Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. STRONG Современное состояние фармакогностических исследований
любистка лекарственного (levisticum officinale koch.) STRONG 12
1.1 Ботаническая характеристика рода Levisticum 12
1.2 Химический состав любистка лекарственного 15
1.3 Использование в быту и медицине 18
1.4 Ареал распространения, биологические особенности и состояние агрокультуры любистка лекарственного 27
1.5 Результаты контент-анализа зарегистрированных в РФ
лекарственных препаратов, обладающих диуретическим действием 32
Выводы по обзору литературы 35
Глава 2. Объекты и методы исследования 36
2.1 Объекты исследования 36
2.2 Методы исследования углеводов 36
2.2.1 Свободные моносахариды 36
2.2.2 Олиго- и полисахариды 37
2.2.3 Выделение полисахаридов из растительного сырья 37
2.2.4 Кислотный гидролиз 37
2.2.5 Хроматографический анализ углеводов 38
2.2.6 Газожидкостная хроматография (ГЖХ) 38
2.2.7 Спектрометрия в инфракрасной области 39
2.2.8 Количественное определение галактуронидов 39
2.2.9 Определение физико-химических характеристик пектинов 39
2.3 Методы исследования эфирных масел 40
2.3.1 Газожидкостная хромато-масс-спектрометрия (ГХ-МС) 40
2.4 Методы исследования фенольных соединений 40
2.4.1 Выделение и качественное обнаружение фенольных соединений 40
2.4.2 Изучение фенольных соединений методом ВЭЖХ 41
2.5 Методы исследования макро- и микроэлементного состава 42
2.6 Изучение аминокислотного состава 42
2.7 Общие методики стандартизации сырья 43
2.7.1 Методы отбора проб для анализа 43
2.7.2 Морфолого-анатомические исследования 43
2.7.3 Определение числовых показателей качества сырья 44
2.7.4 Определение микробиологической чистоты сырья 44
2.7.5 Определение содержания радионуклидов з
2.7.6 Определение сроков хранения сырья 44
2.7.7 Статистическая обработка данных 45
2.7.8 Валидация методик количественного определения 45
2.8 Методы токсико-фармакологических исследований 45
2.8.1 Исследование «острой» токсичности 45
2.8.2 Исследование отхаркивающего действия 46
2.8.3 Изучение антибактериальной активности 47
2.8.4 Изучение спазмолитической активности 47
2.8.5 Изучение диуретической активности 48
2.8.6 Изучение желчегонной активности 49
ГЛАВА 3. Интродукционные исследования любистка лекарственного в условиях кавказских минеральных вод 50
3.1 Изучение лабораторной всхожести семян любистка лекарственного 51
3.2 Определение полевой всхожести 53
3.3 Фенологические особенности развития любистка лекарственного 54
3.4 Определение семенной продуктивности и урожайности любистка лекарственного в условиях культуры 59
3.5 Обоснование выбора морфологической группы в качестве ЛРС 61
ВЫВОДЫ ПО ГЛАВЕ 3 63
ГЛАВА 4. Морфолого-анатомическое изучение корневищ и корней любистка лекарственного 64
4.1 Морфологическая характеристика сырья 64
ВЫВОДЫ ПО ГЛАВЕ 4 77
ГЛАВА 5. Фитохимическое изучение корневищ и корней любистка лекарственного 78
5.1 Качественный анализ 78
5.2 Исследование углеводов 80
5.2.1 Выделение полисахаридов 80
5.2.2 Изучение химического состава углеводных фракций 81
5.2.2.1 Групповые качественные реакции на углеводы 81
5.2.2.2 Изучение мономерного состава углеводных фракций методом хроматографии на бумаге 83
5.2.2.3 Изучение мономерного состава углеводных фракций методом газожидкостной хроматографии (ГЖХ) 83
5.2.2.4 Изучение углеводных фракций методом ИК-спектроскопии 84
5.2.2.5 Изучение физико-химических характеристик пектинов 86
5.3 Исследование эфирного масла 88
5.3.1 Определение содержания эфирного масла 88
5.3.2 Определение подлинности изучаемых образцов эфирного масла 88 5.4 Исследование фенольных соединений 91
5.4.1 Качественное обнаружение фенольных соединений 91
5.4.2 Изучение фенольных соединений методом ВЭЖХ 97
5.4.3 Выделение кумаринов 102
5.4.4 Выделение производных фенолкарбоновых кислот 103
5.4.5 Спектральные характеристики выделенных фенольных соединений 105
5.5 Исследование аминокислотного состава 110
5.6 Исследование элементного состава 110
выводы по главе 5 114
Глава 6. Разработка норм качества сырья любистка лекарственного 116
6.1 Разработка оптимальной методики экстракции сырья 116
6.2 Спектральная характеристика спиртовых извлечений из корневищ и корней любистка лекарственного 118
6.3 Разработка методики ТСХ анализа 121
6.4 Количественное определение кумаринов 123
6.5 Количественное определение суммы фенольных соединений 129
6.6 Определение товароведческих показателей корневищ и корней любистка лекарственного 134
6.6.1 Определение числовых показателей 134
6.6.2 Определение микробиологической чистоты 136
6.6.3 Определение содержания тяжелых металлов 136
6.6.4 Определение содержания радионуклидов 137
ГЛАВА 7. Изучение фармакологической активности 142
7.1 Изучение «острой» токсичности 142
7.2 Изучение отхаркивающей активности 144
7.3 Изучение антибактериальной активности 144
7.4 Изучение спазмолитической активности 145
7.5 Изучение диуретической активности 146
7.6 Изучение желчегонной активности 148
Выводы по главе 7 151
Заключение 152
Список литературы
- Ареал распространения, биологические особенности и состояние агрокультуры любистка лекарственного
- Выделение полисахаридов из растительного сырья
- Определение семенной продуктивности и урожайности любистка лекарственного в условиях культуры
- Спектральная характеристика спиртовых извлечений из корневищ и корней любистка лекарственного
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Согласно данным Всемирной организации здравоохранения почти 80% населения нашей планеты предпочитают использовать для лечения препараты природного происхождения, поэтому, по-прежнему, актуальным является исследование и разработка лекарственных средств на основе растительного сырья.
