Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Ботаническая характеристика, химический состав и применение девясила иволистного в народной медицине 14
1.1 Краткая ботаническая характеристика девясила иволистного 14
1.2 Химический состав девясила иволистного 16
1.3 Фармакологические свойства и применение девясила иволистного в народной медицине 19 Выводы по главе 1 23
Глава 2 Объекты и методы исследования 25
2.1 Характеристика объектов исследования 25
2.2 Методы фитохимического исследования 25
2.2.1 Приготовление водных экстрактов для проведения качественных реакций 26
2.2.2 Углеводные производные 26
2.2.3 Азотсодержащие соединения 27
2.2.4 Дубильные вещества 30
2.2.5 Органические кислоты 31
2.2.6 Приготовление спирто-водных извлечений и фракционирование природных соединений органическими растворителями 32
2.2.7 Кумарины 32
2.2.8 Фенолкарбоновые кислоты 33
2.2.9 Флавоноиды 33
2.2.10 Изучение фенольных соединений методом ВЭЖХ 34
2.2.11 Тритерпеновые соединения 35
2.2.12 Приготовление гекановых извлечений з
2.2.13 Каротиноиды 37
2.2.14 Изучение липофильной фракции 38
2.2.15 Эфирное масло 38
2.2.16 Изучение минерального состава 41
2.3 Методы изучение полисахаридов 41
2.3.1 Выделение полисахаридов 41
2.3.2 Кислотный гидролиз 44
2.3.3 Хроматографический анализ 44
2.3.4 Количественное определение моносахаридного состава полисахаридных комплексов 45
2.3.5 Количественное определение функциональных групп пектиновых
веществ 46
2.4 Определение числовых показателей 47
2.4.1 Определение влажности 47
2.4.3 Определение экстрактивных веществ 48
2.5 Морфолого-анатомические исследования 48
2.6 Методы токсико-фармакологических исследований 48
2.6.1 Изучение острой токсичности 49
2.6.2 Изучение отхаркивающего действия 49
2.6.3 Изучение противовоспалительной активности 50
2.6.4 Изучение антимикробной активности 52
2.7 Статистическая обработка результатов эксперимента 53
ГЛАВА 3 Изучение биологически активных веществ девясила иволистного 54
3.1 Углеводные производные 54
3.2 Азотсодержащие соединения 55
3.2.1 Азотистые основания 55
3.2.2 Определение аминокислот 57
3.3 Дубильные вещества 59
3.3.1 Качественное обнаружение 59
3.3.2 Количественное определение 60 3.4. Органические кислоты 60
3.4.1 Качественное обнаружение 60
3.4.2 Количественное определение свободных органических кислот 61
3.4.3 Количественное определение аскорбиновой кислоты 61
3.5 Кумарины 61
3.6 Фенолкарбоновые кислоты 62
3.7 Флавоноиды 63
3.7.1 Качественно определение 63
3.8 Изучение фенольных соединений травы и корневищ с корнями девясила ивлоистного методом ВЭЖХ 63
3.9 Тритерпеновые соединения 66
3.9.1 Качественное обнаружение 67
3.9.2 Количественное определение тритерпеновых соединений 67
3.10 Каротиноиды 68
3.11 Изучение липофильной фракции методом газовой хроматографии-масс-спектрофотометрии 68
3.12 Эфирное масло 71
3.13 Сесквитерпеновые лактоны 71
3.14 Минеральный состав растения 72
3.15 Изучение углеводов 74
3.15.1 Выделение полисахаридов 75
3.15.3 Исследование углеводных производных 76
Выводы по главе 3 82
ГЛАВА 4 Стандартизация травы и корневищ и корнями девясила иволистного 86
4.1 Разработка характеристик подлинности сырья «Трава девясила иволистного» 86
4.1.1 Исследование морфологических признаков травы девясила иволистного 86
4.1.2 Характеристика микродиагностических признаков травы девясила иволистного 87
4.1.3 Исследование морфологических признаков корневищ с корнями девясила иволистного 96
4.1.4 Характеристика микродиагностических признаков корневищ с корнями девясила иволистного 97
4.2 Числовые показатели 99
4.2.1 Определение влажности 99
4.2.2 Определениме золы 99
4.2.3 Определение экстрактивных веществ 100
4.3 Разработка методик качественного и количественного опреления
действующих веществ травы и корневищ с корнями девясила иволистного 101
