Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы. современные аспекты профилактики и лечения гепатобилиарной патологии. володушка золотистая – перспективный источник получения лекарственного средства с гепатопротекторным эффектом . 17 24
1.1 Заболевания печени: этиология, патогенез и современные направления терапии. Анализ рынка гепатопротекторных средств .
1.2 Растения рода Володушка (Bupleurum) в народной и официнальной медицине. История применения и изучения травы Володушки золотистой .
1.3 Ботаническое описание внешних признаков Володушки золотистой, ареал обитания, сроки и правила заготовки .
1.4 Современные аспекты технологии и стандартизации сухих экстрактов из лекарственного растительного сырья Выводы по главе 1 27
Экспериментальная часть
Глава 2. Материалы и методы исследования.
2.1 Материалы исследования 29
2.2 Методы исследования 29
ГЛАВА 3. Фармакогностическое изучение сырья володушки золотистой и разработка методов контроля качества .
3.1 Исследование морфологических признаков сырья, возможные примеси
3.2 Исследование микроскопических признаков сырья 42
3.3 Разработка физико-химических методов контроля качества травы Володушки золотистой. Установление номенклатуры и норм числовых показателей 43
3.4 Разработка методики определения подлинности и количественного определения фенольных соединений в сырье .
3.5 Изучение содержания флавоноидных соединений в траве Володушки золотистой, собранной в разных местах произрастания...
3.6 Изучение стабильности в процессе хранения 62
3.7 Разработка нормативной документации на сырье. 64
Выводы по главе 3 64
ГЛАВА 4. Фитохимическое изучение травы володушки золотистой .
4.1 Определение флавоноидов 66
4.2 Определение фенолкарбоновых кислот 74
4.3 Определение дубильных веществ 76
4.4 Определение сапонинов 80
4.5 Определение полисахаридного комплекса 83
4.6 Определение содержания аскорбиновой кислоты 88
4.7 Определение аминокислотного состава 90
4.8 Определение микроэлементного состава 92
4.9 Определение компонентного состава образца травы при экстракции н-гексаном .
Выводы по главе 4 99
ГЛАВА 5. Разработка способа получения сухого экстракта володушки золотистой .
5.1 Определение технологических характеристик травы Володушки золотистой (товароведческий анализ)
5.2 Изучение влияния параметров экстрагирования на эффективность извлечения БАВ. Подбор оптимальных параметров экстракции
5.3 Изложение технологического процесса получения Володушки золотистой экстракта сухого 113
5.4 Изучение физических свойств экстракта сухого .
5.5 Изучение стабильности при хранении экстракта сухого 119
Выводы по главе 5 .
121
ГЛАВА 6. Изучение химического состава сухого экстракта и разработка показателей его качества .
6.1 Изучение качественного и количественного состава биологически активных веществ сухого экстракта . 122
6.1.1 Определение флавоноидов .122
6.1.2 Определение фенолкарбоновых кислот 125
6.1.3 Определение дубильных веществ 126
6.1.4 Определение сапонинов 127
6.1.5 Определение полисахаридного комплекса . 28
6.1.6 Определение содержания аскорбиновой кислоты . 129
6.1.7 Определение аминокислотного состава 130
6.1.8 Определение микроэлементного состава 131
6.2 Разработка методик стандартизации сухого экстракта Володушки золотистой 132
6.2.1 Определение подлинности сухого экстракта . 132
6.2.2 Количественное определение суммы фенольных соединений 132
6.3 Разработка нормативной документации на сухой экстракт 139
Выводы по главе 6 140
Общие выводы 141
Список условных обозначений 143
Список литературы
- Растения рода Володушка (Bupleurum) в народной и официнальной медицине. История применения и изучения травы Володушки золотистой
- Исследование микроскопических признаков сырья
- Определение аминокислотного состава
- Изучение влияния параметров экстрагирования на эффективность извлечения БАВ. Подбор оптимальных параметров экстракции
Введение к работе
Актуальность темы
В настоящее время наблюдается рост числа заболеваний гепатобилиарной системы среди населения. Это является следствием несбалансированного и нерегулярного питания, неблагоприятных факторов экологии, стрессов, а также бесконтрольного приема медикаментов.
В комплексной терапии и для профилактики данной группы заболеваний широко используется ряд лекарственных растений (расторопша пятнистая, солянка холмовая, артишок). В связи с увеличением числа заболеваемости поиск лекарственного растительного сырья, обладающего комплексным воздействием на пораженные ткани печени, высокой терапевтической активностью и низкой токсичностью является актуальным направлением фармацевтической науки.
