Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Фармакогностическое описание, химический состав и методы анализа основных действующих веществ бархата амурского (обзор литературы) 13
4. 1.1. Ботаническая, фармакогностическая характеристика сырья бархата амурского 13
5. 1.1.1. Места обитания, ареал заготовки плодов бархата амурского. 13
6. 1.1.2. Морфологическое описание бархата амурского. 14
7. 1.1.3. Химический состав сырья бархата амурского. 15
8. 1.2. Бархат амурский как средство фитотерапии. 17
9. 1.3. Методы анализа основных действующих веществ бархата амурского. 20
10. 1.3.1. Методы определения эфирных масел. 20
11. 1.3.2. Методы определения флавоноидов. 23
12. 1.3.3. Методы определения алкалоидов. 26
13. 1.3.4. Методы определения дубильных веществ . 29
14. 1.3.5. Методы определения кислоты аскорбиновой. 35
15. Выводы к 1 главе. 39
16. ГЛАВА 2. Исследование анатомо -диагностических признаков плодов бархата амурского . 41
17. 2.1. Изготовление срезов и микропрепаратов 41
18. 2.2. Приготовление глицерин-желатиновой смеси 42
19. Выводы ко 2 главе 50
20. ГЛАВА 3 Исследование качественного состава и количественного содержания углеводов, аминокислот и эфирного масла в плодах бархата амурского . 52
21. 3.1. Извлечение и фракционирование природных соединений. 52
22. 3.2. Исследование углеводного и аминокислотного состава плодов бархата амурского . 53
23. 3.3. Изучение присутствия в плодах бархата амурского кумаринов, фитостеролов, стероидов и тритерпеноидов. 59
24. 3.4. Определение фенольных соединений. Идентификация флавоноидов и фенолкарбоновых кислот. 64
25. 3.5. Определение дубильных веществ, иридоидов и кислоты аскорбиновой. 66
26. 3.6. Определение алкалоидов в плодах бархата. 71
27. 3.7 Определение качественного и количественного состава углеводов. 72
28. 3.8. Определение связанных сахаров методом ВЭЖХ, используя обратнофазный анализ и капиллярный электрофорез 75
29 3.9 Определение аминокислот в плодах бархата амурского 78
30 3.10. Определение компонентного состава эфирного масла. 82
31 Выводы к 3 главе. 84
32 ГЛАВА 4. Качественное и количественное определение флаво-ноидов и галлотанинов в плодах бархата амурского 86
33 4.1. Идентификация основных действующих веществ в плодах бархата амурского методом ВЭЖХ . 86
34 4.2. Количественное определение биологически активных веществ в плодах бархата амурского. 91
35 4.2.1. Количественное определение флавоноидов методом ВЭЖХ. 91
36 4.3. Определение подлинности и количественного содержания флавоноидов в плодах бархата амурского. 95
37 4.3.1. Определение подлинности флавоноидов в плодах бархата амурского. 96
38 4.3.2. Спектрометрическое количественное определение флавоноидов в плодах бархата амурского. 98
39 4.3.3. Количественное определение галловой кислоты и дубильных веществ. 105
40 Выводы к 4 главе. 109
41 ГЛАВА 5. Подбор условий и разработка методик определения аскорбиновой кислоты, алкалоидов и сапонинов в плодах бархата амурского 111
42 5.1. Определение аскорбиновой кислоты в плодах бархата амурского методом ВЭЖХ .
43 5.2.Определение алкалоидов. 116
44 5.3. Подбор условий и разработка методик определения сапонинов в плодах бархата амурского. 119
45 5.3.1. Идентификация сапонинов в плодах бархата амурского. 119
46 5.3.2. Разработка методики количественного определения сапонинов в плодах бархата амурского. 121
47 Выводы к 5 главе. 129
48 Общие выводы 130
49 Литература 133
- Методы определения дубильных веществ
- Исследование углеводного и аминокислотного состава плодов бархата амурского
- Идентификация основных действующих веществ в плодах бархата амурского методом ВЭЖХ
- Определение аскорбиновой кислоты в плодах бархата амурского методом ВЭЖХ
Введение к работе
Актуальность темы. Перед современной фармацевтической наукой поставлена задача создания новых и совершенствования существующих препаратов, обладающих высокой фармакологической активностью, малой токсичностью и наиболее полным обеспечением населения эффективными лекарственными средствами. Разрабатываются новые фитопрепараты как в виде лекарственных средств, так и в виде биологически активных добавок. Нами в качестве объекта исследования были взяты плоды бархата амурского. В ВИЛАРе в 60-х годах проводили исследования коры и луба бархата амурского, в 90-е – листьев. Были разработаны препараты «Берберин» - для лечения болезней печени и препарат «Флакозид» для лечения вируса герпеса. На это лекарственное растительное сырье была создана нормативная документация.
