влияния способа регистрации хроматограмм, программных растровых манипуляций на аналитические характеристики изучаемых веществ.

3. Определение метрологических характеристик методики полуколичественного денситометрического анализа исследуемых веществ.

4. Апробация методики полуколичественного денситометрического определения изучаемых веществ на модельных образцах мочи.

5. Проведение экономической оценки эффективности внедрения в практику химико-токсикологического анализа предложенных методик денситометрического определения токсикантов.

6. Разработка проекта методических указаний для химиков-экспертов «Денситометрическое определение ряда наркотических средств, психотропных и лекарственных веществ в химико-токсикологическом анализе» для химиков – экспертов судебно-химических отделений.

Научная новизна. Разработана методика денситометрического анализа ряда наркотических средств, психотропных и лекарственных веществ (фенобарбитала, барбитала, барбамила, морфина, кодеина, эфедрина, верапамила, доксиламина, амитриптилина, димедрола, баклофена) в моче, а также обоснована возможность полуколичественного определения вышеуказанных веществ методом денситометрии в условиях серийного химико-токсикологического анализа на этапе предварительного исследования.

В условиях модельного эксперимента определены метрологические характеристики разработанных методик полуколичественного определения изучаемых веществ в образцах мочи.

Показана возможность полуколичественного определения вышеуказанных веществ и документирования результатов исследования в условиях рутинного анализа в судебно-химическом отделении Бюро судебно-медицинской экспертизы.

Практическая значимость. Практическая значимость работы заключается в том, что в результате исследований разработан проект методических указаний «Денситометрическое определение ряда наркотических средств, психотропных и лекарственных веществ в химико-токсикологическом анализе» для практических химиков-экспертов судебно-химических отделений Бюро судебно-медицинской экспертизы, что позволит повысить эффективность их работы. Результаты диссертационных исследований используются в ГКУЗ «Ульяновское областное бюро судебно-медицинской экспертизы», ГКУЗ «Ульяновская областная наркологическая клиническая больница», а также в учебном процессе на кафедрах фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии, химии фармацевтического факультета государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтической науки. Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематическим планом научно-исследовательских работ ГБОУ ВПО СамГМУ Минздрава России (номер государственной регистрации 01200202298) по теме «Комплексные исследования по проблеме создания новых лекарственных препаратов природного и синтетического происхождения» (№ 01200900658).

Положения, выносимые на защиту:

1.Результаты определения аналитических характеристик некоторых наркотических средств, психотропных веществ методом ТСХ с применением денситометрии.

2. Оценка влияния программных растровых манипуляций на аналитические характеристики методики денситометрического определения ряда наркотических средств, психотропных и лекарственных веществ.

3. Метрологические характеристики методики полуколичественного денситометрического определения исследуемых веществ.

4. Апробация методики полуколичественного денситометрического определения исследуемых веществ на модельных образцах мочи.

Апробация работы. Основные материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на Всероссийской научно-практической конференции, посвящённой 40-летию фармацевтического факультета СамГМУ «Современная фармацевтическая наука и практика: традиции, инновации, приоритеты», (Самара, 2011); IV Международной научно-практической конференции «Теория и практика современной науки» (Москва, 2011); IX Международной научно-практической конференции «Современные проблемы гуманитарных и естественных наук» (Москва, 2011); II международной научно-практической конференции «Интеграция науки и практики как механизм эффективного развития современного общества» (Москва, 2011); II Международной научно-практической конференции «Теоретические и практические аспекты развития современной науки» (Москва, 2011); I Международной научно-практической конференции «Научные итоги 2011 года: достижения, проекты, гипотезы» (Новосибирск, 2011); XIV Международной научно-практической конференции «Наука и современность – 2011» (Новосибирск 2011); международной заочной научно-практической конференции «Вопросы науки и техники» (Новосибирск, 2012); Всероссийской конференции с международным участием «Молодые ученые – медицине» (Самара, 2012); Российской научно-практической конференции «Современные проблемы фармацевтической науки», посвященной 75-летию ПГФА (Пермь, 2012); Всеукраинской научно-практической конференции «Актуальные вопросы создания новых лекарственных средств» (Харьков, 2012); международной научно-практической конференции «Фармакологический фундамент современной медицины, проблемы и пути их решения» (Минск, 2012); XVII Всероссийском конгрессе «Экология и здоровье человека» (Самара, 2012); 68-ой научно-практической конференции «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (Волгоград, 2013).