Растения рода Володушка (Bupleurum) известны человечеству с древнейших времен и до нашего времени активно используются в медицине стран Юго-Восточной Азии (B. chinensis, B. falcatum) в качестве гепатопротекторных средств. На территории России также произрастают ряд видов рода Bupleurum. Володушка многожильчатая (ВФС 42-580-76) использовалась как сырье для получения препарата “Буплерин” обладающего Р-витаминной активностью. Самарскими учеными (Кривенчук П.Е. и др.) разрабатывалась технология производства препарата “Пеквокрин”, сырьем для которого служила володушка круглолистная. В настоящее время также известны ряд Биологически активных веществ (БАД) гепатопротекторного действия на основе сырья володушки многожильчатой, такие как Гепато Транзит, Овесол (ЗАО “Эвалар”) и др.
На основании информационно-аналитического анализа для детального изучения нами выбрана трава Володушки золотистой (B. aureum), произрастающую на территории РФ и имеющую на сегодняшний день стабильную сырьевую базу в природе. Кроме того, на территории республики Башкортостан Мингажаевой А.М. проводились работы по введению володушки золотистой в культуру.
По данным автора Володушка золотистая более технологично вводится в культуру, чем многожильчатая, имеет большую (в четыре раза) наземную массу растений, что важно при создании промышленных запасов растения. Семена Володушки золотистой лучше, чем семена Володушки многожильчатой всходят при озимом посеве. Если ориентироваться на природные запасы этого растения, то Володушку золотистую заготавливать проще, так как Володушка многожильчатая произрастает в труднодоступных для заготовки горных районах.
Проводились фитохимическое изучение данного растения (из листьев был выделен гликозид флавоноловой группы) научно доказана фармакологическая активность как гепатопротекторного и желчегонного средства проведены работы по ботанико-ресурсным исследованиям.
Учитывая все представленные преимущества, Володушка золотистая выбрана перспективным видом, заслуживающим внимания и подлежащим детальному фармакогностическому изучению.
Цель и задачи исследования
Целью настоящей работы является изучение Володушки золотистой травы и разработка современных методов стандартизации лекарственного растительного сырья (ЛРС) и экстракта сухого.
Для достижения цели работы поставлены следующие задачи:
-
Провести фармакогностическое изучение Володушки золотистой травы, установить диагностически значимые признаки в макро- и микроскопическом строении сырья.
-
Определить качественный состав и оценить содержание основных групп биологически активных веществ в сырье.
-
Разработать методики стандартизации сырья Володушки золотистой.
-
Установить закономерности экстракции биологически активных веществ (БАВ) Володушки золотистой травы; разработать технологическую схему получения экстракта сухого, обеспечивающую максимальный выход БАВ из сырья, в конечном итоге готового продукта со стабильными показателями качества;
-
Исследовать химический состав, технологические свойства и разработать показатели качества для Володушки золотистой экстракта сухого;
-
Разработать и оформить проект ФС на Володушки золотистой траву, ТУ на Володушки золотистой экстракт сухой, лабораторный регламент на производство Володушки золотистой экстракта сухого.
Научная новизна работы
Впервые проведено фармакогностическое изучение травы Володушки золотистой и выявлены диагностически значимые признаки в анатомическом строении: тонкополосатый стебель, листья трех типов, сизоватый налет на нижней стороне листа, обнаружены многоугольные клетки эпидермиса со слегка извилистыми стенками с четковидными утолщениями боковых стенок, секреторные ходы с коричневым содержимым по краю листа и вдоль крупных жилок.
Изучен качественный состав основных групп БАВ (флавоноидные соединения, фенолкарбоновые кислоты, дубильные вещества, сапонины, полисахариды) в ЛРС и экстракте сухом. Разработаны методики стандартизации Володушки золотистой травы и экстракта сухого с использованием комплекса физико-химических методов анализа. Разработан способ получения экстракта сухого.
Практическая значимость результатов исследования
Разработаны проект ФС на Володушки золотистой траву, ТУ на Володушки золотистой экстракт сухой, а также лабораторный регламент на производство Володушки золотистой экстракта сухого. Фрагменты диссертационного исследования внедрены в учебную и научно-исследовательскую работу кафедры общей фармацевтической и биомедицинской технологии РУДН.
Личный вклад автора
Автору принадлежит ведущая роль в выборе направления исследования, постановки целей и задач, выбора объекта исследования, проведения экспериментальных исследований, обобщения полученных данных и их статистической обработки.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности
Научные положения диссертационной работы соответствуют формуле специальности 14.04.02 – Фармацевтическая химия, фармакогнозия.
Результаты проведенного исследования соответствуют пунктам 5. «Изучение вопросов рационального использования ресурсов лекарственного растительного сырья с учетом влияния различных факторов на накопление биологически активных веществ в сырье». 6. «Изучение химического состава лекарственного растительного сырья, установление строения, идентификация природных соединений, разработка методов выделения, стандартизации и контроля качества лекарственного растительного сырья и лекарственных форм на его основе».
