Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы. 11
1.1. Лекарственные средства, обладающие адаптогенным действием 11
1.2. Характеристика фитоэкдистероидов 15
1.3. Ботаническая характеристика растений рода Serratula 19
1.4. Химический состав растений рода Serratula 21
1.5. Применение в медицине растений рода Serratula 23
Выводы к главе 1 25
Экспериментальная часть 26
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 26
2.1. Материалы исследования 26
2.2. Методы исследования 26
ГЛАВА 3. Фармакогностическая характеристика S. centauroidis травы
3.1. Запасы S. centauroidis травы в отдельных районах Республики Бурятия
3.2. Внешние признаки S. centauroidis травы 46
3.3. Анатомо-диагностические признаки S. centauroidis травы 49
3.4. Товароведческий анализ S. centauroidis травы 56
Выводы к главе 3 57
ГЛАВА 4. Качественный состав и количественное содержание биологически активных веществ в S. 60 centauroidis траве
4.1. Обнаружение групп биологически активных веществ в S. centauroidis траве качественными реакциями
4.2. Идентификация фенольных соединений методом высокоэффективной жидкостной хроматографии
4.3. Идентификация жирных кислот и компонентов эфирного масла методом газо-хромато-масс-спектрофотометрии
4.4. Идентификация витаминов группы В, аминокислот, органических кислот, свободных сахаров методом капиллярного электрофореза
4.5. Количественное определение аминокислот, аскорбиновой кислоты, белка, органических кислот, полисахаридов, дубильных веществ в S. centauroidis траве
4.6. Углеводный состав S. centauroidis травы 83
4.7. Элементный состав S. centauroidis травы 84
Выводы к главе 4 85
ГЛАВА 5 . Разработка показателей качества S. centauroidis травы
5.1. Разработка методики количественного определения суммы экдистероидов в пересчете на экдистерон в S. centauroidis траве
5.1.1. Обоснование методики количественного определения суммы экдистероидов в S. centauroidis траве
5.1.2. Оптимизация условий экстракции суммы экдистероидов в S. centauroidis траве
5.1.3. Валидация методики количественного определения суммы экдистероидов в S. centauroidis траве
5.2. Разработка методики количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на лютеолин-7-гликозид в S. centauroidis траве
5.2.1. Обоснование методики количественного определения суммы флавоноидов в S. centauroidis траве
5.2.2. Оптимизация условий экстракции суммы флавоноидов в S. centauroidis траве
5.2.3. Валидация методики количественного определения суммы флавоноидов в S. centauroidis траве
5.3. Исследование динамики накопления суммы экдистероидов в пересчете на экдистерон и суммы флавоноидов в пересчете на лютеолин-7-гликозид в различных органах и фазам вегетации S. centauroidis травы
Выводы к главе 5 110
ГЛАВА 6. Разработка S. centauroidis экстракта сухого и его стандартизация
6.1. Оптимизация условий экстрагирования S. centauroidis травы 111
6.2. Технологическая схема получения S. centauroidis экстракта сухого
6.3. Количественное определение биологически активных веществ в S. centauroidis экстракте сухом
6.4. Разработка показателей качества S. centauroidis экстракта сухого 126
Выводы к главе 6 136
Общие выводы 137
Список литературы
- Ботаническая характеристика растений рода Serratula
- Методы исследования
- Анатомо-диагностические признаки S. centauroidis травы
- Идентификация жирных кислот и компонентов эфирного масла методом газо-хромато-масс-спектрофотометрии
Ботаническая характеристика растений рода Serratula
Химический состав растений рода Serratula малоизучен, но наиболее полно изучен у S. coronata L. Главными биологически активными веществами у растений рода Serratula являются фитоэкдистероиды (до 2 %), обнаруженные у 7 видов: S. centauroides, S. algida, S. coronata, S. eructifolia, S. quinquefolia, S. sogdiana, S. tinctoria [1, 15, 104, 105, 136]. Основным компонентом фитоэкдистероидов является 20-гидроксиэкдизон (у S. coronata около 75 % от общей суммы), также содержатся 25S-инокостерон, -экдизон (редкостный пример обнаружения истинного гормона линьки в растениях), паностерол [1, 51, 80, 169]. Кроме этого обнаружены минорные экдистероиды – аюгастерон С, дакрихайнанстерон, полиподин В, таксистерон, макистероны А и С, витикостерон Е, интегристерон А, а также их эфиры и гликозиды [24, 136, 169].