Наряду с высоким и оправданным интересом исследователей к поиску принципиально новых источников фитопрепаратов заслуживают не меньшего внимания лекарственные растения, уже давно применяемые в медицине, но вместе с тем, имеющие не полностью раскрытый фармакотерапевтический потенциал. Научные сведения о многих из них, в частности, об их химическом составе, фармакологических свойствах были получены десятки лет назад в рамках, имевшихся в то время возможностей науки, и с тех пор практически не пополнялись.
Мировые статистические исследования показывают, что на долю заболеваний мочеполовой системы и патологий желчевыводящих путей среди населения Земли приходится около 70%. По данным той же статистики лекарственные средства, использующиеся в России при данной патологии, в большинстве синтетического происхождения. Препараты на основе природного сырья в основном выпускаются зарубежными фармацевтическими компаниями, и на российском рынке представлены биологически активными добавками (БАД). Однако такой путь на наш взгляд является нерациональным, так как в этом случае приходится применять БАДы практически постоянно. Кроме того, использование БАД не всегда эффективно при уже возникшей патологии, в то время как лекарственные препараты стандартизированы по биологически активным веществам, что повышает их качество и чем они выгодно отличаются от БАДов.
Особо актуальным представляется поиск лекарственных средств с направленным фармакологическим действием, например, диуретической и антимикробной активностями в сочетании с антиоксидантным эффектом, который
связан с содержанием полифенольного комплекса.
В этой связи наше внимание привлек любисток лекарственный (Levisticum officinale Koch.) из сем. сельдерейные (Apiaceae). Сырье любистка лекарственного включено в ряд зарубежных фармакопей, однако, в России используется только в традиционной медицине. Ограниченность использования данного сырья объясняется не только недостаточностью химических исследований, но и отсутствием современной нормативной документации.
А в связи с тем, что в целях рационального использования природного сырья основной акцент делается на разработку и внедрение новых конкурентоспособных, малоотходных и безопасных технологий, актуальным является изучение различных комплексов биологически активных соединений (БАС).
Особенно актуальна на сегодняшний день проблема преодоления зависимости отечественной фармацевтической промышленности от импортного сырья и лекарственных препаратов. Поэтому в настоящее время Правительство России разработало концепцию по развитию собственных возможностей производства инновационных отечественных лекарственных средств.
Таким образом, комплексное исследование химического состава, совершенствование нормирования качества, в зависимости от пути использования сырья и группы БАС, определяющих фармакологическую активность, является актуальной проблемой для фармацевтической науки и практики.
Степень разработанности темы исследования. В результате научных исследований ученых, в основном зарубежных, хорошо изучены такие классы соединений любистка лекарственного как эфирные масла, фталиды и полиацетилены. Изучена фармакологическая активность некоторых индивидуальных химических компонентов, характерных для видов рода Любисток и близкородственного рода Дудник. Несмотря на литературные данные, любисток лекарственный остается малоизученным, отсутствуют нормативные документы, регламентирующие подлинность и качество сырья, нет отечественных препаратов на основе его сырья.
Цель и задачи. Целью настоящей работы явилось фармакогностическое
изучение корневищ и корней любистка лекарственного, разработка норматив-4
ной документации (НД) на сырье, как потенциального источника получения БАС, обладающих желчегонной и мочегонной активностью.
Для реализации поставленной цели необходимо решить следующие задачи:
-
Изучить возможность культивирования любистка лекарственного в условиях Кавказских Минеральных Вод (КМВ, Ставропольский край).
-
Провести фитохимический анализ подземной части любистка лекарственного (полифенольных соединений, углеводов, эфирного масла, аминокислот, макро- и микроэлементов).
-
Установить морфолого-анатомические диагностические признаки и числовые показатели качества сырья.
-
Разработать методики стандартизации корневищ и корней любистка лекарственного в зависимости от пути использования.
-
Определить острую токсичность и провести предварительное изучение специфической биологической активности различных извлечений.
-
Разработать проект фармакопейной статьи «Любистка лекарственного корневища и корни» и инструкцию по его сбору и сушке.
Научная новизна. Проведенные интродукционные исследования, позволили прогнозировать выращивание этого вида и особенности интродукции в условиях культуры на КМВ.