Публикации. Основное содержание диссертации изложено в 17 печатных работах, в том числе 4 статьи опубликованы в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Личный вклад автора. Приведенные в диссертации результаты исследования Кормишина В.А. полностью соответствуют имеющимся в регистрационных документах (лабораторных журналах, хроматограммах, денситограммах и др.). Все исследования: обработка, анализ и оценка результатов выполнены лично Кормишиным В.А. или при его непосредственном участии. Кормишиным В.А. определены градуировочные зависимости между количеством токсиканта и аналитическим сигналом, а также установлены величины Rf в определенных системах растворителей.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, главы, посвященной объектам и методам исследований, трех глав собственных исследований, выводов, списка литературы, включающего 130 наименований, в т. ч. 36 источников иностранных авторов, а также 5 приложений. Работа изложена на 145 страницах машинописного текста, включает 11 таблиц, 23 рисунка и приложения. Диссертация завершается общими выводами по работе, списком литературы.

Результаты, полученные при проведении исследований, обработаны статистически и представлены в таблицах и на рисунках, которые приведены в тексте диссертации.

Механизм действия и особенности токсикокинетики наркотических средств, производных опиатов, фенилалкиламинов, барбитуратов

Применение опиатов датируется периодом Шумерской цивилизации и описано в арабской литературе уже в Х веке. Однако три события, произошедшие в ХIX веке: выделение морфина, изобретение шприца для подкожной инъекции и синтез диацетилморфина (героина) в 1874 г. - стали основой широкого распространения применения опиатов не только в медицинских целях, но и для злоупотребления ими [48]. Термин «опиат» относится к естественным алкалоидам опийного мака (Papaver somniferum) таким как морфин и кодеин. В настоящее время этим термином обозначают природные и полусинтетические вещества, а синтетические вещества, отличающиеся по химической структуре от структуры морфина, но действующие по сходному механизму (через опиоидные рецепторы) обозначают - «опиоидами». При этом морфин служит стандартом для оценки свойств веществ. По физико-химическим свойствам вещества опийной группы являются основаниями, мало растворимыми в воде [19, 32]. В структуре заболеваний наркоманиями в России потребление веществ этой наркотической группы составляет 50-60 %, при этом до 95 % из них составляет потребление средств, «кустарно» приготовленных из растительного сырья [16, 40].

Морфиноподобные вещества воздействуют на специальные опиатные рецепторы, которые обычно реагируют на эндогенные вещества эндорфины и энкефалины, являющиеся медиаторами нервных импульсов. Существуют три особых подтипа опиатных рецепторов: мю, каппа и дельта. Мю-рецепторы преимущественно связывают морфин и находятся в областях, вовлеченных в анальгезию. Этот рецептор также участвует в процессах эйфории, которая и является причиной стремления испытать ее еще и еще раз. При этом довольно быстро развивается привыкание и для достижения эффекта приходится увеличивать дозы, что может привести к тяжелым отравлениям, нередко со смертельным исходом [48, 100].

Опиаты всасываются при подкожном, внутримышечном введении и при приеме внутрь. Биодоступность у морфина 20-30 %, у кодеина 70 %. Однако, уровень содержания опиатов в плазме крови при приеме внутрь невысокий из-за интенсивного метаболизма в печени и относительно низкой связи с белками крови. Они быстро покидают кровь и накапливаются в легких, печени, почках. Гидрофобные свойства героина и кодеина позволяют им проходить через гематоэнцефалический барьер намного эффективнее морфина, что, соответственно, усиливает их эффект на ЦНС. Так, героин после внутривенного введения уже через 2 минуты достигает мозга, а полностью метаболизируется через 7 минут [100, 122]. Основные фармакокинетические параметры наркотических средств этой группы, наиболее широко используемых для злоупотребления, приведены в Таблице 1 [78].