Воробьевой А.Н. и др. исследовано наличие и характер распределения и динамика содержания 20-гидроксиэкдизона в надземных и подземных дальневосточных видов рода Serratula и Stemmacanta [27].
Содержание 20-гидроксиэкдизона в надземных и подземных органах S. centauroidis варьировало от 0,045 до 1,70 %. Максимальное количество отмечено в листьях (1,70 %), несколько меньше – в стеблях (1,40 %) и соцветиях (0,65 %). В надземных и подземных органах S. manshurica Kitag. в зависимости от органа и фазы развития растения содержание 20-гидроксиэкдизона варьировало от 0,012 до 1,80 %, максимальное содержание отмечено в молодых листьях (1,80 %) в вегетативную фазу и соцветиях (0,67 %) в период плодоношения. В надземных и подземных органах S. komarovii Iljin в зависимости от фазы развития содержание 20-гидроксиэкдизона варьировало от 0,001 до 0,47%, максимальное содержание его наблюдалось в активно развивающихся частях органов: в период развития генеративного побега – в листьях (0,3%), в период бутонизации – в верхней части стебля (0,29%), в период цветения – в обертке и хохолках (0,31 и 0,25%, соответственно), в период плодоношения – в семянках (0,47%). В надземной и подземной частях Stemmacanta uniflora L. Dittrich в зависимости от органа и фазы развития содержание 20-гидроксиэкдизона варьировало от 0,023 до 0,85%. Максимальное его количество наблюдалось в фазу бутонизации – в верхних частях стеблей (0,47%), в период цветения и плодоношения – в молодых листьях (0,85%) и к концу вегетационного периода – в семянках (0,57%). [27, 28, 50, 51, 103, 104, 105].
Также у растений рода Serratula содержатся моно- и сесквитерпеноиды, фитостерины, флавоноиды, циклитолы, ациклические полиацетиленовые соединения, а также фенольные гликозиды и эфиры высших жирных кислот установленной структуры. Выделен каучук. Обнаружены алкалоиды [103, 104, 105].
Растения рода Serratula издавна используются в народной медицине разных стран и народов. В последнее два десятилетия некоторые виды этого рода приобретают значение как лекарственные, витаминсодержащие, медоносные и кормовые растения [9, 138].
В народной медицине, в частности в практике у бурятских лам, отвар S. centauroidis использовался как кровоостанавливающее средство [41]. В тибетской медицине растение известно под названием Kon pa gab skye [41], в монгольской - Хонгор зуллиг Хонгорзалаа [38]. В эксперименте препараты из S. centauroidis обладают гемостатическим, анаболическим свойствами, а листья использовали как суррогат чая [9, 103, 104, 105].
В народной медицине применяются и другие растения этого рода. Так, отвар S. coronatae применяют при заболеваниях нервной системы: как противосудорожное при эпилепсии, бессоннице, повышенной нервной возбудимости, психических расстройствах. В прошлом его использовали при опухолях, грыже и геморрое. Настой корневищ применяли при болях в области желудка и расстройства желудочно-кишечного тракта [9, 103, 104, 105, 131]. Также экстракт S. coronatae в эксперименте на мышах оказывает противоопухолевый эффект и проявляет антистрессорную активность [6, 7, 8], спиртовой экстракт семян обладает антиоксидантными свойствами [65].
S. coronata (верхняя часть побегов, листья и соцветия) используется в фитотерапии как противовоспалительное средство. Препараты (экстракты, настои и отвары) обладают вяжущим, желчегонным, противорвотным, противолихорадочным и успокаивающим нервную систему седативным действием. Настой используется для полосканий полости рта и горла при ангинах и ларингитах, в качестве ранозаживляющего местного средства в виде примочек при ссадинах, порезах, гноящих ранах [34].
Стероиды S. sogdianae оказывают адаптогенное действие в эксперименте на мышах, повышают устойчивость организма к неблагоприятным факторам различного генезиса [123]. Экдистероид витикостерон Е S. sogdianae в эксперименте оказывает эстрогенную активность, обладает с экдистероном активностью гормонов линьки и являются инсектицидами для люцернового слоника, паутинного клеща, хлопковой тли и карадрины [105].
Надземная часть S. tinctoriae используется в виде ванн, в качестве детоксикационного средства при укусах бешеных собак, в вареном виде – корм для дойных коров [105].
Настой S. eructifoliae в тибетской медицине используется как гемостатическое, ранозаживляющее средство [32], настой соцветий – в виде ванн при скрофулезе, а отвар надземной части как анальгезирующее средство в народной медицине Урала [105].