Однако плоды бархата амурского так подробно не исследовались. Нормативная документация на них отсутствует. Данные о химическом составе недостаточны. Эти проблемы требуют изыскания и исследования новых источников для создания нормативной документации и получения новых фитопрепаратов и биологически активных добавок.
В народной медицине эти плоды используют при сахарном диабете второго типа, как противовоспалительное средство. В 2000-х годах была разработана биологически активная добавка (БАД) в виде жидкого экстракта, основное внимание которой было акцентировано на гипогликемическом действии и доступности растительного сырья. Его основой стал экстракт из плодов бархата амурского. БАД утверждена институтом питания. Используется с основными лекарственными средствами как вспомогательное средство при лечении заболевания сахарным диабетом II типа.
Все изложенное выше позволяет заключить, что углубленное фармакогностическое исследование данного растительного сырья – плодов бархата амурского является актуальной задачей для использования его в качестве лекарственного средства.
Степень разработанности темы исследования. Несмотря на то, что луб и листья бархата амурского активно изучались, плодам не было уделено должного внимания. Отсутствуют литературные данные о подробном химическом составе плодов и методах их анализа. Не был установлен количественный состав биологически активных веществ плодов.
Цель настоящего исследования. Целью данной работы является углубленное фармакогностическое изучение сырья, определение морфолого - анатомических признаков и химического состава плодов бархата амурского; разработка методик контроля качества и стандартизации плодов бархата амурского с использованием физических, химических и физико – химических методов анализа. Внедрение нормативного документа на плоды бархата амурского для последующего создания препаратов.
Постановка задач и выбор средств для их решения. Для осуществления поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
1. Изучить литературу по фармакогностическим признакам, фармакологии, химическому составу, методам анализа основных действующих веществ плодов бархата амурского.
2. Исследовать морфологические и анатомо - диагностические признаки плодов бархата амурского.
3. С помощью цветных реакций и метода хроматографии в тонком слое сорбента установить качественный состав плодов бархата амурского.
4. Разработать методики идентификации и количественного определения флавоноидов в плодах бархата амурского.
5. С помощью современных физико – химических методов анализа исследовать качественный состав и количественное содержание аминокислот, свободных и связанных углеводов, эфирного масла.
6. Разработать методики идентификации и количественного определения аскорбиновой, галловой кислот и галлотанинов методом ВЭЖХ, а так же для качественного и количественного определения сапонинов и алкалоидов.
7. На основе полученных результатов разработать проект фармакопейной статьи на плоды бархата амурского для включения в ГФ ХII издания.
Решение задач осуществлялось путем обобщения данных литературы и проведения экспериментальных исследований.
Научная новизна. Впервые в результате проведенных исследований методом ВЭЖХ получены новые данные о качественном составе биологически активных веществ в плодах бархата амурского (флавоноиды, аскорбиновая и галловая кислоты, галлотанины, кумарины, сапонины и эфирные масла). Полученные результаты согласуются с нашими исследованиями с использованием метода хроматографии в тонком слое сорбента. Разработаны методики и подобраны условия количественного определения с использованием метода ВЭЖХ в плодах бархата амурского: флавоноидов, аскорбиновой кислоты, галловой кислоты, галлотанинов. Разработана методика количественного определения флавоноидов спектрофотометрическим методом в плодах. Полученные результаты согласуются с данными, полученными методом ВЭЖХ. С помощью аминокислотного анализатора выявлен качественный и количественный состав аминокислот плодов бархата амурского. Обнаружено 19 аминокислот. В процессе исследования качественного и количественного состава углеводов плодов бархата амурского методом ВЭЖХ установлено, что в качестве свободных сахаров присутствуют фруктоза и глюкоза, а в качестве связанных сахаров - глюкоза и ксилоза. В плодах определено количественное содержание алкалоидов. Выявлены диагностически значимые анатомические признаки, позволяющие проводить диагностику ЛРС плодов бархата амурского.