Изучен химический состав эфирного масла подземных органов любистка лекарственного, выращенного в условиях КМВ. Методом газожидкостной хроматографии с последующим анализом масс-спектров идентифицировали 17 компонентов, из них 5 ранее не описанных для этого вида:
моноциклический терпен: эвкалиптол;
бициклический терпен: борнеол;
сесвитерпен: кариофиллен оксид;
сложные эфиры: линалил ацетат, нерил ацетат.
Методами бумажной, тонкослойной и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) идентифицированы 16 фенольных соединений, из них
11 впервые для данного вида:
фенолокислоты: галловая;
кумарины: ангелицин, кумарин;
флавоноиды: лютеолин, апигенин, кверцетин, гиперозид, кемпферол, ди-гидрокверцетин;
дубильные вещества: катехин, эпигаллокатехин.
В индивидуальном виде выделено 14 соединений, среди которых впервые для данного вида 3 фенолкарбоновые кислоты: эллаговая, галловая, цикориевая и 6 кумаринов: императорин, псорален, оксипейцеданин, остол, ангелицин, кумарин.
Впервые изучен полисахаридный комплекс (22,2-24,1%). Выделены растворимые в спирте этиловом 96% (0,45%), воде (4,7%), растворе аммония окса-лата (6,0%) и растворах щелочей (12,0%) углеводы. Установлен их моносаха-ридный состав. Количественно определены функциональные группы пектиновых веществ.
Проведено морфолого-анатомическое изучение корневищ и корней любистка лекарственного с учетом современных требований и установлены диагностические признаки сырья.
Впервые предложены методики оценки качества корневищ и корней любистка лекарственного, достоверно устанавливающие спектрофотометрическим методом содержание суммы кумаринов в пересчете на ангелицин и суммы фе-нольных соединений в пересчете на хлорогеновую кислоту.
Впервые изучен аминокислотный и минеральный состав подземных органов любистка лекарственного.
Установлены товароведческие показатели сырья (цельного, измельченного, порошка) и определены их нормы.
Скрининговые фармакологические исследования извлечений из сырья любистка лекарственного показали наличие антибактериальной, отхаркивающей, спазмолитической, диуретической и желчегонной активности.
Теоретическая и практическая значимость. Теоретическая значи-
мость исследования заключается в расширении знаний о химическом составе корневищ и корней любистка лекарственного, возможности его интродукции в условиях Ставропольского края и оценки урожайности различных видов сырья. Полученные данные в ходе фармакологического скрининга могут служить предварительным экспериментальным обоснованием перспективности использования исследованных субстанций в качестве лечебно-профилактических средств.
Практическая значимость исследования заключается в том, что в результате химического и фармакологического анализа доказана возможность использования отечественного сырья любистка лекарственного для производства препарата «Канефрон».
Предложен новый вид ЛРС для включения в Государственную фармакопею России XII издания.
Разработан унифицированный подход к стандартизации корневищ и корней любистка лекарственного в соответствии с современными требованиями и группой действующих БАС.
Разработаны проект ФС «Любистка лекарственного корневища и корни» и инструкция по сбору и сушке любистка лекарственного корневища и корни.
Результаты диссертационных исследований используются в учебных процессах на кафедре фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии ГБОУ ВПО СамГМУ Минздрава России и кафедрах фармакогнозии и ботаники ГБОУ ВПО КГМУ Минздрава России и ГБОУ ВПО ДВГМУ Минздрава России.
Методология и методы исследования. Методологической основой работы послужили методические рекомендации по расширению номенклатуры отечественных официнальных лекарственных растений, основанные на современных информационных ресурсосберегающих технологиях [Киселева Т.Л., 2009].
Фитохимические исследования проводились с использованием комплекса
различных физико-химических методов: тонкослойная хроматография (ТСХ),
бумажная (БХ), газожидкостная (ГЖХ), газожидкостная хромато-масс-спектрометрия (ГХ-МС), высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), спектрометрия в УФ-, видимой и ИК- областях, атомно-абсорбционная спектроскопия (ААС) и др.
Для выявления фармакологической активности использованы биологические методы анализа.
Положения, выносимые на защиту:
-
Результаты интродукционных исследований любистка лекарственного на территории КМВ.
-
Результаты изучения химического состава подземных органов любистка лекарственного физико-химическими методами.
-
Показатели подлинности и нормы качества «Любистка лекарственного корневища и корни», необходимые для разработки проекта нормативной документации.
-
Результаты изучения фармакологической активности сырья любистка лекарственного.
Степень достоверности и апробация результатов. Оценка степени достоверности научных результатов определяется большим объемом проанализированной информационной базы, использованием современных физико-химических, биологических методов анализа, позволяющих получать воспроизводимые и однозначные результаты их математико-статистической обработкой. Разработанные методики количественного определения валидированы.
Материалы исследования доложены и обсуждены на региональных конференциях «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (г. Пятигорск, 2012 г.) и «Инновационные идеи молодёжи Северного Кавказа – развитию экономики России» (г. Ставрополь, 2012 г.).