Методы исследования
Аскорбиновая кислота. Около 2,0 г (точная навеска) измельченной пробы (1 мм) помещают в коническую колбу вместимостью 200 мл, приливают 50 мл воды очищенной и взвешивают с погрешностью ±0,01 г и экстрагируют на «вибрационном встряхивателе» в течение 1 часа при комнатной температуре. После экстракции колбу вновь взвешивают и доводят до первоначальной массы. Содержимое колбы фильтруют через бумажный фильтр в сухую колбу, отбрасывая первые 10 мл фильтрата (раствор А). К 5 мл раствора А прибавляют 20 мл спирта 95 %, перемешивают и фильтруют через бумажный фильтр (раствор Б).
10 мл раствора Б помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл доводят объем раствора водой до метки и перемешивают (раствор В).
В пробирки с притертыми пробками отмеривают: в 1-ю пробирку 5 мл раствора В, во 2-ю – 5 мл раствора Б СО аскорбиновой кислоты, в 3-ю – 5 мл воды. В каждую из пробирок прибавляют по 5 мл реактива Фреде и нагревают на кипящей водяной бане в течение 10 минут. Затем быстро охлаждают пробирки с содержимым под струей холодной воды и измеряют оптическую плотность испытуемого раствора на спектрофотометре при длине волны 825 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм.
Параллельно в тех же условиях измеряют оптическую плотность раствора Б СО аскорбиновой кислоты. В качестве раствора сравнения используют раствор, содержащий 5 мл воды и 5 мл реактива Фреде.
Содержание аскорбиновой кислоты в абсолютно сухом сырье в процентах (Х) вычисляют по формуле: где: D – оптическая плотность испытуемого раствора; D0 – оптическая плотность раствора Б СО аскорбиновой кислоты, m – навеска сырья, г, m0 – навеска СО аскорбиновой кислоты, г, W – влажность сырья, %. Белок. Определение белка проводили согласно методу 3 «Метод Бредфорда» в ОФС 1.2.3.0012.15 «Определение белка» [86].
Около 1,0 г (точная навеска) измельченного сырья помещают в круглодонную колбу вместимостью 100 мл, приливают 50 мл воды очищенной и взвешивают с погрешностью ±0,01 г и экстрагируют на «вибрационном встряхивателе» в течение 1 часа при комнатной температуре. После экстракции колбу вновь взвешивают и доводят до первоначальной массы. Содержимое колбы фильтруют через бумажный фильтр в сухую колбу, отбрасывая первые 10 мл фильтрата (раствор А).
В 3 пробирки вместимостью по 15 мл, помещают по 5 мл реактива Бредфорда; в 1 пробирку прибавляют 0,1 мл раствора А (испытуемый раствор), во 2 – 0,1 мл воды, в 3 – 0,1 мл раствора СО альбумина. Тщательно перемешивают, переворачивая. Избегают образование пены, приводящей к плохой воспроизводимости. Выдерживают при комнатной температуре в течение 10 мин и измеряют оптическую плотность испытуемого раствора на спектрофотометре при длине волны 595 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм.
Параллельно в тех же условиях измеряют оптическую плотность раствора СО альбумина. В качестве раствора сравнения используют раствор, содержащий 0,1 мл воды и 5 мл реактива Бредфорда. Содержание белка в абсолютно сухом сырье в процентах (Х) вычисляют по формуле: где Dj - оптическая плотность испытуемого раствора; D0 - оптическая плотность раствора СО альбумина; т - навеска сырья, г; т0 - навеска СО альбумина, г; W - влажность сырья, %. Органические кислоты. Количественное определение суммы органических кислот проводили по методике, описанной в ГФ XI изд., вып. 1, ст. 38 «Плоды шиповника» [37].
Содержание свободных органических кислот в пересчете на яблочную кислоту в абсолютно сухом сырье в процентах (Х) вычисляют по формуле: V -0,0067 -250 -100 -100 X = /и-10-(100-Ж) где 0,0067 - количество яблочной кислоты, соответствующее 1 мл натрия гидроксида раствора 0,1 М; V – объем натрия гидроксида раствора 0,1 М, пошедшего на титрование, мл; m – навеска сырья, г; W – влажность сырья, %; Полисахариды. Для количественного определения суммы водорастворимых полисахаридов использовали гравиметрический метод определения полисахаридов из ГФ XIII, том 2, ОФС 2.5.0032.15 «Подорожника большого листья» [95]. Содержание полисахаридов в абсолютно сухом сырье в процентах () вычисляют по формуле: где m1 – вес фильтра, г; m2 – вес фильтра с осадком, г; m – навеска сырья, г; W – влажность сырья, %. Сумма полисахаридов и свободных сахаров. Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм.