4.3.1 Разработка методик качественного и количественного определения суммы фруктозанов в корневищах с корнями девясила иволистного 101
4.3.2 Стандартизация травы девясила иволистного по содержанию суммы флавоноидов 115
4.3.3 Разработка методики количественного определения суммы фенольных соединений 128
4.3.4 Количественное определение сесквитерпеновых лактонов 138
Выводы по главе 4 132 ГЛАВА 5 Изучение фармакологической активности девясила иволистного 136
5.1 Изучение острой токсичности 136
5.2 Изучение отхаркивающего действия 137
5.3 Изучение противовосполительной активности 138
5.3.1 Влияние на процессы экссудации 139
5.3.2 Влияние на пролиферацию 140
5.3.3 Влияние на прогицаемость каппиляров у кроликов 142
5.4 Изучение антимикробной активности 143
Выводы по главе 5 145
Выводы 147
Список литературы 1
- Химический состав девясила иволистного
- Приготовление спирто-водных извлечений и фракционирование природных соединений органическими растворителями
- Азотистые основания
- Характеристика микродиагностических признаков корневищ с корнями девясила иволистного
Химический состав девясила иволистного
Род Inula L. входит в состав обширного семейства Астровые (Asteraceae), включающего 24000 видов, объединяющихся в 1200 родов. Представители семейства обитают во всех климатических зонах и являются наиболее обширными в мировой флоре. На территории России произрастают только многолетние и однолетние травы; древовидные и кустарниковые формы присущи тропической флоре [164].
Род Inula L. впервые выделен и описан Карлом Линнеем. Растения данного рода представлены преимущественно многолетними, редко двулетними и однолетними травянистыми растениями.
Стебель равномерно олиственный. Листья простые, цельные: листорасположение очередное. Цветочные корзинки полушаровидные, одиночные или большей частью многочисленные, собранные в щитковидные или иногда головчатые соцветия. Обертка состоит из многочисленных черепитчато расположенных листочков, большей частью неравных, внутрь постепенно увеличивающихся, редко равных, острых: наружные листочки травянистые ланцетные, линейно-ланцетные, яйцевидные, яйцевидно-треугольные или продолговатые, иногда с ромбической, или продолговато-яйцевидной, или округло-лопатчатой верхушкой; средние - часто кожистые, продолговато ланцетные, ланцетные, лопатчатые, ложковидные, линейно-ланцетные, редко линейные; внутренние – пленчатые, линейные, линейно-ланцетные, шиловидные или нитевидные, изредка на конце фиолетовые или красноватые; наружные и средние листочки по всей поверхности, а внутренние в верхней части или только от середины, большей частью опушенные белыми, бурыми или черноватыми волосками или реснитчатые, иногда покрытые железками; цветоложе плоское или может быть выпуклое, ямчатое или ячеистое, голое или бахромчатое. Срединные цветки (цветки диска) ворончато-трубчатые, обоеполые, желтые, (у I. vulgaris буроватые) многорядные. Краевые цветки (цветки луча) пестичные, язычковые, желтые (у I. vulgaris красноватые), расположенные в один ряд, в полтора – два раза превышают обертку, большей частью с длинными язычками, которые редко немного длиннее обертки или равны ей, или с маленькими язычками, или язычки не развиваются и краевые цветки тогда нитевидно-трубчатые. Плодоножки в основании стреловидные с двумя длинными, реже короткими нитевидными рассечено-реснитчатыми придатками. Язычковые цветки очень редко с тремя-четырьмя стаминодиями. Лопасти рыльца на конце расширенные, тупые, ворсинчатые. Семянки все одинаковые, призматические или цилиндрические, четырехгранные или ребристые, гладкие или покрытые по всей поверхности или только в верхней части короткими вверх прижатыми прямыми волосками или редко в верхней части рассеянными железками. Хохолок из однорядных, большей частью многочисленных, немного неравных щетинок, мелко вверх зазубренных, часто сросшихся основаниями [122,164].