Апробация работы
Основные положения работы докладывались и обсуждались на:
Всероссийской научной конференции студентов и аспирантов с международным участием “Молодая фармация – потенциал будущего” (Санкт-Петербург, 2011);
76-й Всероссийской научной конференции студентов и молодых ученых с международным участием “Молодежная наука и современность” (Курск, 2011);
Конференции Пермской государственной фармацевтической академии (Пермь, 2011);
Седьмой международной научной конференции “Современные проблемы гуманитарных и естественных наук” (Москва, 2011);
Научно-практической конференции “Наука и современность - 2011” (Новосибирск, 2011);
Международной научно-практическая конференции “В мире научных открытий” (Москва, 2011);
7-й Всероссийской научной конференции с международным участием “Химия и технология растительных веществ” (Сыктывкар, 2011);
Международной конференции “Актуальные проблемы изучения растений”, (Баку, 2011);
Первой научно-практической конференции аспирантов и молодых ученых “Молодые ученые и фармация ХХI века” (Москва, 2013);
Второй Международной научно-практическая конференции “Актуальные вопросы медицины” (Баку, 2013);
Международной научной конференции “Новые задачи современной медицины” (Санкт-Петербург, 2013);
Всероссийской научно-практической конференции “Здравоохранение: образование, наука, инновации” (Рязань, 2013);
6-й Международной научной конференции “Традиционная медицина: пути интеграции с современным здравоохранением” (Улан-Удэ, 2013);
8-й Всероссийской научной конференции с международным участием и школе молодых ученых “Химия и технология растительных веществ” (Калининград, 2013);
международной научно-практической конференции «От растения к препарату: традиции и современность» (к 95-летию со дня рождения проф. А. И. Шретера)
( Москва, 2014).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 19 научных работ, которые отражают основное содержание диссертационной работы, из них 4 в ведущих изданиях, рекомендуемых ВАК.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Результаты фармакогностического изучения травы Володушки золотистой, установление макроскопических и микроскопических диагностических признаков.
-
Результаты фитохимического исследования Володушки золотистой травы.
-
Методики стандартизации Володушки золотистой травы.
-
Результаты исследований технологических характеристик Володушки золотистой травы и установление закономерностей выхода БАВ в зависимости от основных факторов, влияющих на процессы экстрагирования.
-
Разработка способа производства Володушки золотистой экстракта сухого, определение его физико-химических и технологических свойств.
-
Методики стандартизации Володушки золотистой экстракта сухого.
Объем и структура диссертации
Диссертационная работа изложена на 181 страницах, содержит 50 таблиц и 58 рисунков. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, четырех глав, посвященных экспериментальным исследованиям, выводов, списка литературы и 6 приложений. Список литературы содержит 222 источников, в том числе 79 на иностранных языках.
Растения рода Володушка (Bupleurum) в народной и официнальной медицине. История применения и изучения травы Володушки золотистой
На протяжении жизнедеятельности организма человека важную роль играет печень, которая учавствует в процессах кроветворения, углеводного обмена, синтезе холестерина, желчных кислот и билирубина, продукции и секреции желчи, а также выполняет детокикационную функцию. Патология печени приводит к замедлению процессов биотрансформации лекарственных средств (ЛС), что ведет к проявлению побочных эффектов. Кроме того, несбалансированное питание, стрессы, заболевания ведут к функциональной недостаточности печени, проявляющейся в нарушении жизнедеятельности гепатоцитов, уменьшение выработки и активности ферментов, а также физиологического течения биохимических реакции. В результате детоксикационная функция печени нарушается, выброс токсических веществ активируется, в результате чего нарушается общая регуляция обмена веществ в организме человека [47, 56].
В настоящее время на фармацевтическом рынке представлен широкий спектр препаратов для лечения печени и защиты клеток печени от неблагоприятных факторов внешней среды. Целью исследования является анализ рынка лекарственных средств гепатопротекторного действия (приложение 1).
Гепатопротекторы – разнородная группа лекарственных препаратов (ЛП), препятствующая разрушению клеточных мембран и стимулирующих регенерацию гепатоцитов [107].
Среди них можно выделить три основные группы: 1. Препараты синтетического происхождения (аминокислоты, витамины и их производные, препараты на основе урсодиоксихолевой кислоты)
2. Фитопрепараты (на основе лекарственного растительного сырья (ЛРС) и содержащие эссенциальные фосфолипиды сои)
3. Препараты животного происхождения (на основе гидролизата печени крупного рогатого скота)
Помимо аллопатических препаратов на рынке представлены также гомеопатические препараты, изготовленные на основе сырья растительного, животного, минерального происхождения путем разведения и потенцирования, обладающие комплексным воздействием на клетки печени.
Также можно отметить довольно обширную группу биологически активных добавок (БАД) как растительного, так и животного происхождения.
Синтетические препараты (аминокислоты, витамины и их производные на основе урсодиоксихолевой кислоты) играют важнейшую роль в биохимических реакциях, участвуют в биосинтезе фосфолипидов. Применение данной группы ЛВ усиливает элиминацию свободных радикалов и других токсичных метаболитов из гепатоцитов, стимулируют процессы регенерации гепатоцитов.