Теоретическая значимость работы. Использование физико – химических исследований позволяет установить оптимальные технологические параметры производственного процесса для экстракции биологически активных веществ из плодов бархата амурского. Представленный в работе экспериментально – практический материал может служить теоретической базой для исследования и создания лекарственных препаратов на основе лекарственного растительного сырья «Бархата амурского плоды». Использование предложенных физико-химических методов анализа в контрольно-аналитических лабораториях позволит систематизировать контроль качества и стандартизацию плодов бархата амурского.
Практическая значимость работы. На основании проведенных исследований разработаны и внедрены:
- методики идентификации флавоноидов в плодах бархата амурского (проект ФС «Бархата амурского плоды»).
- методики количественного определения флавоноидов в плодах бархата амурского (проект ФС «Бархата амурского плоды).
Разработан и составлен проект ФС «Бархата амурского плоды» для включения в ГФ ХII издания (письмо ФГБУ «НЦ ЭСМП» Минздрава РФ № 16453 от 07.11.2013). Материалы исследования внедрены в учебный процесс кафедры фармакогнозии Первого МГМУ им. И.М. Сеченова в разделе «Лекарственные растения, содержащие флавоноиды и ксантоны» (Акт внедрения).
Методология и методы исследования. Объектами исследования служили плоды, собранные в стадии полного созревания, высушенные в соответствии с требованиями сборника «Методические указания по сбору, сушке и хранению сырья». При выполнении работы были использованы методы хроматографии в тонком слое сорбента, спектрофотометрии, ВЭЖХ. Статистическую обработку результатов исследований проводили в соответствии с ГФ ХI. Микроскопический анализ сырья проводили в соответствии с техникой и требованиями, описанными в ГФ ХI изд.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 научных статей, полностью отражающих содержание диссертации; из них 4 статьи в журналах, включенных в перечень ведущих периодических изданий ВАК РФ.
Степень достоверности результатов. Для получения результатов по качественному и количественному содержанию основных БАВ были проведены исследования по анализу семи серий лекарственного растительного сырья. Сравнение полученных результатов с применением методов статистической обработки позволяет считать их достоверными.
Апробация диссертации. Основное положение диссертации доложено на четырех научных конференциях НИИ фармации: на научно – практической конференции «Стандартизация готовых лекарственных средств», Москва, 27.05.2011г; на конференции молодых ученых НИИ фармации, Москва, ноябрь 2012г; на научно – практической конференции «Современные аспекты использования растительного сырья и сырья природного происхождения в медицине», Москва, 28.02.2013г; на Всероссийском научном симпозиуме «Медицинская антропология в России и за её пределами», Москва, 03.07.2013г. Апробация диссертации прошла на конференции ученых НИИ фармации ГБОУ ВПО ПМГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава РФ, 23.04.2013.
Личный вклад автора. При непосредственном участии автора были определены цели и задачи работы, разработаны методические подходы к их вывыполнению; был проведен сбор, обобщение и анализ литературных данных. Диссертант принимал непосредственное участие при разработке методик идентификации и количественного содержания основных БАВ в исследуемом объекте. Автору принадлежит ведущая роль при проведении экспериментальных исследований, статистической обработке и анализе полученных результатов, написании публикаций и нормативной документации. Диссертация и автореферат написаны лично автором.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.04.02 – «Фармацевтическая химия, фармакогнозия». Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пунктам 2,3 паспорта фармацевтическая химия, фармакогнозия.
Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтической науки. Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематикой и планом: «Развитие научных и научно-методических основ, базовых и инновационных подходов при разработке, внедрении и применении лекарственных средств». № 01201261653.
Основные положения, выносимые на защиту:
- Разработаны методики качественного и количественного определения флавоноидов, сапонинов, аскорбиновой, галловой кислот, галлотанинов и алкалоидов для стандартизации изучаемого растительного сырья.
-Определен и уточнен качественный состав биологически активных веществ в плодах бархата амурского, позволяющий рассматривать их в качестве лекарственного сырья.
- Получены результаты по химическому и количественному содержанию свободных и связанных углеводов и аминокислот в плодах бархата амурского.
-Установлены морфолого-анатомические признаки плодов бархата амурского, позволяющие проводить идентификацию растительного сырья.
-Получены результаты по количественному содержанию БАВ в плодах.