Всего в роде насчитывается около 100 видов, распространенных в Европе, Азии и Африке. В странах СНГ произрастает 32 вида этого рода [122,164]. Девясил иволистный – Inula salicina L. – многолетнее, голое или почти голое травянистое растение высотой 30-60 см. Стебель прямостоячий, равномерно облиственный, преимущественно в нижней части с рассеянными, длинными при основании, неутолщенными волосками. Листья ланцетные, 8-12 см длиной и 2-3 см шириной, плотные (почти кожистые), отстоят от стебля почти под прямым углом. Цветочные корзинки довольно крупные, диаметром до 2,5 см. Обертка многорядная с кожистыми голыми листочками, реснитчатыми по краю, в верхней части красновато-фиолетовыми, кнаружи постепенно уменьшающимися.
Наружные листочки яйцевидные, яйцевидно-ланцетные или ланцетные с ромбической, треугольно-яйцевидной или продолговато-яйцевидной зеленой верхушкой, длинно-заостренной и часто отогнутой. Внутренние листочки линейные, 1 см длиной и 0,8-1,0 см шириной, на 1/3 длиннее наружных, в верхней части коротко прижатоволосистые. Цветки желтые: краевые – ложноязычковые, женские; срединные – трубчатые, обоеполые. Плоды – цилиндрические ребристые семянки, как и завязи, голые, тонкоребристые, с хохолком из многочисленных щетинок. Цветет в июне – сентябре, семянки созревают в июле – октябре [84].
Широко распространенный в Евразии вид в том числе произрастает во многих районах России: Европейской части, Западной и Восточной Сибири, а также на Дальнем Востоке [174]. В Средней России встречается во всех областях, чаще в долинах рек [84].
Девясил иволистный, наряду с другими видами данного рода, известен прежде всего как растение, содержащее терпеноиды, фенольные соединения и инулин.
Эфирное масло выделено как из подземной, так и из надземной частей девясила иволистного. Содержание эфирного масла в нем колеблется от 0,06% (надземная часть) до 2,6% (подземная часть) [70].
Особенностью эфирного масла растений рода девясил, в том числе и девясила иволистного, является наличие в их составе специфических сесквитерпеновых лактонов – алантона, изоалантолактона, которые обнаружены в его подземной части [194]. В.П. Махлаюк указывает на наличие в надземной части девясила иволистного эфирного масла, содержащего геленин [125]. Химический состав девясила иволистного представлен в таблице 1. Таблица 1 - Химический состав девясила иволистного
Часть растения Выделенные соединения Литература Надземная часть Эфирное масло - 0,06%: геленин;Сесквитерпеноиды: у-лактоны; Дубильные вещества; Флавоноиды - 6,4 мг/кг; Кумарины - 0,16%; Алкалоиды - следы
Подземная часть Эфирное масло -2,6%;Сесквитерпеноиды:алантолактон;изоалантолактон;Тритерпеноиды:фриделин;Стероиды:р-ситостерин;Полисахариды:инулин - до 52%;Алкалоиды - 0,06%;Полиацетиленовые соединения:винилпентаацетилен;Ароматические соединения:метиловый эфир - 7-изобутирилокситимола -0,18%;диметиловый эфир - 7-изобутирилокситимола -0,11%. Цветки Тритерпеноиды;Флавоноиды мг/кг:апигенин;гиперозидОксикоричные кислоты:кофейная;хлорогеновая. [193]
При исследовании флоры Средней Азии на наличие лактонов У. Рахманкуловым с соавторами были получены результаты, которые показали, что в одном и том же растении синтезируется только одна группа лактонов (у или є-лактоны), в частности, в надземной части девясила иволистного в период цветения обнаружены у-лактоны [132].