Урсодиоксихолевая кислота – гидрофильная нетоксичная третичная желчная кислота, образующаяся под действием бактериальных ферментов из 7-кето литохолевой кислоты, которая поступает в печень из тонкого кишечника. На фоне приема препаратов на основе урсодиоксихолевой кислоты уменьшается энтерогепатическая циркуляция гидрофобных желчных кислот, предупреждается их токсический эффект на мембраны гепатоцитов и эпителий желчных протоков. Урсодиоксихолевая кислота обладает антиоксидантным действием, снижает холестаз-опосредованную иммуносупрессию, оказывает гепатопротекторный, антихолестатический, иммуномодулирующий, гипохолестеринемический, литолитический и антиапоптический эффекты. Урсодиоксихолевая кислота снижает уровень холестерины в желчи за счет угнетения его абсорбции в кишечнике, подавления синтеза в печени и уменьшения секреции в желчь, повышает растворимость холестерина в желчи посредством образования с ним жидких кристаллов, снижает литогенный индекс желчи, увеличивая содержание в ней желчных кислот.
Большая часть препаратов и БАД растительного происхождения, на сегодняшний день существующх на рынке, содержат экстракт Расторопши пятнистой, основным компонентом которого является силимарин. Сам силимарин представляет собой смесь трех изомерных соединений – силибинина, силикристина и силидианина. Все изомеры имеют фенилхроманоновую структуру (флаволигнаны). Основным компонентом по содержанию и по клиническим эффектам (мембранопротективный, антиоксидантный, метаболический) является силибинин. Силибинин оказывает мембраностабилизирующее действие на клетки печени, что приводит к повышению сопротивляемости мембран и снижению потерь составных веществ клетки. Для стабилизации мембан также имеют значение антиоксидантные и метаболические свойства силибинина. Метаболическое действие силибинина состоит в стимуляции синтеза протеинов и ускорении регенерации поврежденных гепатоцитов [37, 107, 108].
Также популярны препараты на основе экстракта артишока, содержащего фенольное соединение цинарин в сочетании с фенолокислотами: кофейной, хлорогеновой. Кроме того экстракт артишока содержит каротин, витамины группы В, аскорбиновую кислоту, инулин. Активизирует функциональную деятельность печеночных клеток, стимулирует выработку ферментов, влияет на липидный обмен, повышает антитоксическую функцию печени. Однако артишок посевной – сырье зарубежного производства, в настоящее время ведется разработка методов культивирования в Краснодарском крае [131, 134].
Препараты, содержащие эссенциальные фосфолипиды сои восстанавливают структуру и функции клеточных мембран и обеспечивают торможение процесса деструкции клеток, поэтому их использование при заболеваниях печени является патогенетически обоснованным. Гепатопротективное действие достигается путем непосредственного встраивания молекул фосфолипида в фосфолипидный бислой мембран поврежденных гепатоцитов, что приводит к восстановлению его барьерной функции.
Исследование микроскопических признаков сырья
Володушка (Bupleurum) cемейства зонтичные — Apiaceae (Umbelliferae) - род растений, насчитывающих в мировой флоре порядка 150 видов. С давних времен в народной медицине виды володушки применяются как противовоспалительное, ранозаживляющее, слабительное и стимулирующее средство, виды Володушки знамениты как гепатопротекторные и желчегонные средства при заболеваниях печени и желчного пузыря.
В странах Юго-восточной Азии (Китай, Корея, Япония) официнальны такие виды володушек, как Bupleurum scorzioneri folium L. (Володушка козелецелистная), Bupleurum chinensis L. (Володушка китайская), Bupleurum falcatum L. (Володушка серповидная) [178, 180, 200]. На основе этого лекарственного растительного сырья произведены ряд препаратов, применяемых в медицине стран Азии, к примеру пилюли Ху Ганн Лянь, пилюли Драконья желчь, Чай-ху, Сайко, Premixx-S, Bupleurum-Root, и ряд других.
Официнальным сырьем в России является володушка многожильчатая Bupleurum multinerve L., [ВФС 42580-76], включенная в реестр лекарственных средств как сырье для получения препарата «Буплерин», обладающего Р витаминной активностью для терапии заболеваний, сопровождающихся нарушениями проницаемости стенок сосудов (капилляротоксикоз, отеки сосудистого происхождения, кровоизлияния в сосудистое русло) [30].
Володушка многожильчатая также входит в состав биологически активных добавок к пище: Гепатохолан, Гепастронг, Гепатон-2, Гепарон, Гербамарин (печеночный), Овесол, Гепатотранзит, Фитогепаксан. Самарскими учеными (П.Е. Кривенчук и др., 1975) был предложен препарат с желчегонным эффектом названием “Пеквокрин”, сырьем для которого служила Володушка круглолистная [64, 65].
На территории России согласно литературным данным произрастает более 20 видов рода Володушка. Многие из них с давних времен применяются в народной медицине.