Работа была представлена на Международной научной конференции «Фундаментальные исследования» (Израиль, Тель-Авив, 16-23 октября 2013 г.), Международной научной конференции «Современные проблемы экспериментальной и клинической медицины» (Тайланд, Бангкок-Паттайя, 20-30 декабря
2013 г.), Международной научной конференции «Перспективы развития растениеводства» (Италия, Рим-Венеция, 21-28 декабря 2013 г.), Международной научной конференции «Современные проблемы экспериментальной и клинической медицины» (Тайланд, Паттайя, 19-27 февраля 2014 г.), Международной научной конференции «Фундаментальные исследования» (Доминиканская Республика, 13-22 апреля 2014 г.).
По теме диссертации опубликовано 17 научных работ, из них 7 в изданиях, рекомендованных ВАК.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 174 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы «Объекты и методы исследования», пяти глав экспериментальной части, заключения, списка литературы и приложения. В тексте содержится 46 таблиц, 40 рисунков. Список цитируемой литературы включает 230 источников, из них – 101 на иностранных языках.
Ареал распространения, биологические особенности и состояние агрокультуры любистка лекарственного
Согласно системе А.Л. Тахтаджяна род Любисток (Levisticum) принадлежит к отделу Magnoliophyta, классу Magnoliopsida, подклассу Rosidae, надпорядку Cornanae, порядку Apiales, подпорядку Apiineae, семейству Apiaceae, подсемейству Apioideae, трибе Peucedaneae [107].
По одним источникам род Любисток является монотипным [17, 124]. По другим включает 3 вида, характерных для западной Европы, Малой Азии и Ирана. Во флоре России и странах СНГ встречается 1 вид [83].
В трибу Peucedaneae кроме рода Angelica входят еще 18 родов, многие виды хорошо известны в качестве пищевых, лекарственных и ядовитых растений: Levisticum (любисток), Ferula (ферула), Peucedanum (горичник), Anethum (укроп) и др. [107].
Родовое название Levisticum введено John Hill в 1756 г., но основоположник принятой в настоящее время системы ботанических наименований Карл Линней, в 1737 г. ввел для рода Любисток название Ligusticum. При этом John Hill признавал идентичность названий Levisticum или Ligusticum [15].
Происхождение термина Ligusticum также связано с древнеримским врачом Диоскоридом, который назвал любисток лигурийским сельдереем, потому что его выращивали в Лигурии (область в западной части Северной Италии). Другой древнеримский врач Гален немного изменил латинское название, и получилось Levisticum, которое в немецком трансформировалось в liebesstuckel, а затем и в liebstock («liеb» по-немецки означает «любовь») [51]. В России закрепились названия «любисток» и «заря» («зоря»), в Европе Lovage [17].
Любисток лекарственный относят к роду Levisticum Hill., а идентичность видовых названий Ligusticum и Levisticum отражена в названии «Лигустикум лю-бистоковый», приравненный к «Любисток лекарственный» (Ligusticum levisticum L. = Levisticum officinale Koch) [15, 146, 224].
Выделенные в настоящее время два рода Ligusticum и Levisticum, искусственно объединяют разнородные растения [171]. По-видимому, систематика растений, исторически построенная на ботаническом описании, не всегда отражает биологическое родство ввиду зависимости фенотипа от средовой экспрессии генов. Поэтому в настоящее время происходит пересмотр системы этого семейства в результате изучения молекулярной эволюции по итогам секвенирования спей-серных участков рДНК [108].
Любисток лекарственный (Рисунок 1) – многолетнее травянистое растение высотой до 2 м, с толстым корневищем и крупными многоглавыми корнями. Стебли многочисленные, прямостоячие, в верхней части ветвистые, цилиндрические, полые, бороздчатые. Листья крупные, влагалищные, длинночерешковые, дважды- трижды перисто-рассеченные, темно-зеленые, сверху блестящие. Средние листья имеют меньшие размеры, короткочерешковые, верхние – сидячие, с расширенным влагалищем и почти неразвитой пластинкой. Цветки мелкие, беловато-желтоватые, соцветие сложный зонтик с общей оберткой и оберточкой, расположенный на конце ветви. Плод – желто-бурый вислоплодник.
Разновидности употребляемых в пищевых и лечебных целях любистков имеют общее происхождение и несущественные различия, связанные с климатом, характером почвы и условиями среды обитания, последствиями окультуривания, гибридизации и одичания. Рисунок 1 – Внешний вид любистка лекарственного 1.2 Химический состав любистка лекарственного
Химический состав любистка лекарственного изучен недостаточно. Известно, что корни содержат эфирное масло (0,2-1,7%), в состав которого входят фталиды (до 70%) такие как: 3-бутилфталад, цис- и транс- бутилденефта-лид (лигустикум лактон), цис- и транс- лигустид, лигустилид, сенкиунолид, леви-столид А и B [175, 202, 218, 221], а также терпены: - и -пинен, карвакрол, - и -фелландрен, - и - терпинен, камфен, мирцен; фурокумарины: бергаптен, псорален, умбеллиферон, ситостерол и -ситостерол-3-О-гликозид; смолы (в составе которой -ситостерин и ангеликовая кислота); рутин; коричные кислоты: феруловая, кофейная, хлорогеновая, кумаровая и органические: яблочная, аскорбиновая; углеводы: крахмал и камедь [83, 135,160].