Объем и структура диссертации. Работа изложена на 154 страницах машинописного текста, содержит 31 таблицу и 37 рисунков, приложение 1, 2.
Методы определения дубильных веществ
Дубильными веществами называют сложный комплекс веществ, состоящий из полифенолов, танинов и флобафенов, генетически связанных между собой, независимо от того, обладают ли они дубящими свойствами или нет [20,22,23,35].
Дубильные вещества (таниды) являются безазотистыми, неядовитыми природными веществами и филогенетически относятся весьма к древним соединениям (в пирамидах и гробницах Египта находят и теперь рисунки дубильных растений и дубильные материалы) [22].
Дубильные вещества содержат различные растения. Наиболее часто таниды встречаются в корневищах, корнях (щавели), в коре стволов (дуб,ель), в коре корней (хлопчатники), реже – в листьях, стеблях, плодах. Совсем незначительное количество танидов в цветках (девясил, душица) и в древесине стволов (каштан конский) [22].
В корневищах дубильные вещества накапливаются в пробке, в паренхиме коры и сердцевинных лучах.
Накопление дубильных веществ в больших и малых количествах является наследственно закрепленным признаком.
Термин «дубильные вещества» был впервые использован в 1796 г. французским исследователем Сегеном для обозначения присутствующих в экстрактах некоторых растений веществ, способных осуществлять процесс дубления. Практические вопросы кожевенной промышленности в середине прошлого века положили начало изучению химии дубильных веществ [28].
По классификации Г. Проктера (1984 г.) дубильные вещества в зависимости от природы продуктов разложения при температуре 180 -2000 С (без доступа воздуха) разделяются на две основные группы: 1). пирогалловые ( дают при разложении пирогаллол); 2). пирокатехиновые (образуется пирокатехин) [20,21,27,35,67]
В результате дальнейшего исследования химизма танидов К.Фрейденберг уточнил классификацию Проктера и рекомендовал обозначить первую группу (пирогалловые дубильные вещества) как гидролизуемые дубильные вещества, а вторую (пирокатехиновые дубильные вещества) – как конденсированные [21].
Большинство дубильных веществ растений невозможно однозначно отнести к типу гидролизуемых или конденсированных, поскольку эти группы во многих случаях недостаточно резко разграничены. В растениях часто содержится смесь дубильных веществ обеих групп [36].
В настоящее время наиболее часто пользуются классификацией Фрейденберга:
1. Гидролизуемые дубильные вещества – характеризуются наличием в их молекуле сложно – эфирных или гликозидных связей. Обычно в молекулах этих дубильных веществ бензольные ядра соединены через атом кислорода, поэтому гидролизуемые дубильные вещества под влиянием ферментов и кислот легко гидролизуются, распадаясь на более простые вещества:
а). галлотанины – эфиры галловой кислоты и сахаров; б). несахаридные эфиры фенолкарбоновых кислот; в). эллаготанины – эфиры эллаговой кислоты и сахаров.
2. Конденсированные дубильные вещества – не расщепляются при действии минеральных кислот, а образуют красно – коричневые продукты конденсации, называемые флабофенами. Состоят из циклических ядер, связанных между собой углеродными атомами. Конденсированные дубильные вещества – производные, главным образом, катехинов и лейкоантоцианидинов, а так же производные флавана. Встречаются среди них ароматические соединения, значительно реже в их образовании принимают участие стильбены и, возможно, флаванонолы. Из ароматических соединений наиболее изучен пигмент желтого дерева – маклурин [28,36].
Из качественных реакций по данным литературы известны: а). на гидролизуемые вещества.
1. Реакция с ацетатом свинца, в результате которой образуется осадок желтого цвета.
2. Осаждение аммония сульфатом.
3. Реакция с железо – аммониевыми квасцами. Гидролизуемые таниды дают черно – синее окрашивание или осадок. Интенсивность окраски зависит от рН – среды.
4. Дубильные вещества эллаговой группы с натрия нитритом и кислотой уксусной ледяной дают фиолетовое окрашивание [95]. б). на конденсированные дубильные вещества.
1. Осаждение при нагревании с раствором формалина и кислотой хлористоводородной концентрированной. При наличии конденсированных дубильных веществ выпадает красный творожистый осадок (флобафен). Осадок отфильтровывают. При добавлении к фильтрату в нейтральной среде железо – аммониевых квасцов происходит изменение цвета до серо – зеленого.