Опиаты подвергаются биотрансформации преимущественно в печени, но частично могут просто экскретироваться с желчью в просвет кишечника, из которого вновь всасываются. В печени опиаты частично превращаются в морфин, основной путь биотрансформации которого связь с глюкуроновой кислотой [59, 62, 133]. Экскреция метаболитов морфина и других препаратов группы происходит путем выведения с мочой. 75 % морфина выводится с мочой за 24 часа [29, 31, 100].

Барбитураты относятся к седативно-снотворным средствам и являются депрессантами ЦНС. Они обладают антифобическими, успокаивающими свойствами в низких дозах и седативно-снотворным эффектом в более высоких дозах [32, 29, 100].

После появления в 1903 г. одного из первых барбитуратов - барбитала было синтезировано свыше 2000 производных барбитуровой кислоты, что связано с клиническим и коммерческим успехом этой группы [48]. Длительное применение барбитуратов, особенно в дозах превышающих терапевтические, приводит к развитию явлений психической и физической зависимости с выраженным синдромом абстиненции [29, 100].

По своим физико-химическим свойствам они относятся к веществам кислотного характера [78]. Заместители в 5-ом положении кольца барбитуровой кислоты придают специфическую активность различным препаратам в отношении их действия на ЦНС [32]. Фармакокинетические параметры этой группы представлены в Таблице 2 [78]. Биотрансформация опиатов в организме человека представлена на рисунке 3.

Определение градуировочных характеристик методики денситометрического анализа

Предел обнаружения методом ТСХ с визуальной регистрацией сигнала (при условии нанесения 100 мкл раствора на пластину) составлят: для опиатов 100 мкг/мл, для барбитуратов 70 мкг/мл, для фенилалкиламинов 20 мкг/мл, для димедрола 70 мкг/мл, для амитриптилина 20 мкг/мл, для доксиламина 30 мкг/мл, для баклофена 10 мкг/мл.

Уменьшение величины предела обнаружения вносят растровые манипуляции с электронным образом хроматограммы – изменения резкости, интенсивности изображения, изменения параметров яркости и контрастности, возможности просмотра хроматограммы в негативе. Данные манипуляции позволяют сделать почти незаметное для человеческого глаза «пятно» анализируемого вещества четко детектируемым. При исследовании модельных образцов мочи также удалось достигнуть предела обнаружения близкого к значениям стандартных растворов в пробе за счет растровых манипуляций. На рисунке 9 приведены хроматограммы модельных образцов мочи с концентрациями эфедрина 10,0, 50,0, 200,0, 250,0 мкг/мл.

Для определения количественных характеристик методики денситометрического анализа проводили по 10 параллельных исследований. На пластину наносили градуировочный образец в четырех заданных концентрациях и анализируемый раствор аналита. После хроматографирования и денситометрирования в программе строили градуировочный график по четырем точкам и определяли концентрацию аналита. Градуировочная зависимость «площадь пятна (Y) – концентрация аналита, мкг/мл (X)», построенная в диапазоне концентраций 5,0-250,0 мкг/мл. Однако, для установления данной зависимости необходимо использовать не менее четырех растворов стандартного образца вещества различных концентраций (градуировочных образцов), что в условиях повседневной аналитической практики приведет к снижению производительности анализа. Для упрощения аналитической задачи нами было предложено применение линейной регрессии, при этом количество градуировочных образцов было уменьшено до двух, при этом относительная ошибка определения не превышала 25%, что приемлемо для предварительного этапа анализа. Вышеуказанные зависимости были определены для вариантов анализа с применением в качестве источника электронного образа хроматограммы планшетного сканера и цифрового фотоаппарата (таблица 5). Однако, для установления данной зависимости необходимо использовать не менее четырех растворов стандартного образца вещества различных концентраций (градуировочных образцов), что в условиях повседневной аналитической практики приведет к снижению производительности анализа. Для упрощения аналитической задачи нами было предложено применение линейной регрессии, при этом количество градуировочных образцов было уменьшено до двух, при этом относительная ошибка определения не превышала 25%, что приемлемо для предварительного этапа анализа. Вышеуказанные зависимости были определены для вариантов анализа с применением в качестве источника электронного образа хроматограммы планшетного сканера и цифрового фотоаппарата (таблица 5). Определение метрологических характеристик методики полуколичественного денситометрического определения ряда наркотических средств, психотропных и лекарственных веществ проводили в соответствии с ГОСТ Р 52361-2005. Определяли основные метрологические характеристики методики: дисперсию, относительное стандартное отклонение, правильность, коэффициент чувствительности. Правильностью называется качество результатов измерения (или измерительной процедуры в целом), характеризующее малость (близость к нулю) систематической погрешности. Результаты контроля правильности методики определения некоторых наркотических средств, психотропных и лекарственных веществ, с применением их контрольных растворов (приготовленных независимо от градуировочных образцов) при использовании различных комбинаций пар градуировочных образцов представлены в таблице 6.