Выделены и установлены структуры (Z) –лигустилида, ангеолида, фалька-риндиола, фалькаринола, левистолида и 5 димеров лигулистида [140,151, 176]. Разработаны параметры определения методами ТСХ, ВЭЖХ и ГХ-МС в корнях любистка фалькариндиола и (Z)-лигулистида [152].
Показано, что значительная часть экстрактивных веществ представлена легко- и трудногидролизуемыми полисахаридами (19,7%) и лигнином (12,1%), а также, что основными классами соединений являются полифенолы, дубильные вещества, горькие гликозиды и водорастворимые органические кислоты [41].
К наиболее изученным в химическом отношении относятся эфирные масла. Основными компонентами эфирного масла, полученного из растений, культивируемых в европейских странах, являются: -фелландрен (0,1-48,9%), пентилцик-логексадиен (0-12,3%), транс-сабинел ацетат (0-12,1%), -терпинел ацетат (0-26,1%), (Z)-3-бутилиден фталид (0,1-31,2%), и (Z)-лигустилид (0,2-70,9%). Фта-лидные изомеры преобладали (73,2-82,6%) в маслах образцов любистка лекарственного из Эстонии, Франции и Бельгии. Эфирное масло подземных органов любистка лекарственного, выращенного в Шотландии было богато -фелландреном (48,9%) и фенилацетальдегидом (17,2%). Максимальное содержание ацетатов транс-сабинела и -терпинела (38,2%) было найдено в образцах из Голландии. Эстонский образец содержал в больших количествах (Е)-лигустилид (52,4-70,9%) и пентилциклогексадиен (12,3%). При этом в эфирном масле, полученном из листьев любистка лекарственного в больших количествах содержатся -терпенел ацетат (55,8%) и -фелландрен (11,3%), содержание (Z)-лигулистида (17,0% ) было меньше, по сравнению с содержанием в корнях [153, 219, 222].
Корневища и корни любистка лекарственного, выращенного во Франции, в составе эфирного масла содержат монотерпены: -пинен (0,59%), -пинен (0,85%) и -фелландрен (1,63%); углеводороды: фенил-гептан (0,48%), n-пентил цикло-гексадиен (3,96%) и фталиды: (Z)-3-пропилиден-фталид (1,16%), (Z)-3-бутилиден-фталид (1,93%), (Z)-лигустилид (70,57%), (Е)-лигулистид (2,82%) и (Z)-3-валиден-3,4-дигидрофталид (1,61%) [192].
Иранские образцы эфирного масла в качестве основных компонентов содержали -фелландрен (42,5%), -терпинеол (27,9%), цис-оцимен (7,5%) и дегид-ро-1,8-цинеол (6,8%) [150].
В эфирном масле, полученном из подземных органов любистка лекарственного, выращенного в Китае, доминирующими были -фелландрен (16,47%), ци-тронеллаль 12,85%) и лигустилид (20,94%) [130].
В эфирном масле, полученном в целом из надземной части любистка лекарственного, произрастающего в Иране, основными компонентами являлись терпи-нил-ацетат (40,5%) и -фелландрен (16,7%) [154]. При этом в листьях преобладали - терпинен ( 14,52%), -фелландрен (13,85%) и (Z)--оцимен (12,91%); в стеблях -терпинен (12,86%), -терпинеол (10,81%) и (Z)--оцимен (10,42%); в семенах (Z)--оцимен (23,70%), -фелландрен (15,54%) и -терпинен (12,37%). В корнях этих же образцов – -терпинен (12,56%), -пинен (8,47%) и (Z)--оцимен (8,89%) [223].
Выделение полисахаридов из растительного сырья
Интересно, что стереохимия фалькаринола и фалькариндиола не оказывает значительного влияния на антимикобактериальную деятельность и, что стереосе-лективное ингибирование фермента может быть исключено в качестве активного начала [134, 210, 213]. В целом результаты показывают, что данные полиацетилены заслуживают дальнейшего внимания как потенциальные источники новых ан-тимикобактериальных антибиотиков.
Кроме того, внутрибрюшинное или per os применение фалькариндиола у мышей привело к гепатопротекторным эффектами за счет уменьшения сыворотки GPT (глутаминовой пировиноградной трансаминазы), и вызвало рост GOT (глу-таминовой щавелевоуксусной трансаминазы) после D- галактозаминного и липо-полисахаридного поражения печени [226].
Falcarinol и falcarindiol обладают значительной цитотоксичностью [141, 178]. Установлено противораковое действие при употреблении данных полиацетиленов в составе овощей [145, 157, 181, 229].
Лигустразин [189] обладает широким спектром фармакологической активности по влиянию на сердечнососудистую систему, имеет мощный противотром-ботический потенциал и высокую эффективность при лечении цереброваскуляр-ных заболеваний [208, 228].
Сесквитерпеноиды бициклической группы (a- и -пинены) обладают местно-раздражающим, антисептическим, отхаркивающим и диуретическим действием [203].