2. С железо – аммониевыми квасцами конденсированные дубильные вещества дают черно – зеленое окрашивание.
3. Катехины с 1 % раствором ванилина в кислоте хлористоводородной концентрированной дают красное, малиновое или розовое окрашивание. При отсутствии в среде достаточной концентрации кислоты хлористоводородной концентрированной ярко – красной окраски не образуется, при разбавлении водой окраска исчезает.
4. С натрия ацетатом в среде кислоты уксусной ледяной при добавлении железоаммониевых квасцов появляется черно – зеленое окрашивание [95].
Известны также общие качественные реакции на дубильные вещества:
1. Реакция с 1 % раствором желатина, в результате которой появляется характерная муть или белый осадок, исчезающий при добавлении избытка желатина.
2. Реакция с 1 % раствором хинина хлорида (антипирином). При наличии в извлечении дубильных веществ выпадает аморфный осадок.
3. С 0,1 н раствором натра едкого окраска раствора постепенно изменяется от желтой до коричневой [95].
Таким образом, все реакции идентификации дубильных веществ можно разделить на две группы: общие и частные реакции, а также реакции осаждения и цветные реакции (внутри данных групп) [95].
Для проведения качественных реакций из растительного сырья готовят водное извлечение. Для качественной оценки и разделения дубильных веществ используют распределительную хроматографию на бумаге и на колонках.
Для разделения дубильных веществ используются реакции осаждения. При нагревании водных вытяжек с раствором формалина и кислотой хлористоводородной концентрированной в осадок выпадают конденсированные дубильные вещества; гидролезуемые остаются в растворе. При добавлении к фильтрату спиртового раствора калия ацетата в осадок выпадают гидролизуемые дубильные вещества.
Исследование углеводного и аминокислотного состава плодов бархата амурского
Определение углеводов. Анализируют очищенное водное извлечение. Свободные сахара определяют реакцией Бертрана с реактивом Фе-линга. К 1 мл очищенного водного извлечения прибавляют 1 мл жидкости Фелинга (смесь реактива 1 и реактива 2) и нагревают на кипящей водяной бане. В случае наличия в извлечении свободных сахаров должен выпадать красно – оранжевый осадок меди (1) оксида. Реакция дает положительные результаты. Следовательно, в плодах бархата амурского содержатся свободные сахара.
Свободные сахара определяют реакцией с реактивом Фелинга после кислотного гидролиза. К 1 мл очищенного водного извлечения прибавляют 1 мл кислоты серной разведенной и нагревают на кипящей водяной бане в течение 5 мин. После охлаждения к гидролизату добавляют 1 мл жидкости Фелинга. При исследовании очищенного водного извлечения наблюдается выпадение красно – оранжевого осадка, объем которого значительно превышает объем осадка до проведения гидролиза. Это свидетельствует о том, что плоды бархата амурского содержат связанные сахара.
При добавлении к 1 мл очищенного водного остатка 1 каплю 0,1 М раствора йода синего окрашивания не наблюдалось. Это свидетельствует об отсутствии крахмала в плодах бархата.
К 1 мл очищенного водного остатка прибавляют трехкратный объем 96 % этанола – образование белого осадка не наблюдалось. Из этого можно сделать вывод, что полисахариды в плодах бархата отсутствуют.
Полученные данные подтверждают методом хроматографии в тонком слое сорбента на пластинках «Сорбфил – ПТСХ-АФ-А-УФ». Анализ проводили с использованием различных систем растворителей: 96 % этанол; 70 % этанол; вода - изопропанол (3:1); изопропанол – вода (4:1) [26, 12, 95, 104, 118]. Время насыщения камеры парами растворителей 2 часа.
На линию старта пластинки «Сорбфил – ПТСХ-АФ-А-УФ» размером 1015 см наносят в одну точку испытуемый раствор 20 мкл, в другую точку 20 мкл 5 % раствора фруктозы. Когда фронт растворителей пройдет 12 см, пластинку вынимают из камеры, высушивают на воздухе и обрабатывают детектирующими реактивами:.антроновым реактивом, резорциновым реактивом и дифениламиновым реактивом [131,169,187]. Хроматограмму погружают в реактив 1 антронового реактива, высушивают на воздухе, затем опрыскивают реактивом 2 антронового реактива, высушивают на воздухе и нагревают в сушильном шкафу при температуре 1050 С в течение 5 мин. Реактив является специфичным на кетозы и пентозы. Моно-, ди-, три- и полисахариды, содержащие кето-гексозы дают желтую окраску, кетонектозы – пурпурную, кетогектозы – оранжевую [169, 187]. растворителей изопропанол – вода (4:1). Результаты представлены на рис. 11.