Около 1,0 г (точная навеска) измельченного сырья помещают в коническую колбу вместимостью 250 мл, прибавляют 40 мл спирта 70 %, 0,3 г кальция карбоната и нагревают на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 30 минут. Горячее извлечение сливают через бумажный фильтр, следя за тем, чтобы частицы сырья оставались в колбе. Колбу с сырьем промывают дважды, используя по 10 мл спирта 70 %, извлечения сливают. Операцию экстрагирования повторяют с 30 мл спирта 70 %, оставшиеся на фильтре частицы сырья аккуратно смывают экстрагентом обратно в колбу, время нагревания 15 минут, извлечение сливают, сырье в колбе снова промывают дважды, используя по 10 мл того же экстрагента. Далее в колбу с сырьем приливают 40 мл воды и нагревают на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 30 минут, охлаждают при комнатной температуре в течение 5 минут. Извлечение фильтруют под вакуумом через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 100 мл, следя за тем, чтобы частицы сырья не попали на фильтр. Колбу с сырьем промывают 10 мл воды, извлечение фильтруют в ту же колбу. Экстракцию повторяют с 30 мл воды, время нагревания 15 минут. Переносят сырье на фильтр, промывают коническую колбу два раза, используя по 10 мл воды. Доводят объем раствора до метки, перемешивают (раствор А).
20 мл раствора А помещают в круглодонную колбу, прибавляют 5 мл кислоты хлористоводородной и кипятят на плитке в течение 10 минут, используя обратный холодильник. К полученному извлечению прибавляют натрия гидроксида раствор 40 % до получения раствора с pH 4,0-4,5. Раствор количественно переносят в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводят объем раствора в колбе водой до метки, перемешивают. Извлечение фильтруют через бумажный фильтр, отбрасывают первые 10-15 мл фильтрата (раствор Б).
В три конические колбы вместимостью 50 мл помещают по 2,5 мл пикриновой кислоты раствора 1 %, затем по 7,5 мл натрия карбоната раствора 20%. В первую колбу прибавляют 5 мл раствора Б испытуемого раствора, во вторую-5 мл воды (раствор сравнения), в третью-5 мл раствора СО глюкозы. Колбы с содержимым погружают на 10 минут в кипящую водяную баню, затем охлаждают до комнатной температуры. Содержимое количественно переносят в мерные колбы вместимостью 25 мл, доводят объем растворов до меток водой и перемешивают.
Оптическую плотность испытуемого раствора и раствора СО глюкозы измеряют относительно раствора сравнения при длине волны 470±2 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм.
Анатомо-диагностические признаки S. centauroidis травы
Таким образом, по результатам исследования следует, что основную массу сырья составляют листья от 33,33 % до 43,86 %, цветки от 25,00 % до 31,25 %, стебли от 29,82 % до 41,67 %.
Внешние отличительные признаки определяли для цельного сырья, измельченного сырья и порошка S. centauroidis травы. Анализ образцов проводили путем визуального осмотра, с помощью лупы и бинокуляра. Цельное сырье. Цельные или частично измельченные цветоносные, олиственные до верхушки стебли длиной не более 50 см. Стебли простые или разветвленные, цилиндрические, бороздчатые, более или менее опушены. Листья очередные и расставленные, перисторассеченные или перистораздельные, крупнозубчатые, 1,5 – 13 см длиной и 1 – 6 см шириной, голые или слабоопушенные с резко выступающими жилками на нижней стороне листа. Цветки одиночные или в виде корзинок, яйцевидные, 1 – 3 см шириной и длиной до 4 см.
Цвет стеблей – зеленовато-желтого до зеленого, иногда с красными прожилками; листьев – от светло-зеленого до темно-зеленого, снизу более светлый; цветков – от лилового до фиолетового. Запах слабый, специфический. Вкус водного извлечения горький.
Измельченное сырье. Смесь кусочков стеблей, листьев и цветков различной формы, проходящих сквозь сито с отверстиями 7 мм. Цвет от светло-зеленого до зеленого с желтовато-белыми, светло-желтыми, желтовато-зелеными, светло-коричневыми фиолетовыми вкраплениями. Запах слабый, специфический. Вкус водного извлечения горький.