Первые данные по изучению растений рода Володушка были получены Вограликом В.Г. в Томске в 1941 г. [27]. На основании полученных экспериментальных данных был доказан желчегонный эффект Володушки, а в ходе дальнейших исследований были не только подтверждены данные о желчегонном действии Володушки козелецелистной, но и обнаружено, что она несколько уступает по активности другим видам – Володушке золотистой и Володушке многожильчатой. В литературе также отмечены желчегонный, ранозаживляющий, противовоспалительный, жаропонижающий, липолитический эффекты растний рода Володушка. Ученые, изучавшие химический состав и терапевтическую эффективность видов Володушки, обнаружили в траве и подземных органах сапонины, эфирные масла, алкалоиды, дубильные вещества, спирт рибит, аскорбиновую кислоту, каротин. Кроме того в растениях рода володушка найдены флавонолы (кверцетин, изорамнетин, рутин, изокверцетин, нарциссин) [43, 44, 45, 81, 82, 101, 116]. Российские ученые [20, 64, 67, 70] объясняют фармакологическую активность видов рода Bupleurum преимущественным действием флавоноидов, зарубежные [175, 185, 196] связывают эффект с наличием тритерпеновых гликозидов (сайкосапонинов, буплерозидов). Кроме того российскими и зарубежными фармакологами и клиницистами опытным путем доказаны желчегонное, противовоспалительное, секреторное, капиляроукрепляющее действия комплекса биологически активных веществ растений рода Bupleurum [8, 9, 10, 20, 22, 27, 54, 65, 69, 70, 71, 72, 73, 90, 96, 97].
Под воздействием активных соединений травы растений рода Володушка зафиксированы изменения в химическом составе желчи, возрастает содержание пигментов, билирубина, желчных кислот, холестеринхолатного коэффициента у лабораторных животных. [96, 141] По данным Минаевой желчегонный эффект Володушки многожильчатой сходен с действием Бесмертника песчаного и является эффективным при холециститах, ангиохолитах, гепатитах, циррозе печени [80, 83].
Согласно современным представлениям фармакологический эффект Володушек связывают с активным антиоксидантным действием комплекса БАВ, направленным на невилирование последствий окислительного cтресса. Также имеются данные зарубежных исследователей [175, 185], свидетельствующие об активности сайкосапонинов в активации синтеза гамма-интерферона, что влечет противовирусное действие. Можно отметить достаточно высокое содержание в траве дубильных веществ катехиновой группы и полисахаридов, обеспечивающих противовоспалительный эффект.
Анализ данных дает возможность рассматривать род володушка как ценное сырье для разработки препаратов, обладающих гепатопротекторным действием. Для организации производства отечественных лекарственных препаратов на основе володушки необходимо изучение новых видов володушки, произрастающих на территории Российской Федерации, их стандартизация, введение в Государственную Фармакопею, разработка новых лекарственных форм, изучение фармакологической активности и безопасности.
Нами проведен сравнительный анализ растений рода Володушка (Bupleurum), произрастающих на территории России с целью поиска наиболее перспективного вида для разработки гепатопротекторного фитопрепарата. Анализ проводили по следующим показателям: 1. произрастание на территории РФ, широта ареала обитания; 2. наличие сырьевой базы в дикой природе на сегодняшний день; 3. возможность культивирования растения для создания стабильной сырьевой базы; 4. опыт применения в народной медицине в качестве средства для лечения патологий гепатобилиарной системы; 5. наличие фармакологических исследований.
Проведенный анализ показал, что является целесообразным рассмотреть володушку золотистую (Bupleurum aureum Fisch.) как сырьевой ресурс для разработки гепатопротекторного фитопрепарата. Это связано с рядом причин. Володушка золотистая достаточно широко распространена в Европейской части России и в Сибири. На сегодняшний день имеются достаточные запасы сырья в дикой природе. Заготовка не является трудоемкой и дорогостоящей, т. к. растение произрастает преимущественно в равнинных регионах (в отличие от многожильчатой). Проводились работы по разработке методов культивирования володушки золотистой на территории республики Башкортостан, которые показали, что володушка золотистая более технологично вводится в культуру, чем многожильчатая [86]. Также имеются работы по изучению химического состава и фармакологической активности [8, 27, 45, 69, 72, 96, 116].
На основании изученных данных для разработки фитопрепарата целесообразно рассмотреть Володушку золотистую (длиннолистную) – (Bupleurum aureum (Fisch.) seu longifolium (L.), т.к. на сегодняшний день накоплена большая теоретическая база по биохимическому изучению данного растения, научно доказана фармакологическая активность как гепатопротекторного средства, а также проведены работы по ботанико-ресурсным исследованиям
Володушка золотистая издавна применялась в народной медицине на территории России. Первые работы по фармакологическому изучению этого вида проведены в 40-х годах ХХ века томскими клиницистами. Так, желчегонная активность данного растения впервые была показана Вограликом В.Е. (1946) [27], а густого экстракта Саратиковым А.С. [112], которым также было изучено действие экстракта Володушки золотистой на углеводно-фосфорный обмен в печени (1959). Затем желчегонная и антиокислительная активность извлечений и густого экстракта была подтверждена в работах Нехода М.Ф. на лабораторных животных – собаках, мышах, кроликах (1962) [96]. Влияние Володушки золотистой на эвакуаторную и секреторную функцию желудка показана в работах Мирецкой Т.И. (1946) [90].