Извлечение из плодов бархата дает пятна желтого цвета, совпадающие по значению Rf с пятном раствора фруктозы (Rf 0,68). При опрыскивании хроматограммы резорциновым реактивом, также специфичным на кетозы, с последующим нагреванием при температуре 900 С в течение 10 мин, наблюдались пятна розового цвета и аналогичной формы и расположения.
При опрыскивании хроматограммы дифениловым реактивом, специфичным для альдоз (альдогексозы дают коричневое окрашивание, альдокектозы- пурпурные), извлечение дает пятно серовато – коричневого цвета с Rf 0,67, совпадающее по цвету и значению Rf с пятном раствора глюкозы. Хроматограмма представлена на рис 12.
Таким образом, методом ТСХ нам удалось обнаружить в плодах бархата амурского свободные сахара, представленные глюкозой и фруктозой.
Пр иго товлен ие р е акти вов:
1. Антроновый реактив. Состоит из реактива 1 и реактива 2, которыми последовательно обрабатывают хроматографические пластинки, реактивом 1 методом погружения, затем реактивом 2 методом опрыскивания.
1.1 . При го товле ние р е а к тива 1. 0,3 г антрона растворяют в 10 мл горячей кислоты уксусной. Реактив используют немедленно после приготовления.
1 .2 . При го товле ние р е а к тива 2. К 20 мл 95 % этанола прибавляют 3 мл фосфорной кислоты (плотность 1,6) и 1 мл воды, перемешивают.
2 . Резорцино вый ре ак ти в. К 1 мл 95 % этанола прибавляют 9 мл 2 М хлористоводородной кислоты, перемешивают. 0,1 г резорцина растворяют в приготовленном растворителе.
3. Дифениламиновый реактив. К 5 мл н - бутанола прибавляют 5 мл метанола, перемешивают. 0,5 г трихлоруксусной кислоты растворяют в приготовленном растворителе. 0,2г дифениламина растворяют в приготовленном растворе трихлорук-сусной кислоты [104].
Определение аминокислот. В растениях аминокислоты являются исходным материалом для биосинтеза целого ряда физиологически активных соединений: ауксинов, ферментов, алкалоидов, полифенолов, витаминов и др. соединений [5, 6]. Обладая широким спектром фармакологического действия, аминокислоты могут также придавать микроэлементам и другим веществам фармакологически безвредную и легко усвояемую форму, одновременно потенцируя их эффект [7, 9]. Имеются сообщения об участии аминокислот в процессах нервной регуляции различных функций организма и о выраженном влиянии их на сосудистый тонус [10]. В настоящее время из различных растительных источников идентифицировано более 300 свободных аминокислот и продуктов их метаболизма [11, 16]. Для большинства лекарственных растений, используемых в медицине, неизвестен качественный аминокислотный состав и количественное содержание отдельных аминокислот. Поэтому лекарственные растения не рассматриваются в качестве источника аминокислот в комплексе с микроэлементами и другими фармакологически активными веществами. Имеются лишь отдельные сведения об аминокислотном составе калины обыкновенной, тыквы обыкновенной, донника белого, пажитника голубого, лопуха большого [17, 18, 51, 55, 56, 141,192, 198].
К 1 мл очищенного водного извлечения из плодов бархата амурского прибавляют 1 мл 0,25 % раствора спиртового нингидрина и нагревают на кипящей водяной бане в течение 5 мин. Появление красно – синего окрашивания, усиливающегося при дальнейшем нагревании, свидетельствует о наличии аминокислот. Реакция положительна, следовательно, в плодах бархата амурского содержатся аминокислоты [142, 160].
Далее исследовали извлечение с помощью методик ТСХ, описанных в литературе [25, 26, 51, 55, 105, 117, 121, 125, 142, 160].