Порошок. Смесь кусочков стеблей, листьев и цветков, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 2 мм. Цвет от светло-зеленого до зеленого с желтовато-белыми, светло-желтыми, желтовато-зелеными, светло-коричневыми фиолетовыми вкраплениями. Запах слабый, специфический. Вкус водного извлечения горький.
Стебель: Для исследования стебля использованы поперечный и продольные срезы. При рассмотрении поперечного среза стебля S. centauroidis травы видно, что стебель имеет пучковый тип строения. Пучки открытые коллатеральные. Стебель покрыт однорядным слоем эпидермиса. За эпидермисом располагаются пучки колленхимы, расположенные равномерно по кругу, которые чередуются с пучками клеток с содержимым (чечевички), которые образуют небольшие ребра стебля. Также в состав первичной коры входит основная паренхима, образованная крупными округлыми клетками в несколько рядов, за которой следует слой эндодермы. Далее располагается склеренхима, механическая ткань, состоящая из плотно сомкнутых толстостенных клеток с сильно одревесневшими стенками, к которой примыкает флоэма. К центру располагаются сосуды ксилемы, а между флоэмой и ксилемой тонкий слой камбия. В центре стебля расположены клетки сердцевины, состоящие из крупных округлых паренхимных клеток (рисунок 3).
На продольных срезах видно, что эпидермис сердцевины стебля представлен клетками прямоугольной формы с прямыми и утолщенными стенками. На поверхности стебля встречаются редкие простые многоклеточные волоски с утолщенной стенкой и с многоклеточным основанием (рисунок 4).
Листья: Поверхность листа рассматривали с верхней и нижней стороны. При просмотре листа с верхней и нижней стороны видны многоугольные клетки эпидермиса с прямыми утолщенными стенками с легкой морщинистой кутикулой; устьица овальные, окруженные 2 – 6 клетками эпидермиса (аномоцитный тип), расположенные на уровне эпидермальных клеток. На обеих сторонах листа расположены крупные овальные эфиромасличные железки с поперечной перегородкой, сидящие в углублениях.
На верхнем и нижнем эпидермисе листа имеются волоски трех типов: простой многоклеточный с тонкими стенками, бичевидный многоклеточный волосок с утолщенными клетками у основания и простой многоклеточныйс сильно утолщенным многоклеточным основанием. Иногда волоски могут быть заполнены коричневым содержимым. В местах прикрепления волосков клетки эпидермиса образуют розетку (рисунки 5 – 6).
Лепесток цветка S. centauroidis травы: А – фрагмент лепестка (150х); Б, В, Г – фрагмент эпидермиса венчика цветка: 1 – проводящие сосуды, 2 – клетки эпидермиса (250х); Д – пыльца (250х). Таким образом, впервые установлены основные анатомо диагностические признаки для S. centauroidis травы: клетки эпидермиса многоугольные с прямыми утолщенными стенками с легкой морщинистой кутикулой; устьица овальные аномоцитного типа, крупные овальные эфиромасличные железки с поперечной перегородкой, имеются волоски трех типов: простой многоклеточный с тонкими стенками, бичевидный многоклеточный волосок с утолщенными клетками у основания и простой с сильно утолщенным многоклеточным основанием; пучковое строение стебля, наличие редких простых многоклеточных волосков; клетки эпидермиса чашелистика продольно вытянутые, стенки прямые утолщенные, устьица овальные аномоцитного типа, на поверхности чашелистика встречаются два типа волоска: многочисленные простые одноклеточные и булавовидные волоски и их фрагменты; клетки эпидермиса лепестка извилистые, толстостенные, прямоугольные, кутикула ровная, устьицы не обнаружены, у основания имеются сосочковидные выросты, проводящие спиралевидные пучки, пыльца трехбороздная округлой или округло-трехгранной формы с шероховатой поверхностью и тремя порами.
Идентификация жирных кислот и компонентов эфирного масла методом газо-хромато-масс-спектрофотометрии
Ранее нами проведены исследования по обнаружению БАВ в S. centauroidis траве с помощью химических реакций и методом бумажной хроматографии [29, 37, 58, 111, 135, 139, 146]. В результате проведенных исследований обнаружены такие биологически активные вещества как аминокислоты, аскорбиновая кислота, арбутин, полисахариды, флавоноиды, дубильные вещества, кумарины, углеводы, сапонины и следы алкалоидов [75]. На хроматограммах выявлены 15 зон фенольных соединений, которые в УФ-свете обладают собственной флуоресценцией желтого, зеленого, коричневого, голубого и фиолетового цвета. Из обнаруженных 15 зон 6 отнесено к веществам флавоноидного характера, 9 - к фенолкарбоновым кислотам. Методом двумерной бумажной хроматографии идентифицированы два вещества флавоноидного характера - лютеолин (Rfl = 0,06; RG = 0,84) и лютеолин-7-гликозид (Rfl = 0,16; Re = 0,45), одну фенолкарбоновую кислоту - галловая кислота (Rfl = 0,47; Rn = 0,80).