При исследовании этилацетатной фракции, полученной из корней девясила иволистного в аппарате Сокслета с последующей колоночной хроматографией на силикагеле норвежскими учеными были получены две монотерпеновые фракции при использовании в качестве элюэнта: петролейный эфир-диэтиловый эфир (4:1). Очистку и разделение полученных фракций проводили методом тонкослойной хроматографии на силикагеле. В результате ими были выделены ароматические соединения: метиловый эфир 7-изобутирилокситимола (0,18%) и диметиловый эфир 7-изобутирилокситимола (0,11%) [179]. В 1971 году из этилацетатной фракции корней выделены тритерпеноиды (фриделин) и стероиды (Р-ситостерин) [179].
В цветках девясила иволистного установлено наличие тритерпенов [144]. Для подземных органов растения рода Девясил характерно наличие полисахаридов, производных фруктозанов, в том числе и инулина. В девясиле иволистном инулин обнаружен в корневищах с корнями и его содержание достигает до 52% [138].
Наряду с тритерпеноидами и инулином у девясила иволистного обнаружено значительное количество фенольных соединений. Фенольные соединения представлены оксикоричными кислотами, флавоноидами, дубильными веществами, кумаринами (таблица 1). Было изучено распространение флавоноидов в некоторых видах растений родов Девясил и Василек, семейства Астровых [192]. Объектами исследований были выбраны цветки как краевые, так и серединные, из которых получали метанольные извлечения. Эти извлечения исследовали методом хроматографии в тонких слоях сорбента на пластинках с силикагелем в различных системах растворителей. В результате было установлено, что характерной отличительной чертой рода Inula является наличие флавонового гидроксилирования по Р-кольцу. Так, в цветках девясила иволистного был найден апигенин. Из гликозидов флавоноидов идентифицирован гиперозид. При определении количественного содержания гиперозида установлено, что в цветках девясила иволистного он накапливается в минимальных количествах [192].
Приготовление спирто-водных извлечений и фракционирование природных соединений органическими растворителями
Антиэкссудативные свойства оценивали на модели острого воспалительного отека, вызванного субплантарным введением в заднюю лапу мыши 0,1 мл 2,5% водного раствора формалина [145].
В опыт брали две группы мышей массой 18-20 г. Одной из них за 2 часа до введения формалина, а затем через 5 часов и 18 часов после него вводили внутрижелудочно различные фитокомплексы изучаемого растения. Настой и отвар готовили в соотношении 1:10 и вводили в дозе 1 г/кг (в пересчете на сухое сырье) массы тела (в объеме 0,2 мл на 20 г массы животного), водорастворимые полисахаридные комплексы вводили в дозе 100 мг/кг (в объеме раствора 0,2 мл на 20 г массы животного). Мышам второй группы в те же сроки применяли воду очищенную. Воспаление вызывали путем впрыскивания в мышцу бедра одной из задних лапок 0,05 мл раствора формалина 2,5%. Через 24 часа после введения формалина мышей забивали и у них отрезали воспаленные и невоспаленные задние лапки на уровне тазобедренного сустава. О выраженности воспалительного отека судили по приросту веса воспаленных лапок, который определяли по разнице в весе между воспаленными и невоспаленными лапками; о противовоспалительном действии изучаемых фитокомплексов - по разнице между величиной отека лапы, вызванного формалином у контрольных животных и мышей, получавших изучаемые фитокомплексы. Препаратом сравнения служил отвар корневищ с корнями девясила высокого в дозе 1 г/кг [145].
Влияние на пролиферацию Антипролиферативные свойства исследуемых фитопрепаратов изучали на модели "ватной гранулемы" у беспородных белых крыс массой 180-220 г [145].