Определение аминокислотного состава
Для установления подлинности травы Володушки золотистой в НД кроме макроскопического, микроскопического анализа и числовых показателей, которые изложены выше (см. пп. 3.1 – 3.3), нами предложено использовать тесты, основанные на качественных реакциях. На основании данных химического изучения состава БАВ травы Володушки золотистой, в разделе “Качественные реакции” проекта НД предусмотрено проведение тестов на обнаружение в сырье Володушки золотистой основных групп БАВ: флавоноидов, сапонинов, дубильных веществ, полисахаридов.
Извлечение для анализа готовили по следующей методике. Аналитическую пробу сырья измельчали до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм. Около 5,0 измельченного сырья помещали в колбу вместимостью 100 мл, прибавляли 50 мл воды и нагревали на кипящей водяной бане при частом перемешивании в течении 10 мин, затем охлаждали и фильтровали.
Полученное извлечение использовали для проведения качественных реакций:
1. Цианидиновая реакция (проба Синода). К 1 мл извлечения, прибавляли 1 мл концентрированной соляной кислоты и добавляли кристалл магния. Наблюдали красное окрашивание (флавоноиды).
2. Реакция пенообразования. 5 мл фильтрата сильно встряхивали; образовывалась обильная и стойкая пена (сапонины).
3. К 1 мл извлечения, прибавляли 1 мл 1 % раствора железоаммониевых квасцов. Наблюдали черно-зеленое окрашивание, переходящее в черно-бурое (дубильные вещества катехиновой природы).
4. При добавлении к водному извлечению 95 % спирта выпадал хлопьевидный осадок, что говорит о наличии полисахаридов. Согласно литературным данным и проведенному фитохимическому исследованию, преобладающей группой БАВ сырья Володушки золотистой, обуславливающей антиоксидантный эффект являются флавоноиды. В связи с этим для количественной оценки содержания БАВ предлагается методика спектрофотометрического определения суммы флавоноидов в пересчете на рутин. Мы использовали реакцию комплексообразования с раствором алюминия хлорида. Эта реакция является селективной для фенольных соединений и дает батохромный сдвиг спектра в длинноволновую область, что позволяет отделить флавоноидные соединения. С целью выбора аналитической длины волны был изучен УФ - спектр извлечения травы Володушки золотистой на спирте этиловом 50 %, а также стандартного образца рутина с добавлением алюминия хлорида. Установлено, что максимумы поглощения окрашенных продуктов реакции суммы фенольных соединений с рутином составляет 410±2 нм. Поэтому в качестве стандартного образца мы использовали рутин. Для предотвращения гидролиза фенольных соединений реакцию комплексообразования проводили в присутствии 33 %-й уксусной кислоты. При изучении стабильности продуктов реакции суммы фенольных соединений с 2 %-м раствором алюминия хлорида во времени установлено, что оптическая плотность достигает максимума через 30 мин и остается стабильной в течение 8 – 10 мин.
Анализ проводили по следующей методике. Извлечение травы Володушки золотистой для анализа готовили следующим образом. Аналитическую пробу сырья измельчали до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм. 1,0000 (точная навеска) травы Володушки золотистой помещали в круглодонную колбу, прибавляли 30 мл спирта этилового 50 % и проводили экстракцию при температуре 60 С с обратным холодильником в течение 1,5 часов. Полученное извлечение фильтровали через бумажный фильтр в колбу и использовали для анализа (раствор А).
В мерную колбу вместимостью 50 мл помещали 1 мл раствора А, 1 мл 2 % раствора алюминия хлорида и доводили объем раствора 50 % этиловым спиртом до метки. Через 30 мин измеряли оптическую плотность раствора на спектрофотометре при длине волны 410 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм.
В качестве раствора сравнения использовали раствор, состоящий из 1 мл извлечения, 1 капли разведенной уксусной кислоты, доведенный спиртом этиловым 50 % до метки в мерной колбе, вместимостью 50 мл.
Содержание суммы фенольных соединений в пересчете на Рутин и абсолютно сухое сырье в процентах (Х) вычисляли по формуле: X= D m0 100 100 100 D0 m 100 (100-W) Где: D – оптическая плотность испытуемого раствора D0 – оптическая плотность ГСО Рутина m – масса сырья в граммах m0 – масса ГСО Рутина в граммах W – потеря в массе при высушивании сырья в процентах Примечание.