Качественное определение экдистероидов. На линию старта аналитической хроматографической пластинки со слоем силикагеля с флуоресцентным индикатором на алюминиевой подложке размером 7 x 15 наносили 10 мкл испытуемого раствора и 5 мкл раствора СО экдистерона. Пластины выдерживали в течение 15 минут до полного высыхания, затем помещали в предварительно насыщенные камеры и хроматографировали восходящим способом, используя в качестве подвижных фаз системы растворителей 1, 2, 3, 4, 5. Когда фронт растворителей пройдет около 80 - 90 % длины пластинки от старта ее вынимали из камеры, сушили на воздухе в течение 15-20 минут до исчезновения запаха растворителя и просматривали окраску пятен в УФ 61 свете. Затем обрабатывали ванилин-серным реактивом, прогревали в сушильном шкафу при 105-110C и наблюдали изменение окраски пятен.
На хроматограмме раствора СО экдистерона обнаруживали зону адсорбции желто-зеленого цвета (Rf = 0,39). На хроматограмме испытуемого раствора обнаруживали зону адсорбции желто-зеленого цвета на уровне зоны на хроматограмме раствора СО экдистерона. Наилучшее разделение зон адсорбции наблюдалось при использовании системы 4. Допускается обнаружение других зон адсорбции. Качественное обнаружение арбутина
На линию старта аналитической пластинки со слоем силикагеля с флуоресцентным индикатором на алюминиевой подложке размером 7 x 15 наносили 10 мкл испытуемого раствора и 10 мкл раствора СО арбутина. Пластину высушивали на воздухе и помещали в камеру с системой растворителей 6 и хроматографировали восходящим способом. После того как фронт растворителей проходил около 80 – 90 % длины пластинки от линии старта, хроматограмму вынимали, высушивали на воздухе и обрабатывали последовательно натрия гидроксида спиртовым раствором 0,5 % и свежеприготовленным диазореактивом, высушивали и прогревали в сушильном шкафу при 105C в течение 10 минут и просматривали при дневном свете.
На хроматограмме раствора СО арбутина обнаруживается доминирующая зона адсорбции ярко-оранжевого цвета (Rf = 0,40). На хроматограмме испытуемого раствора обнаруживается доминирующая зона адсорбции ярко-оранжевого цвета на уровне зоны на хроматограмме раствора СО арбутина. Допускается наличие других пятен. Качественное определение аминокислот Около 1,0 г сырья, измельченного до величины частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями размером 1 мм, помещают в коническую колбу со шлифом вместимостью 50 мл, прибавляют 10 мл воды, нагревают на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 30 минут после охлаждения до комнатной температуры полученное извлечение фильтруют через бумажный фильтр (испытуемый раствор).
На линию старта аналитической пластинки со слоем силикагеля с флуоресцентным индикатором на алюминиевой подложке размером 7 х 15 см наносили 10 мкл испытуемого раствора и по 5 мкл растворов СО аминокислот: глицин, лейцин, аланин, валин, аргинин, аспарагин. Пластинку с нанесенными пробами высушивают на воздухе, затем помещали в хроматографическую камеру с системой растворителей 7 и хроматографировали восходящим способом. Когда фронт растворителей пройдет около 80 – 90 % длины пластинки от линии старта, ее вынимали, сушили на воздухе в течение 10 – 15 минут. Обрабатывали хроматограмму нингидрина раствором 0,1 %, затем нагревали в сушильном шкафу при температуре 100 – 105C в течение 10 минут.
На хроматограмме растворов СО аминокислот обнаруживаются 6 зон адсорбции светло-фиолетового или фиолетового цвета: глицин (Rf = 0,40); лейцин (Rf = 0,64); аланин (Rf = 0,36); валин (Rf = 0,50); аргинин (Rf = 0,06); аспарагин (Rf = 0,34).
На хроматограмме испытуемого раствора обнаруживаются три зоны адсорбции светло-фиолетового или фиолетового цвета на уровне зон адсорбции СО глицина, СО лейцина и СО аланина.