У крыс, находящихся под легким эфирным наркозом, в области спины тщательно выстригали шерсть и в асептических условиях делали разрез кожи и подкожной клетчатки длиной 1-2 см. Затем пинцетом через образовавшийся разрез кожи в подкожной клетчатке формировали полость, куда помещали предварительно простерилизованный ватный шарик массой 25 мг, после чего накладывали 1-2 шва. Через 7 дней, на протяжении которых внутрижелудочно вводили исследуемые водные извлечения (настой и отвар) в соотношении 1:10 в дозе 1 г/кг массы тела в пересчете на сухое сырье (1 мл), сумму полисахаридов в дозе 100 мг/кг массы животного, имплантированный шарик с образовавшейся вокруг него грануляционной тканью извлекали и высушивали до постоянной массы при t 55-60С. Массу образовавшейся грануляционно-фиброзной ткани определяли по разнице между массами высушенной гранулы и имплантированного ватного шарика. Препарат сравнения отвар корневищ с корнями девясила высокого и воду очищенную (контроль) вводили в аналогичных условиях. Изучение капилляроукрепляющего действия Антифлогистическую активность указанных фитокомплексов (настоя и отвара в дозе 1 г/кг (в пересчете на сухое сырье), водорастворимых полисахаридных комплексов в дозе 100 мг/кг) определяли при моделировании локальной воспалительной реакции с помощью ксилола на кроликах-альбиносах массой 3,0-3,5 кг [22,133].
У кроликов предварительно выстригали шерсть на коже живота. Фитокомплексы вводили внутримышечно за час до введения индикатора проницаемости, роль которого выполнял раствор трипановой сини. Трипановую синь вводили в краевую вену уха в виде раствора 1 % на растворе натрия хлорида 0,9 % из расчета 2 мл на 1 кг массы животного. Длительная циркуляция краски в кровеносном русле позволяет изучить нарушение проницаемости капилляров в течение нескольких часов после ее введения. Показателем проницаемости капилляров служило время появления на коже сине-окрашенных пятен и их диаметр. По разнице во времени появления пятен и их диаметру до и после введения фитокомплекса судили о его действии на проницаемость капилляров.
Изучение антимикробной активности водных извлечений из изучаемого растения проводили на кафедре микробиологии КГМУ под руководством кандидата медицинских наук, доцента О.Д. Печенина. Исследованы настои из травы и отвар из корневищ с корнями в соотношении 1:10, на антибактериальную активность в отношении стандартного набора индикаторных штаммов микроорганизмов. Антибактериальное действие водных извлечений из исследуемых видов сырья девясила определяли методом внесения их на питательную среду с последующим посевом микробов на поверхность агара [30,53,77,87,160].
Для этого из исследуемых водных извлечений готовили различные разведения в стерильном расплавленном и остуженном до 50 С питательном агаре. Содержимое после перемешивания заливали в стерильные чашки Петри и оставляли при комнатной температуре. После застывания агара чашки делили на сектора. Каждый сектор засевали штриховым методом взвесью суточных культур, содержащей 100 млн. микробных тел в 1 мл, в количестве одной бактериологической петли. Контролем являлись посевы тех же бактерий на питательные среды, не содержащие испытуемых фитокомплексов. Посевы инкубировали в термостате при температуре +37С. Результаты эксперимента учитывали через 24 часа для исследуемых микроорганизмов и 48 часов (для грибов рода Candida). При этом регистрировали интенсивность роста колоний микроорганизмов (сильный рост, слабый рост) или его отсутствие. Антимикробную активность выражали в мкг/мл, в пересчете на действующие вещества и воздушно-сухое сырье, из которого приготовлено водное извлечение [109,136].
Азотистые основания
Исследование морфологических признаков травы девясила иволистного проводили по гербарным образцам и по свежесобранным растениям. Исследование проводили в соответствии со статьей ГФ XI «Herba» [глава 2, раздел 2.5] [40,64,116,130].