На стартовую линию пластинки «Сорбфил ПТСХ-АФ-А – УФ» размером 1015 см наносят в одну точку 50 мкл очищенного водного извлечения в другую точку по 20 мкл 0,5 % водного раствора аланина; 0,5 % водного раствора метионина; 0,5 % раствора глицина; 0,5 % раствора кислоты глютаминовой и хроматографируют восходящим способом в системе растворителей: 95 % этанол; н - бутанол - диэтиловый эфир - уксусная кислота - вода (9:6:3:1); н – бутанол - уксусная кислота-вода (4:1:5) и н - бутанол - уксусная кислота - вода (4:1:2).
Идентификация основных действующих веществ в плодах бархата амурского методом ВЭЖХ
Согласно данных литературы в плодах бархата амурского содержатся: углеводы, эфирное масло, алкалоиды, кумарины, дубильные вещества и флавоноиды [172]. Нашими исследованиями установлено, что в плодах бархата амурского содержатся свободные и связанные сахара, аминокислоты, фитостеролы, стероиды, тритерпеноиды, флавоноиды, дубильные вещества, аскорбиновая кислота, в небольшом количестве иридоиды и алкалоид берберин. Нами исследован качественный и количественный состав углеводов, аминокислот и эфирного масла в плодах бархата амурского (глава 3).
Задачей наших исследований в главе 4 было: провести идентификацию и установить количественное содержание флавоноидов и дубильных веществ в плодах бархата амурского.
Идентификация основных действующих веществ в плодах бархата амурского методом ВЭЖХ
Предварительно нами разработаны методики идентификации фла-воноидов и дубильных веществ с использованием цветных реакций и метода хроматографии в тонком слое сорбента. На следующем этапе исследования нами для идентификации выше перечисленных веществ был использован метод высокоэффективной жидкостной хроматографии.
Для идентификации и количественного определения биологически активных компонентов плодов бархата амурского готовили спирто -водные извлечения.
Методика. Около 2,0 г (точная навеска) плодов, измельченных до размера частиц проходящих сквозь сито диаметром отверстий 2 мм, помещают в круглодонную колбу вместимостью 250 мл, добавляют 60 мл 70 % этанола и нагревают на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 45 мин. После охлаждения извлечение фильтруют через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 100 мл, следя за тем, чтобы частицы сырья не попали на фильтр. В колбу, в которой проводили извлечение, добавляют 40 мл 70 % этанола и извлекают на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 15 мин. Извлечение фильтруют через тот же фильтр в ту же мерную колбу. Шрот и фильтр промывают 10 мл 70 % этанола и доводят объем раствора в колбе 70 % этанолом до метки (испытуемый раствор А).
Выбор длины волны детектирования.
Существование модифицированных форм соединений флавоноид-ной природы предопределяет необходимость при оценке качества извлечения плодов бархата амурского исследовать спектральные и хромато-графические характеристики водно-спиртового извлечения. При этом для качественной оценки достаточно, чтобы спектральные характеристики биоактивных компонентов в основном совпадали со спектром флакозида, а количественную оценку давать по содержанию суммы фла-воноидов в пересчете на флакозид. Общим характерным признаком для подобных соединений является хромофорная группа (скобки рис. 28), особенности которой экспериментально определяются в конкретных условиях хроматографирования по спектру поглощения основного соединения – выбранного в качестве рабочего стандарта.
Из анализа спектра флакозида и водно-спиртового извлечения плодов бархата амурского имеет место совпадение характеров спектров в области 200 – 250 нм с плечём в области 225 нм. Это позволяет полагать, что при детектировании хроматографического процесса на длине волны 220 – 225 нм можно идентифицировать соединения как высокополярные, например, аскорбиновую кислоту, так и малополярные соединения, например, ароматические масла. В то же время детектирование на длине волны 290 нм позволит выявить и количественно оценить как содержание таниновых соединений, например, галловой кислоты, так и суммарное содержание флаво-ноидов в пересчете на флакозид.
Ниже представлены хроматограммы водно – спиртового извлечения плодов бархата амурского. Детектирование осуществлено на двух выбранных длинах волн.
Идентификация компонентов проведена по характеру спектров поглощения каждого хроматографического пика. Выделены следующие группы компонентов извлечения – витамины, танины, флавоноиды, аг-ликоны и ароматические масла.
Длина волны 220 нм позволила дать оценку относительного содержания групп компонентов извлечения. Высокополярные соединения ( вит. С, сахара и др.) – 8,9 %, дубильные вещества – 10,2 %, флавонои-ды – 22,83 %, агликоны – 8,77 %, кумарины – 5,42 %, эфирные масла – 39,3%. Количественную оценку содержания флавоноидов производили относительно флакозида, химическая чистота которого представлена ниже.