Природа экстрагента, его количество, величина рН среды, а также природа соединения, используемого для изменения величины рН среды

Как было показано в обзоре литературы, для экстракции лекарственных соединений используются различные растворители: вода, этиловый спирт, ацетон, ацетонитрил. В качестве экстрагента мы использовали воду, как полярный растворитель, обладающий высокой растворяющей способностью. Выбор воды был обусловлен легкой доступностью и широким применением в судебно-химическом анализе. Кроме того, моча содержит воду, а также эндогенные вещества, которые могут оказать влияние на ход анализа, практически нерастворимы в воде.

Работа проводилась с дистиллированной водой, отвечающей всем требованиям ГФ Х [12].

Одним из факторов, определяющих степень извлечения соединения из объекта, является соотношение твердой и жидкой фаз. Уже в 1946 году А. А. Васильева показала влияние соотношения количеств экстрагента и объекта на процесс экстракции [8]. Особенно это актуально, если вещества плохо или мало растворимы в воде, так как с увеличением разведения увеличивается и степень извлечения веществ, а также уменьшается влияние фона биоматрицы на результаты исследований. В связи с этим мы использовали соотношение фаз 1 : 9. Увеличение соотношения более 1 : 9 нежелательно, что связано с чувствительностью метода исследования. величины рН среды для процесса экстракции лекарственных соединений из секционного материала впервые было показано В. Ф. Крамаренко с сотрудниками [28]. На примере алкалоидов они показали, что создание и соблюдение оптимальной величины рН среды приводит к увеличению степени извлечения соединения, за счет разрыва его связей с белком, и дает воспроизводимые результаты. Эта мысль была использована в последующих работах некоторыми авторами при разработке методик выделения соединений. С целью получения более чистых экстрактов вместо щавелевой и винной кислот использовались серная, трихлоруксусная, хлороводородная и др. кислоты, а также натрия, калия и аммония гидроксиды [45, 61, 130].

В своей работе мы решили исследовать степень извлечения аналита при разном рН и различной комбинации органических растворителей на примере баклофена. Баклофен является амфолитом, по литературным данным экстракцию осуществляют при рН 2 и 9 [53]. Полнота экстракции при таком подходе не велика. А также, изолирование проводили хлороформом, но ввиду наличия карбооксидьной группы целесообразно извлекать смесью полярного и неполярного растворителя. В качестве полярного органического растворителя нами был выбран нормальный бутанол. Мы изолировали баклофен при различном рН 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10. А также различными органическими растворителями: хлороформом, смесью хлороформ – н-бутанол (6:4), смесью хлороформ – н-бутанол (9:1). Процент извлечения определяли методом ВЭЖХ. Результаты измерений изложены в таблице 8.