Приготовление реактива. 20,0 (с точностью до 0,02) хлорида алюминия (чда) растворяли при нагревании на водяной бане в 96 % спирте этиловом в мерной колбе, емкостью 100 мл, охлаждали при комнатной температуре и доводили объем раствора до метки. Срок хранения раствора – 3 месяца.
Приготовление раствора Государственного стандартного образца (ГСО) Рутина (ГСО Рутина использовали марки CAS 207671-50-9 – R5143 Sigma-Aldrich Chemie GmbH (95,0%) Около 0,05 (точная навеска) ГСО Рутина, предварительно высушенного при температуре 130-135 С в течение 3 ч, растворяли в 40 мл 96 % спирта этилового в мерной колбе вместимостью 50 мл при нагревании на водяной бане, охлаждали, количественно переносили в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводили объем раствора 95 % спиртом этиловым до метки и перемешивают. Раствор стабилен в течение 1 месяца.
Валидацию методики количественного определения суммы фенольных соединений в пересчете на рутин проводили по линейности, повторяемости, воспроизводимости и правильности.
Определение линейности проводили на 5 уровнях концентраций от теоретического содержания суммы фенольных соединений в пересчете на рутин. Растворы готовили путем разбавления аликвоты стандартного образца рутина и увеличения аликвоты для измерения количественного содержания рутина в растворах, имеющих концентрацию 80 % – 120 %. Критерием приемлемости линейности является коэффициент корреляции. Если его величина близка единице, то совокупность данных можно описать прямой линией. Величина коэффициента корреляции должна быть не ниже 0,99. Коэффициент корреляции составил 0,988 (таблица 8, рисунок 22). Повторяемость методики определяли на образцах одной партии в 10 повторностях (таблица 9). Метрологические характеристики методики определения содержания суммы флавоноидов в пересчете на Рутин приведены в таблице 10.
Изучение влияния параметров экстрагирования на эффективность извлечения БАВ. Подбор оптимальных параметров экстракции
В результате обработки данных методом многофакторного регрессионного анализа получены следующие уравнения множественной регрессии. Полученные данные свидетельствуют о том, что экстрагент (фактор Х1) наиболее значимо влияет на экстракцию БАВ. При этом особую роль в достижении полноты экстракции играла продолжительность экстракции (фактор Х3). Незначительное влияние на выход БАВ в извлечение оказывает размер частиц сырья (фактор Х2).
Для определения оптимальных условий экстракции и обоснования рационального способа получения сухого экстракта мы изучили влияние экстрагента, степени измельченности сырья, температурного режима, времени и кратности экстракции, а также соотношение сырье : экстрагент.
Определение суммы экстрактивных веществ проводили по методике ГФ ХI.
Определение суммы фенольных соединений проводили методом спектрофотометрии на спектрофотометре СФ-103 в пересчете на Рутин. При подборе оптимального экстрагента использовали воду очищенную, спирт этиловый различных концентраций (20 %, 40 % – 90 %), ацетон, 50 % водный ацетон, хлороформную воду и н-гексан. Результаты представлены в таблице 31.
Полученные данные показывают, что наибольший выход флавоноидных соединений достигается при экстракции 50 % спиртом. Повышение температуры увеличивает выход БАВ.
Измельченность сырья также оказывает большое влияние на процессы экстракции. На основании экспериментальных данных (таблица 32) установлено, что оптимальными являются частицы, проходящие сквозь сито с отверстием 1 мм., т к более мелкое измельчение ведет к получению мутного фильтрата, что затрудняет анализ и дальнейшее использование в технологических процессах, а 110 также способствует “цементированию” сырья и как следствие снижению выхода экстрактивных веществ.
Более крупный размер частиц приводит к снижению процесса диффузии из сырья, что также влечет за собой наименьшее извлечение БАВ.
Анализ зависимости выхода экстрактивных веществ от температурного режима показал, что (таблица 33) оптимальным является нагревание при температуре 60 С, так как увеличение температуры может инактивировать действующие вещества флавоноидной природы.
Полученные результаты показывают, что при первом контакте фаз в извлечение переходит 55-60 % экстрактивных веществ, при втором – 20-25 %, при третьем и последующих контактах 5-10 %. Таким образом, трехкратная экстракция обеспечивает истощение сырья в среднем на 85 – 95 %.
Затем по полученным опытным путем данным проводили сравнительный анализ методов экстрагирования. Результаты показывают, что трехкратная дробная мацерация с делением экстрагента на равные части является более предпочтительным методом, чем перколяция (таблица 37). Таблица 37 - Влияние метода экстрагирования на выход Биологически активных веществ Метод экстрагирования Выход суммы БАВ в абс. Сухом сырье, в % Выход суммы флавоноидных соединений в пересчете на Рутин, в % Трехкратная дробная мацерация с делением экстрагента на равные части 29,03±3,00 1,79±0,02
Перколяция с делением экстрагента на три равные части 28,90±3,00 1,76±0,02 Таким образом, для наиболее полного экстрагирования БАВ из травы Володушки золотистой оптимальным является метод ускоренной дробной мацерации с делением сырья на три равные части, при соотношении фаз 1:10 при рабочей температуре 60 ± 5 0С. на 50 % спирте по 45 мин. (мацерационная пауза – 1 час). Оптимальная степень измельчения сырья – 1 мм.