В результате установлены морфологические признаки травы: Сырье представляет собой верхние части стеблей длиной до 30 см с цветками и листьями, продольно-бороздчатые, голые или иногда опушенные рассеянными волосками. Листья очередные, кожистые, блестящие, голые, отклоненные от стеблей почти под прямым углом, с выдающимися на нижней стороне жилками, покрытые короткими рассеянными щетинками, цельнокрайние или по краям с редкими зубчиками и маленькими густыми шипиками. Нижние листья яйцевидные или продолговато-яйцевидные длиной до 10 см, шириной 3 см, наверху округлые, в основании суженные, средние и верхние – продолговатые или продолговато-ланцетные, длиной до 5 см и шириной 1,5 см или узколанцетные длиной до 5 см длиной и шириной 0,8 см, заостренные, сидячие, в основании полустеблеобъемлющие с усиками. Цветочные корзинки диаметром 2,5 – 4 мм, одиночные или по 2-5 в щитке. Снаружи корзинки покрыты оберткой, листочки обертки голые, по краю реснитчатые, в верхней части красновато-фиолетовые. Наружные листочки ланцетные или яйцевидно-ланцетные, в верхней части с ромбической или продолговато-яйцевидной, в основании суженной зеленой верхушкой, длинно заостренной и отогнутой; внутренние листочки линейные, немного длиннее наружных, острые, вверху иногда коротко прижато-волосистые. Цветки язычковые и трубчатые; язычковые в полтора раза превышают листочки обертки, немного короче хохолка с 3-5 жилками, трехзубчатые; трубчатые цветки пятизубчатые, равны хохолкам. Цвет стеблей зеленоватый, листьев - серовато-зеленый, цветков – желтый, листочков обертки -зеленый; запах слабый, вкус водного извлечения сладковато-горький.
Изучение микродиагностических признаков проводили на временных микропрепаратах, приготовленных по методике ГФ XI издания с последующей микрофотосъемкой [глава 2, раздел 2.5].
В результате проведенных исследований были установлены следующие анатомические признаки: стебель на поперечном сечении округло-ребристый и имеет пучковое строение (рисунок 17).
Клетки эпидермиса стебля с поверхности толстостенные со складчатой кутикулой, имеют прозенхимную форму, прямостенные, со скошенными или прямыми концами, оболочки клеток имеют четковидное утолщение. Устьица анамоцитного типа (рисунок 18).
Отмечено наличие клеток идиобластов (рисунок 19). Стебель опушен простыми 5-7 клеточными толстостенными волосками, клетки которых часто заполнены бурым содержимым (рисунок 19). 1 10 11 6
Клетки основной паренхимы тонкостенные овальные или продолговатые, вытянуты вдоль поверхности стебля в тангентальном направлении. Эндодерма хорошо выражена, залегает в один слой, представлена крахмалоносным влагалищем. В первичной коре встречаются группы каменистых клеток, расположенные чаще всего участками напротив межпучковой зоны (рисунок 17).
Центральный цилиндр начинается перециклической склеренхимой, которая залегает крупными участками над пучками, образуя склеренхимную обкладку. Многочисленные закрытые коллатеральные проводящие пучки округло-овальной формы, удлиненные в радиальном направлении. Пучки располагаются близко друг к другу, между ними проходят сердцевинные лучи, образованные 2-4 рядами основной паренхимы. Флоэма проводящих пучков мелкоклеточная, занимает небольшой объем. Ксилема образована крупными сосудами, расположенными радиальными рядами, между которыми залегает склерефицированная паренхима. Сердцевина стебля заполнена рыхло расположенными клетками основной запасающей паренхимы (рисунок 17).
При изучении листовой пластинки установлено, что клетки верхнего эпидермиса листа прямостенные или со слегка извилистыми стенками (рисунок 21).