Для изолирования морфина, кодеина, фенобарбитала, барбитала, барбамила, эфедрина, верапамила, доксиламина, амитриптилина, димедрола из мочи была выбрана методика пробоподготовки, используемая в практике судебно-химического отделения Ульяновского областного бюро судебно медицинской экспертизы (изолирование подкисленной водой). Экстрагирование аналитов из модельных образцов мочи осуществляли хлороформом при рН 9-11; барбитураты диэтиловым эфиром при рН 2; опиаты смесью хлороформ – изопропанол 9:1 при рН 8-9. Пробоподготовку модельных проб мочи осуществляли методом жид кость-жидкостной экстракции: 1) к 10 мл мочи прибавляли 2 мл концентрированной хлористоводородной кислоты, флакон плотно закрывали и выдерживали 15 мин на кипящей водяной бане. После охлаждения прибавляли 25% раствор аммиака до рН 8,5-9 и дважды экстрагировали смесью хлороформ – изопропанол (9:1) порциями по 10 мл. Органические фазы отделяли, объединяли и фильтровали через бумажный фильтр с безводным сульфатом натрия. Экстракт выпаривали до сухого остатка в токе теплого воздуха (изолирование - морфина, кодеина). 2) к 10 мл мочи прибавляли 0,1 Н раствор соляной кислоты до рН 1-2 и дважды экстрагировали диэтиловым эфиром порциями по 10 мл. Органические фазы отделяли, объединяли и фильтровали через бумажный фильтр с безводным сульфатом натрия. Экстракт выпаривали до сухого остатка в токе теплого воздуха (изолирование – фенобарбитала, барбитала, барбамила). Затем к водной фазе прибавляли 25% раствор ам миака до рН 4-5 и дважды экстрагировали смесью хлороформ – н-бутанол (6:4) порциями по 10 мл. Органические фазы отделяли, объединяли и фильтровали через бумажный фильтр с безводным сульфатом натрия. Экстракт выпаривали до сухого остатка в токе теплого воздуха (изолирование - баклофена). К водной фазе добавляли 25% раствор аммиака до рН 7-8 и дважды экстрагировали хлороформом порциями по 10 мл. Органические фазы отделяли, объединяли и фильтровали через бумажный фильтр с безводным сульфатом натрия. Экстракт выпаривали до сухого остатка в токе теплого воздуха (изолирование - доксиламина). К водной фазе добавляли 25% раствор аммиака до рН 9-10 и дважды экстрагировали хлороформом порциями по 10 мл. Органические фазы отделяли, объединяли и фильтровали через бумажный фильтр с безводным сульфатом натрия. Экстракт выпаривали до сухого остатка в токе воздуха при комнатной температуре (изолирование – эфедрина, амитриптилина, димедрола, верапамила) [5,6]. Водный раствор отбрасывали. Сухие остатки растворяли в 0,5 мл хлороформа. 100 мкл полученного раствора наносили на линию старта хроматографической пластины и хроматографировали.

Пластинки после хроматографирования, проявления и высушивания сканировали на планшетном сканере и фотографировали с помощью цифрового фотоаппарата, полученные файлы формата jpeg обрабатывали с помощью программы «ТСХ-менеджер». Таким образом, дальнейший процесс анализа проводился, используя электронный вариант хроматографической пластины.

Сравнительная оценка стоимости анализа и затрачиваемого времени на исследование метода ТСХ с применением денситометрии по сравнению с другими скрининговыми методами

Для проведения экономической оценки эффективности внедрения методики сравнивали следующие показатели: количество ложноположительных, ложноотрицательных результатов, а также стоимость одного анализа и количество затрачиваемого времени на проведения анализа между методом ТСХ с визуальным детектированием и методом ТСХ с применением денситометрии, а также иммунохроматографическим методом анализа. Для оценки проанализировали 50 образцов мочи от трупов. Перед началом исследования моча была проверена на отсутствие анализируемых веществ методом ВЭЖХ и ГХ-МС. Затем в мочу добавляли рассчитанное количество вещества, создавая концентрацию аналита в моче равную пределу обнаружения. Для ИХА использовали экспресс тесты фирмы «Фактор-Мед». Результаты представлены в таблице 11.

Количество ложноположительных результатов в методе ИХА превышает их количество методом ТСХ по причине не высокого качества ИХА тестов вышеуказанного производителя. Количество ложноотрицательных результатов в методом ИХА меньше, чем методом ТСХ за счет более высокой чувствительности метода. Однако, в методе ТСХ с применением денситометрии количество ложноотрицательных результатов меньше, чем в методе ТСХ с визуальным детектированием за счет применения растровых манипуляций. ТСХ с применением денситометрии и визуальным детектированием имеет одинаковую стоимость, а метод ИХА значительно дороже, но выигрывает во времени. Полуколичественный результат в виде концентрации вещества, полученный методом ТСХ с применением денситометрии, позволяет корректировать объем навески биожидкости, исследуемой подтверждающим методом анализа (ГХ-МС, ВЭЖХ, ВЭЖХ-МС). Это снижает нагрузку на хроматографическую колонку, масс-селективный детектор, и тем самым снижает размер экономических затрат по ремонту и обслуживанию оборудования.