Изучено действие некоторых кумаринов, спектр которых чрезвычайно разнообразен [19]. Так, императорин и ксантотоксин ингибируют активность ацетил-холинэстеразы [205] и наряду с экстрактом из листьев проявляют антипролифера-тивную активность [204], императорин дозозависимо обладает антиконвульсивным действием [187], императорин и изобергаптен – антифунгальным [184]. Исследованы свойства архангелицина: в экспериментах на животных это вещество при пероральном или внутрибрюшинном введении оказывает противосудорож-ное, расслабляющее мышцы и успокаивающее действие [129]. Бергаптен, оксипеуцеданин и ксантоксол используют для лечения лейко-дермии [36, 82] и псориаза [162].
Спазмолитической активностью обладают бергаптен, ксантоксин, остол [162], изопимпинеллин, императорин [82], изоимператорин, ксантоксол, умбел-лиферон [2], пимпинеллин, оксипеудцеданин и др. [2].
У остола выявлена антипролиферативная активность [137], умбеллиферона – фунгицидная, бактерицидная и противовоспалительная [3]. Кроме этого, остол снижает выделение вирусов гепатита B, ингибирует вагинальные трихомонады, соответственно экстракты любистка используют для лечения заболеваний половой сферы, невралгии, артрита и грибковых заболеваний [9], атамантин оказывает спазмолитическое, гипотензивное, анаболическое, антиоксидантное, мембрано-стабилизирующее, противовоспалительное действие [93].
Кумарины, в частности псорален, обладают фунгистатической активностью. В пределах эталонных препаратов (нитрофунгин, сангвиритрин) рост поверхност ных дерматитов задерживают 5-оксикеллин и императорин. Более широким спек тром ингибирующего действия обладает ангелицин, фунгистатическое действие которого заметно проявляется на следующих штаммах возбудителей: Trichophyton rubrum, T. mentagrophytes, Microsporum canis, Aspergillus niger и Candida albicans [19].
Не менее важными фармакологически активными компонентами любистка являются фенольные кислоты [47]. В частности феруловая кислота обладает ан-типролиферативными свойствами [169, 170]. Влияние феруловой кислоты на ате-рогенез и гиперлипидемию продемонстрировано в экспериментальных условиях на кроликах [207]. Соли феруловой кислоты способны влиять на феномен репер-фузии мозговой ткани после ишемического повреждения [225]. Феруловая кислота обладает мощным антиоксидантным эффектом, что продемонстрировано в ряде исследований [144, 155].
При изучении влияния феруловой кислоты на перекисное окисление липи-дов в эксперименте со стрептозотоциновым диабетом, применение феруловой ки 24
слоты вызывало снижение уровня гликемии, гидропероксидаз, свободных жирных кислот, при этом наблюдалось повышение активности супероксиддисмутазы, каталазы, глулатионпероксидазы и расширение панкреатических островков в поджелудочной железе [168].
Феруловая кислота оказывает синергический антиоксидантный эффект при совместном применении с -токоферолом, -каратином [136]. Кроме того, феруловая кислота обладает мощным гепатопротекторным эффектом [179, 182].
Хлорогеновая кислота также обладает широким спектром биологической активности. Доказано ее действие в качестве антибактериального, противовирусного, противовоспалительного, гепатопротекторного, антимутагенного и гипотензивного биологически активного вещества. Установлены ее пребиотические свойства [48, 110]. Хлорогеновая кислота и ее производные оказывают более сильный антиоксидантный эффект, чем аскорбиновая кислота, кофейная кислота и токоферол (витамин Е), может эффективно удалить ДФПГ радикал, гидроксильный радикал и супероксид анион радикалы, подавлять липопротеины низкой плотности окисления [126, 132].
Замещенные коричные кислоты, являются промежуточными веществами синтеза лигнина из аминокислот (фенилаланина и тирозина). Известны работы, в которых хлорогеновая кислота рассматривается как регулятор ростовых процессов, как защитный фактор по отношению к некоторым микроорганизмам [120].
Определение семенной продуктивности и урожайности любистка лекарственного в условиях культуры
Анализ проводили по методикам указанным в разделе 2.2.9. Различий физико-химических свойств пектинов в ВРПС и ПВ фракциях не установлено.
Пектины имеют кислую реакцию среды в пределах рН от 3,1 до 3,6, что исключает раздражающее влияние на слизистую оболочку желудка при их перо-ральном применении.
Титриметрическим методом определено содержание в ВРПС и ПВ свободных (Кс) 0,54±0,11% и 0,18±0,02% и этерифицированных (Кэ) 2,70±0,16% и 3,24±0,20% карбоксильных групп соответственно. Степень этерификации () при этом составляет 84,50±,5,19% и 94,70±2,36%, а, следовательно, относятся к высо-коэтерифицированным пектиновым веществам.
Эти данные свидетельствуют о перспективности галактуронидов в качестве энтеросорбентов, а значит, и как антиоксидантов, а также вспомогательных компонентов при изготовлении лекарственных форм другого назначения.