Клетки нижнего эпидермиса сильно извилистостенные (рисунок 20). Устьица в основном приурочены к нижнему эпидермису, устьичный аппарат аномоцитного типа. Вдоль жилки листа клетки эпидермиса прямостенные, вытянуты в тангентальном направлении со скошенными или прямыми концами, с продольной складчатостью кутикулы (рисунок 22). Эпидермис листа опушен многочисленными волосками. Так, на нижнем эпидермисе листа встречаются простые многоклеточные толстостенные волоски с кольцевыми утолщениями в местах соединения клеток с заостренной конечной клеткой и укороченными 3-4 клетками у основания (рисунок 23).
Характеристика микродиагностических признаков корневищ с корнями девясила иволистного
Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 2 мм. Около 1,0 г (точная навеска) измельченного сырья помещают в колбу со шлифом вместимостью 250 мл, прибавляют 100 мл спирта этилового 70 % и взвешивают с погрешностью +0,01 г. Колбу присоединяют к обратному водяному холодильнику, нагревают на кипящей водяной бане в течение 45 минут, периодически встряхивая для смывания частиц сырья со стенок. Колбу с содержимым искусственно охлаждают, взвешивают и при необходимости доводят до первоначальной массы спиртом этиловым 70 %. Извлечение фильтруют через бумажный складчатый фильтр, отбрасывая первые 10 мл фильтрата. 5,0 мл фильтрата помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 2 мл раствора алюминия хлорида 2 % в спирте этиловом 70 % и через 10 минут 2 капли разведенной кислоты уксусной. Объем раствора доводят спиртом этиловым 70 % до метки. Через 30 минут измеряют оптическую плотность раствора на спектрофотометре при длине волны 395 нм в кювете с толщиной рабочего слоя 10 мм.
В качестве раствора сравнения используют раствор, состоящий из 5,0 мл извлечения, 2 капель разведенной кислоты уксусной и доведенный спиртом этиловым 70% до метки в мерной колбе вместимостью 25 мл.
Содержание суммы флавоноидов в процентах (Х) в пересчете на цинарозид вычисляют по формуле: (2) D – оптическая плотность испытуемого раствора при длине волны 395 нм; 345 – удельный показатель поглощения цинарозида с алюминия хлоридом в спирте этиловом 70%; V – количество извлечения в мл; m – масса навески сырья в граммах; W – влажность сырья, % Валидация методики количественного определения суммы флавоноидов Изучены следующие валидационные характеристики методики: линейность, диапазон использования, повторяемость, воспроизводимость и правильность.
Определение линейности проводили на 6 уровнях концентраций. Первоначально был приготовлен исходный раствор ГСО цинарозида (0,05%), а затем из него готовили разбавленные растворы, для этого в мерные колбы вместимостью 25 мл помещали по 0,25; 0,5; 0,75; 1,00; 1,25; 1,50 полученного ГСО цинарозида, прибавляли по 2 мл раствора алюминия хлорида 2 % в спирте этиловом 70 %, перемешивали и доводили объем раствора спиртом этиловым 70 % до метки и снова перемешивали. Через 30 минут измеряли оптическую
Рисунок 45 - Зависимость оптической плотности полученных растворов цинарозида (лютеолин-7-гликозида) от концентрации плотность раствора на спектрофотометре при длине волны 395 нм, в кювете с толщиной слоя 10 мм в сравнении с контрольным опытом. Градуированный график цинарозида представлен на рисунке 45.
Критерием приемлемости линейности является коэффициент корреляции. Если его величина близка к единице, то совокупность данных можно описать прямой линией.
Как видно из рисунка 45, зависимость оптической плотности (у) от концентрации цинарозида (х) выражается уравнением у= bх + а (таблица 31). Таблица 31 - Результаты статистической обработки данных, полученных при изучении линейной зависимости вида y=bx+a F b a R 4 0,00175 0,603017 378,7029 -0,05971 0,999614 Коэффициент корреляции 0,999614 (таблица 31), поэтому данная методика имеет линейный характер в указанном диапазоне концентраций.