1. Проведено сравнение результатов анализа экспертного материала на опиаты, барбитураты и фенилалкиламины иммунохимическими и хроматографическими методами. Чувствительность метода ТСХ с применением денситометрии на опиаты составляет 92,6 %, на фенилалкиламины - 95 %, метода ИХА на опиаты – 96,2 %, на бензодиазепины - 95 %. Специфичность денситометрического метода на опиаты 100 %, на фенилалкиламины – 95 %, метода ИФА на опиаты 97,1 %, на барбитураты – 95%.

2. Проведена экономическая оценка эффективности внедрения в практику химико-токсикологического анализа предложенных методик денситометрического определения ряда наркотических средств, психотропных и лекарственных веществ. Показано, что при использовании денситометрии процент ложноотрицательных и ложноположительных результатов меньше, чем при визуальном детектировании. А также, концентрация аналита, рассчитанная методом денситометрии, позволяет скорректировать объем навески биожидкости, исследуемой подтверждающим методом анализа (ГХ-МС, ВЭЖХ, ВЭЖХ-МС). Что может снижать нагрузку на хроматографическую колонку, масс-селективный детектор, и тем самым экономит ресурс аналитического оборудования, используемого для подтверждающего метода исследования.

3. На основании результатов исследований разработан проект методических указаний «Денситометрическое определение ряда наркотических средств, психотропных и лекарственных веществ в химико-токсикологическом анализе» для практических химиков-экспертов судебно-химических отделений Бюро судебно-медицинской экспертизы.

Определены аналитические характеристики: значения Rf, величины интенсивности окраски и флуоресценции, пределы обнаружения, ряда токсикантов (фенобарбитала, барбитала, барбамила, морфина, кодеина, эфедрина, верапамила, доксиламина, амитриптилина, димедрола, баклофена) методом ТСХ с применением программы для денситометрии «ТСХ менеджер». 2. Установлено снижение пределов обнаружения исследуемых веществ по сравнению с методом ТСХ с визуальной регистрацией аналитического сигнала за счет программных растровых манипуляций. 3. Показано, что при сканировании хроматографических пластин основные аналитические характеристики методики: чувствительность, правильность, относительное среднее отклонение, дисперсия имеют лучшие показатели, чем при фотографировании пластин. 4. Установлен характер линейной градуировочной зависимости y = kx+b и полиноминальной градуировочной зависимости y=kx2+bx-a для полуколичественного денситометрического определения исследуемых наркотических средств, психотропных и лекарственных веществ 5. Определены метрологические характеристики методик полуколичественного денситометрического определения морфина, кодеина, фенобарбитала, барбитала, барбамила, эфедрина, верапамила, доксиламина, амитриптилина, димедрола, баклофена: чувствительность, правильность, относительное среднее отклонение, дисперсия. 104 6. Методика полуколичественного денситометрического определения некоторых наркотических средств, психотропных и лекарственных веществ апробирована на модельных образцах мочи, установлены пределы обнаружения исследуемых веществ. 7. Проведена экономическая оценка эффективности внедрения в практику химико-токсикологического анализа предложенных методик денситометрического определения ряда наркотических средств, психотропных и лекарственных веществ. Показана экономия ресурса аналитического оборудования, используемого для подтверждающего метода исследования. 8. Разработан проект методических указаний «Денситометрическое определение ряда наркотических средств, психотропных и лекарственных веществ в химико-токсикологическом анализе» для практических химиков экспертов судебно-химических отделений Бюро судебно-медицинской экспертизы.

Похожие диссертации на ДЕНСИТОМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ НЕКОТОРЫХ НАРКОТИЧЕСКИХ СРЕДСТВ И ПСИХОТРОПНЫХ ВЕЩЕСТВ В ХИМИКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