С фармакологической точки зрения наибольший интерес из всех обнаруженных углеводов представляет галактуроновая кислота (мономер пектина), имеющая значение и как лекарственное (энтеросорбент, антимикробное), и как вспомогательное (стабилизатор, пролонгатор, наполнитель) вещество [80]. Поскольку содержание уроновых кислот отмечено во всех фракциях, они дополнительно исследованы на наличие галактуроновой кислоты методом спектрофото-метрии по реакции с карбазолом (раздел 2.2.8). В обоих случаях на спектрах вы-
явлен максимум поглощения при длине волны 530 нм, характерный для уронидов даже при совместном присутствии нейтральных углеводов (Рисунок 21).
Характер спектра, а именно: положение максимума светопоглощения при 530 ± 2 нм, отсутствие других максимумов (характерных для восстанавливающих сахаров), выраженный пик, доказывают наличие галактуроновой кислоты в анализируемом объекте. Используя известную расчетную формулу [34], в сравнении со стандартным образцом галактуроновой кислоты, содержание полигалактуро-новой кислоты в сырье составило во фракции ВРПС - 32,5±1,25%, ПВ -58,8±2,43% и ГЦ - 20,1±1,5%.
Таким образом, учитывая достаточно высокий выход углеводов из подземных органов любистка лекарственного (22,2-24,1%), полисахариды можно считать перспективными в отношении фармакологических исследований и учитывать их в качестве целевого продукта при комплексной переработке сырья [61]. 5.3 Исследование эфирного масла
Многочисленными исследованиями, установлено, что количественное содержание эфирного масла и его химический состав во многом зависят от вида и даже подвида растения, места и условий его произрастания, фазы вегетации, метеорологических условий и времени суток на момент сбора, а также от условий сушки и хранения сырья с момента сбора и до момента анализа [54].
Эфирное масло получали методом перегонки из воздушно-сухого сырья (метод 3 – Клевенджера) водяным паром с добавлением толуола [56, 166]. Время гидродистилляции составляло 4 часа. Эфирное масло отделяли от воды эфиром диэтиловым и в течение 12 часов высушивали над фосфора (V) оксидом в эксикаторе.
Содержание эфирного масла в различных образцах сырья составляло от 1,2 до 2,4% и представляло собой густую жидкость темно-желтого цвета, с характерным запахом и приятным вкусом.
Полученные образцы эфирного масла анализировали согласно требованиям ОФС ГФ XI «Масла эфирные» и соответствующих методик ГФ XI и XII изданий [24, 25, 26]. Физико-химические показатели исследуемых эфирных масел представлены в таблице 14. Таблица 14 – Физико-химические показатели эфирного масла любистка лекарственного Показатели плотность угол вращения показа-т ель преломления темпер ат ура затвердевания, 0С кислот -ноечисло(IA) эфирноечисло(IE) 1,032-1,047 +40– +60 1,546-1,554 -2 8,02-14,38 221-248 Полученные данные о физико-химических свойствах эфирного масла выделенного из корневищ и корней любистка лекарственного согласуются с литературными [16, 21].
Растворимость в спирте этиловом дает представление не только о подлинности, но и о качестве масла. Большинство углеводородов плохо растворимо в спирте (особенно в разведенном), поэтому по растворимости можно судить об их количестве в масле. В равной степени по растворимости можно определить и примесь жирных масел. Растворимость эфирного масла любистка лекарственного в спирте этиловом приведена в таблице 15.
Подлинность масла определяли по органолептическим характеристикам (цвет, прозрачность, запах и вкус). Более надежной оценкой подлинности является анализ методом ГЖХ, а при необходимости – методом хромато-масс-спектроскопии (раздел 2.3.1).
Оценка качественного состава эфирных масел методом ГЖХ может быть затруднена в связи с наличием стереоизомеров, дающих близкие времена удерживания при хроматографии. В связи с этим, работа по идентификации компонентов эфирного масла исследуемых образцов была проведена методом газожидкостной хромато-масс-спектрометрии (раздел 2.3.1).
В корневищах с корнями любистка лекарственного идентифицировали 17 компонентов, что составляет 97,67% от всех обнаруженных. Доминирующими компонентами являются бициклические монотерпеновые углеводороды: линалоол
Сравнивая полученные данные с литературными, следует, что компонентный состав эфирного масла из любистка лекарственного, выращенного в условиях Кавказских Минеральных Вод, отличается от всех ранее исследованных образцов, полученных от растений из других регионов РФ, стран Европы, Азии и Ближнего Востока, и в тоже время отличается наиболее высоким показателем общего выхода эфирного масла (раздел 1.2).
Проведя данный фрагмент работы, мы убедились, что изученные нами образцы эфирного масла отличались от ранее исследованных как по составу, так и по количеству идентифицированных компонентов, в связи, с чем считаем, что проводить стандартизацию сырья, только по показателю «Эфирное масло» нецелесообразно. 5.4 Исследование фенольных соединений
Менее изученной группой биологически активных соединений в корневищах и корнях любистка лекарственного являются фенольные соединения, особенно кумарины (раздел 1.2), притом, что для многих из них доказан выраженный фармакологический эффект (раздел 1.3). Данные соединения до настоящего времени не выступали в качестве аналитической или ведущей группы БАС в корневищах и корнях любистка лекарственного. В связи с этим нами проведено изучение фенольных соединений с целью разработки методик качественной и количественной оценки изучаемого сырья.