Проверку диапазона использования методики проводили следующим образом: получали извлечения из травы девясила иволистного спиртом этиловым 70% различной концентрации, для чего брали навески сырья 0,2, 0,4, 0,6, 0,8, 1,0 и из них готовили извлечения по разработанной методике.
Далее из полученных извлечений брали по 3 мл, помещали их в мерные колбы вместимостью 25 мл, прибавляли по 2 мл раствора алюминия хлорида 2% в спирте этиловом 70%, перемешивали, доводили объем раствора спиртом этиловым 70% до метки и снова перемешивали. Через 30 минут измеряли оптическую плотность на спектрофотометре при длине волны 395 нм, в кювете с толщиной слоя 10 мм в сравнении с исходным раствором без алюминия хлорида.
Зависимость оптической плотности извлечений(Y) от навески сырья (X) приведена на рисунке 46 и выражается уравнением Y=A+BX, где А – -0,03375, В – 0,44125, коэффициент корреляции R=0,998868.
На основании полученных данных установлено, что в пределах измеряемых концентраций зависимость оптической плотности извлечений от навески сырья носит линейный характер (рисунок 46).
Кроме того, найденное значение коэффициента А (-0,03375) свидетельствует о статистически незначимом вкладе остальных фенольных соединений, содержащихся в сырье и полученном извлечении, в содержание флавоноидов, что позволяет сделать вывод о достаточной специфичности методики.
Повторяемость методики определяли на одном образце сырья в 6 повторностях. Критерий приемлемости выражался величиной относительности стандартного отклонения, которое не должно превышать 10%. Эта величина составила 2,18% (таблица 32).
В результате проведенных исследований относительное стандартное отклонение составило 13,01%, что указывает на прецизионность методики в условиях воспроизводимости.
Правильность методики устанавливали путем измерения содержания флавоноидов в пересчете на цинарозид в извлечениях, к которым добавлены определенные количества стандартного раствора цинарозида: 0,25 мл, 0,50 мл, 0,75 мл.
Затем получали по методике окрашенные растворы и измеряли оптическую плотность при длине волны 395 нм.
Критерий приемлемости – средний процент восстановления при использовании растворов заданных концентраций, скорректированный на 100 %, и его средняя величина должна находиться в пределах 100±5 % [74,197]. В разработанной методике процент восстановления колеблется от 99,01 % до 103,55 %, его средняя величина составила 101,52 % (таблица 34). Таблица 34 - Определение правильности методики (результаты опытов с добавками)
Для определения содержания фенольных соединений используются различные методы: прямое спекторофотометрирование спирто-водных извлечений, хроматоспектрофотометрическое определение [115,167]. В последнее время для этих целей нашли применение метод высокоэффективной жидкостной хроматографии [127,161,184] и метод газо-жидкостной хроматографии с использованием пламенно-ионизационного детектора [128].
Для количественного определения суммы фенольных соединений в сырье девясила нами использован спектрофотометрический метод, основанный на измерении собственного поглощения веществ в УФ-области. Изучение УФ-спектров спирто-водного извлечения из травы девясила показало, что оно имеет максимум поглощения при длине волны 325 нм (рисунок 47). Рисунок 47 - УФ-спектры спирто-водного извлечения из травы девясила иволистного (1) и спиртового раствора СО хлорогеновой кислоты (2)
В этой области УФ-спектра находится один из максимумов поглощения оксикоричных кислот, в частности, хлорогеновой и кофейной кислот, которые присутствуют в траве исследуемого вида девясила, что позволяет сделать вывод о том, что характер кривой поглощения спирто-водных извлечений из травы девясила определяется в основном оксикоричными кислотами.
При разработке методики количественного определения суммы фенольных соединений были изучены измельченность сырья, время экстракции, температура экстракции, тип растворителя, соотношения сырье-растворитель.