Разработка технологии изготовления экстракта сухого Сухие экстракты – концентрированные извлечения из лекарственного растительного сырья, представляющие собой сыпучие массы с содержанием влаги не выше 5 %. На сегодняшний день сухие экстракты являются наиболее рациональной субстанцией из растительного сырья, так как обеспечивают максимальное извлечение действующих веществ, стабильность и фармакологическую активность комплекса биологически активных веществ, минимально возможную массу, удобство при дозировании и введении в лекарственную форму. К недостаткам сухих экстрактов относят гигроскопичность, вследствие чего уменьшаетя сыпучесть.
Для получения сухого экстракта травы Володушки золотистой выбран метод трекратной дробной мацерации с делением экстрагента на равные части. Технологическая схема производства сухого экстракта представлена на рисунке 48.
Как следует из приведенной схемы производства сухого экстракта травы Володушки золотистой технологический процесс включает в себя следующие стадии: Т.П.1. Измельчение и просеивание сырья. Володушки золотистой траву измельчали на мельнице (Рм-2) до размера частиц 1,0 мм. Затем просеивают на ситах для получения однородного материала.
Согласно лабораторному регламенту после измельчения 0,315 кг травы володушки длиннолистной (золотистой), содержащей 0,00526 кг суммы полифенольных соединений, получили 0,300 кг измельченной травы володушки длиннолистной (золотистой), содержащей 0,00501 кг суммы полифенольных соединений. Потери сырья при измельчении составляют – 0,015 кг Выход на стадии – 95,2 % Выход от начала процесса – 95,2 %. Т.П.2.1. Подготовка экстрагента. В качестве экстрагента используют 50% этиловый спирт, подготовленный методом разведения с водой очищенной из 96% спирта.
В лабораторном эксперименте в сборник (Сб-4) с помощью цилиндра (М-3) измеряли 0,6 л спирта этилового 96 % (0,575 л 100 %) и 0,55 л воды очищенной, перемешивали и отбирали пробу полученного водного спирта для определения его крепости на анализ.
Получали 1,150 л спирта этилового 50 % (плотность 0,932 г/см3) или 0,575 л 96 %, который используют для экстракции измельченного сырья.
Экстракт из измельченной травы володушки золотистой получают трехкратной экстракцией в колбе (К-5), соединенной с обратным холодильником (Т-6) и мешалкой (Тм-7). Нагрев реакционной смеси осуществляется с помощью колбонагревателя с терморегулятором (Б-8).
При первоначальном ведении процесса экстракцию измельченного сырья проводят спиртом этиловым 50 %. При последующих загрузках на первую экстракцию подают извлечение, полученное при третьей экстракции предыдущей загрузки с добавлением такого количества спирта этилового 50 %, чтобы объем экстрагента составлял 1,15 л. 0,1 кг измельченной травы володушки золотистой загружают в круглодонную колбу (К-5), заливают 1,15 л экстрагента. После окончания загрузки проводят экстракцию при постоянном перемешивании и нагревании до температуры (60±5) С в течение 45 мин. После чего извлечение фильтруют в сборник (Сб-10), а сырье еще дважды экстрагируют аналогичным способом. Шрот после помещают в шротосборник (Ш-24) и отправляют в отвал.
Концентрирование экстракта Объединенный экстракт порциями переносят в круглодонную колбу (К-5), которую соединяют с роторным испарителем (Ри-11).
Упаривание ведут при температуре реакционной массы (60±5) С и давлении 0,09 мПа приблизительно до 1/16 первоначального объема (0,1 л).
В результате упаривания получают 0,1 л водного кубового остатка (плотность 1,081 г/см3) и 1,25 л отгона спирта этилового 66 % (плотность 0,894 г/см3). Отгон помещают в сборник (Сб-4) и вновь используют после приготовления спирта этилового 50 % для экстракции сырья. Водный кубовой остаток, содержащий действующие вещества, сливают в сборник (К-15). Потери спирта при экстракции, фильтрации, упаривании и со шротом составляют 0,19 л или 16,52 % от загруженного. Центрифугирование концентрированного экстракта. Концентрированный экстракт подвергают очистке от балластных веществ центрифугированием на центрифуге (Ц-16). Получают очищенный экстракт (плотность 1,087 г/см3) и осадок в количестве 0,0017 кг, который помещают в контейнер (Ш-24) и отправляют в отвал.
Очищенный экстракт сливают в сборник (Сб-15) и передают на ТП 2.5. ТП 2.5. Сушка очищенного концентрированного экстракта. Очищенный концентрированный экстракт разливают примерно поровну в три выпарительные чашки (Ч-17) и помещают в сушильный шкаф (Сш-18).