Спектральная характеристика спиртовых извлечений из корневищ и корней любистка лекарственного
В результате товароведческого анализа устанавливали показатели доброкачественности корневищ и корней любистка лекарственного, выращенного в природно-климатических условиях КМВ.
Определение числовых показателей Для характеристики анализируемого сырья определены следующие показатели: влажность, зола общая, зола, нерастворимая в 10% растворе кислоты хлористоводородной, содержание экстрактивных веществ, примесей, степень измель-чённости [24, 25, 68]. Результаты анализа (n=6) товароведческих показателей представлены в таблице 37.
Содержание экстрактивных веществ достигало максимальных значений при использовании в качестве экстрагента 40% спирта этилового и воды очищенной, что обусловило перспективность использования данных экстрагентов при получении фитосубстанций.
Исходя из полученных данных, считаем целесообразным установить следующие нормы числовых показателей.
Цельное сырье. Влажность – не более 12%; золы общей – не более 10%; золы, нерастворимой в 10% растворе кислоты хлористоводородной – не более 2%; корневищ и корней, потерявших окраску – не более 5%; корневищ с остатками листьев – не более 2%; частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 7 мм – не более 5%; органической примеси – не более 1%; минеральной примеси – не более 1%.
Измельченное сырье. Влажность – не более 12%; золы общей – не более 10%; золы, нерастворимой в 10% растворе кислоты хлористоводородной – не более 2%; корневищ и корней, потерявших окраску – не более 3%; частиц, не проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 7 мм – не более 3%; частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 2 мм – не более 5%; органической примеси – не более 1%; минеральной примеси – не более 1%.
Порошок. Влажность – не более 10%; золы общей – не более 10%; золы, нерастворимой в 10% растворе кислоты хлористоводородной – не более 2%; частиц, не проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 2 мм – не более 10%.
Контроль качества лекарственного растительного сырья на микробиологическую чистоту проводили согласно статье ГФ XII «Методы микробиологического контроля лекарственных средств» [25]. Выполняя экспериментальное исследование, нами учитывался риск получения ложных микробиологических результатов при контроле качества лекарственных средств [29].
Бактерии (в 1 г)норма – не более 107аэробных бактерий Грибы (в 1 г)норма – не более 105дрожжевых и плесневыхгрибов Escherichia coli (в 1 г) норма – не более102 2,0х102 2,0х102 Не обнаружено Исходя из приведенных в таблице 38 данных, образцы исследуемого сырья по показателю микробиологической чистоты соответствовали требованиям ГФ ХII (категория 4А). Определение содержания тяжелых металлов Содержание тяжелых металлов и железа определяли по методике ГФ XII издания в зольном остатке после сжигания сырья.
Окраска, появившаяся в испытуемом растворе, не превышала окраски эталонного раствора, что свидетельствует о соответствии всех образцов сырья по содержанию тяжелых металлов требованиям ГФ XII.
С позиции оценки экологической чистоты ЛРС прежде всего необходимо определение концентраций кадмия, свинца и ртути [31].
Проблема становится актуальной и в связи с тем, что тяжелые металлы из ЛРС могут переходить в лекарственные формы [91].
Таким образом, нормирование содержания тяжелых металлов в сырье и фитопрепаратах – одна из важнейших задач современной науки, решение которой позволит гарантировать безопасность ЛРС и фитопрепаратов для населения.
В настоящее время отсутствует общая фармакопейная статья по определению тяжелых металлов в ЛРС, поэтому для повышения безопасности применения ЛРС, используют метод нормирования 3 наиболее опасных тяжелых металлов (свинца, кадмия и ртути), определяемых методом атомно-абсорбционной спектроскопии. Нормой допустимого предела содержания тяжелых металлов служат показатели для БАД растительного происхождения, согласно действующему СанПин [31, 91, 99].
Концентрации тяжелых металлов (свинца, кадмия и ртути) в сырье определяли методом атомно-абсорбционной спектроскопии по методике ГОСТ 30178-96 «Сырье и продукты пищевые. Атомно-абсорбционный метод определения токсичных элементов». Результаты исследования представлены в таблице 39.
Согласно ОФС 42-0011-03, в растительном сырье нормируется содержание радионуклидов техногенного происхождения, в первую очередь Sr-90 и Cs-137, источниками которых являются АЭС и предприятия по переработке отходов ядерной промышленности [76]. Установлено, что накопление Sr-90 происходит, в основном, в органах многолетних растений (кора крушины, кора дуба, некоторые корневища). Переход Sr-90 из лекарственного сырья в водные извлечения составляет 5-8%, что объясняется интрацеллюлярным накоплением Sr-90 в растениях и выраженной способностью к комплексообразованию. Из 40 известных изотопов цезия действующая нормативная документация регламентирует содержание только Cs-137. Цезий является аналогом щелочных металлов (натрия, калия, лития), способность к комплексообразованию с БАВ у него не выражена. Основным для человека является пероральный путь поступления Cs-137 при употреблении загрязненных продуктов питания [76].
C точки зрения радиологической безопасности исследуемые образцы растительного сырья не представляют опасности, так как накапливают до 1% Cs-137 и 0,15-0,30 % Sr-90 от допустимого нормативной документацией уровня (Таблица 40).