На рис. 31 представлена хроматограмма модельного раствора соединений, использованных для идентификации компонентов извлечения бархата амурского.
Идентификация компонентов осуществлялась по временам выхода стандартных соединений и по совместимости их спектров поглощения (см. приложение). Приложение – 8,9,10,11,12,13 страницы.
Определение аскорбиновой кислоты в плодах бархата амурского методом ВЭЖХ
Согласно данных литературы в листьях бархата амурского содержится аскорбиновой кислоты 280 мг/% [172]. Что касается плодов бархата амурского, нами не найдено в доступной литературе количественного содержания аскорбиновой кислоты, имеются лишь указания на наличие аскорбиновой кислоты. В связи с этим и была поставлена задача разработки методики количественного определения аскорбиновой кислоты в плодах бархата амурского.
Согласно ГФ Х издания [37] количественное определение аскорбиновой кислоты в плодах шиповника проводят путем титрования раствором 2,6 – дихлорфенолиндофенолята натрия. Однако применение этого титранта приводит к получению недостаточно воспроизводимых и точных результатов анализа , что вызвано неустойчивостью окраски в оттитрованном растворе. Из физико – химических методов обычно используют фотоколориметрический, экстракционно – фотометрический, УФ – спектрофотометрический с хроматографией в тонком слое сорбента [67],[140].
Наше внимание привлекла методика количественного определения аскорбиновой кислоты в плодах шиповника методом ВЭЖХ [142а].
В качестве стандарта при определении использована аскорбиновая кислота фирмы (Sigma A – 5960). Объектами исследования служили плоды бархата амурского - черные блестящие костянки шаровидной или грушевидной формы от 7-8 мм в поперечнике, горькие. Плоды, собранные в сентябре, высушенные в проветриваемом, защищенном от света помещении до содержания влаги не более 18 %.
При подборе оптимальных условий экстракции аскорбиновой кислоты из плодов Бархата амурского было установлено, что оптимальный выход аскорбиновой кислоты наблюдается при измельчении сырья до 2 мм, экстрагент – 70 % этанол. Соотношение сырья и экстрагента 1:50, время экстракции 1 час 30 минут при комнатной температуре.
Полученные результаты были использованы при составлении методики количественного определения аскорбиновой кислоты в плодах бархата амурского.
Методика. Около 2,0 г (точная навеска) плодов, измельченных до размера частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 2 мм, помещают в коническую колбу вместимостью 250 мл, добавляют 60 мл 70 % этанола и взбалтывают на вибрационном аппарате в течение 1 часа. Затем извлечение фильтруют через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 100 мл, следя за тем, чтобы частицы сырья не попали на фильтр. В колбу, в которой проводили извлечение, добавляют 40 мл 70% этанола и извлекают на вибрационном аппарате в течение 30 мин. Извлечение фильтруют через тот же фильтр в ту же мерную колбу. Шрот и фильтр промывают 10 мл 70 % этанола и доводят объем раствора в колбе 70% этанолом до метки (испытуемый раствор А). 5 мл испытуемого раствора А фильтруют через микропористый фильтр с диаметром пор 0,45 мкм, отбрасывают первые 2 мл фильтрата. Фильтрат (испытуемый раствор Б) хроматографируют с помощью высокоэффективного жидкостного хроматографа не менее 5 повторностей при условиях описанных ниже:
По 10 мкл испытуемого раствора Б и раствора РСО аскорбиновой кислоты по отдельности вводят в жидкостной хроматограф высокого давления, укомплектованного системой градиентной подачи элюэнта,
УФ диодноматричным детектором или с перестраиваемой длиной волны, а так же компьютерной системой сборки и обработки данных;
Вычисляют площадь пика аскорбиновой кислоты стандартного раствора и площадь пика аскорбиновой кислоты испытуемого образца;
Получают не менее 5 хроматограмм для каждого раствора в следующих условиях: - колонка 250 4,6 мм, сорбент Kromosil 100 – 5С18 с размером частиц 5 мкм; - температура термостата 38 С; - длина волны детектирования 280нм; - подвижная фаза: ацетонитрил (А) / 0,01 % раствор фосфорной кислоты (В);
