Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Современное состояние ботанических, фитохимических и биологических исследований видов рода Alchemilla 11
1.1 Ботаническая характеристика видов рода Манжетка 11
1.1.1 Систематическое положение рода Alchemilla (Манжетка) 11
1.1.2 Ботаническая характеристика видов рода Alchemilla 14
1.1.3 Распространение видов рода Alchemilla
1.2 Сведения о химическом составе некоторых видов рода манжетка 23
1.3 Использование видов рода Alchemilla (Манжетка) в традиционной медицине 26
1.4 Использование видов манжетки в научной медицине 28 Заключение по обзору литературы 30
Глава 2 Объекты и методы исследования
2.1 Объекты исследования 32
2.2 Методы исследования
2.2.1 Химические реакции 32
2.2.2 Хроматографические методы 33
2.2.3 Спектральные методы 37
2.2.4 Титриметрические методы 38
2.2.5 Гравиметрические методы 38
2.2.6 Ресурсоведческие исследования 38
2.2.7 Методы морфолого-анатомического исследования 38
2.2.8 Фармакологические методы исследования 39
2.2.9 Определение микробиологической чистоты 39
2.3.0 Методы статистической обработки 40
Глава 3 Ресурсоведческая характеристика травы манжетки тринадцатилопастной в некоторых районах Северного Кавказа
3.1 Определение запасов травы манжетки тринадцатилопастной 41
3.2 Расчет объема возможных ежегодных заготовок сырья манжетки 44
3.3 Морфолого-анатомическое исследование травы манжетки тринадцатилопастной 45
Выводы по главе 3 54
Глава 4 Фитохимическое исследование травы манжетки тринадцатилопастной и разработка норм качества сырья 56
4.1 Качественный анализ травы манжетки тринадцатилопастной 57
4.2 Хроматографическое изучение
4.2.1 Хроматографический анализ флавоноидов 57
4.2.2 Хроматографический анализ аскорбиновой кислоты 61
4.2.3 Изучение органических кислот методом ВЭЖХ 61
4.2.4 Изучение полисахаридов 62
4.2.5 Изучение фенольных соединений методом ВЭЖХ 64
4.3 Количественное определение биологически активных веществ 65
4.3.1 Определение содержания флавоноидов 65
4.3.1.2 Валидация методики количественного определения флавоноидов 69
4.3.2 Количественное содержание дубильных веществ 71
4.3.3 Количественное определение кислоты аскорбиновой 72
4.3.4 Количественное определение аминокислот 73
4.3.5 Содержание макро -и микроэлементов в траве манжетки тринадцатилопастной 74
4.4 Определение норм качества травы манжетки тринадцатилопастной 75
Выводы по главе 4 83
Глава 5 Исследование "острой" токсичности, ранозаживляющего, противовоспалительного и антиоксидантного действия сухого экстракта
манжетки тринадцатилопастной 85
5.1 Получение сухого экстракта 85
5.2 Изучение "острой" токсичности
5.2.1 Обоснование дозы сухого экстракта манжетки для проведения изучения фармакологической активности 88
5.2.2 Изучение противоожоговой активности 89
5.2.3 Изучение ранозаживляющего действия 90
5.3 Содержание антиоксидантов в экстракте травы манжетки тринадцатилопастной 91
Выводы по главе 5 97
Заключение 99
Список литературы 1
- Сведения о химическом составе некоторых видов рода манжетка
- Фармакологические методы исследования
- Морфолого-анатомическое исследование травы манжетки тринадцатилопастной
- Изучение органических кислот методом ВЭЖХ
Сведения о химическом составе некоторых видов рода манжетка
Alchemilla (Манжетка) — род многолетних, редко однолетних травянистых растений, включающий около 40 трудноразличимых видов, по поводу которых у ботаников нет единого мнения. Наиболее распространенным сборным видом считается манжетка обыкновенная [24]. Большинство видов отличается соматическим партеногенезом (развитие эмбриона из яйцеклетки без участия мужского гаметофита), поэтому из огромного большинства представителей рода описаны лишь незначительные по количеству, наиболее распространенные виды. Виды манжеток столь похожи друга на друга, что для их точного определения необходимо пользоваться специальными руководствами.
Виды рода Манжетка – многолетние травянистые растения высотой 10-45 см с толстым корневищем, покрытым отмершими листьями. Гемикриптофиты. Стебель прямостоячий или приподнимающийся, голый или опушенный. Прикорневые листья длинночерешковые, толстые, округлые, пальчатолопастные, по краю зубчатые, голые, или опушенные, образуют розетку, стеблевые листья короткочерешковые, более мелкие, с двумя прилистниками [24].
Цветки обоеполые, правильные, на длинных цветоножках, собраны в метельчатое соцветие или по несколько штук в плотные клубочки (завитки, улитки, полузонтики), которые образуют сложное соцветие. Чашечка из 4 желто-зеленых чашелистиков колокольчатая; лепестки желто-зеленые [129].
У видов Alchemilla, как и у видов Sanquisorba и Agrimonia, входящих в одну трибу Sanquisorbae (Poteriae) плодом является одноорешек – односемянной невскрывающийся монокарпий.
У видов Alchemilla и Sanquisorba число тычинок андроцея по сравнению с другими идами родов Poterium и Agrimonia уменьшается до 4-8-9 [1,28]. Манжетка обыкновенная – сборный вид, распадающийся на многие десятки мелких видов, чрезвычайно схожих морфологически, различаемых лишь немногими специалистами-систематиками [28].
Народные названия: богова слезка, бухарка лесная, рута, горлянка сердечная, звездочная трава, лягушник малый, межперстница, триперестница, росник обыкновенный, заячья капуста, шапка медвежья. Свое народное название манжетка приобрела благодаря изящным резным листьям, которые имеют красивую бахромчатую каемку. С манжетки обыкновенной (Alchemilla vulgaris), собственно, и начинается перечень распространенных у нас видов. В него входят: м. мягкая (A. mollis), м. альпийская (A. alpina L. = A. glomerata), м. Хоппе (A. hoppeana), м. Элленбека (А. ellenbeckii), м. соединенная (A. conjuncta), м. красночерешковая (A. erythropoda), м. сибирская (A. sibirica).
Манжетка обыкновенная – многолетнее травянистое растение высотой от 5 до 50 сантиметров. Корневище с белыми корешками, ползучее. Листья округлые, восьми или десяти лопастные, с обеих сторон волосистые, края с мелкими зубцами. Есть так же голые, но встречаются реже.
Цветы зелёно-жёлтые, маленькие, собраны в плотные зонтики. Цветет с мая по июль. Вторичное цветение может наблюдаться с августа по сентябрь, очень редко октябрь. После дождя, в листьях манжетки собирается вода, которая не смачивает лист, из-за расположенных волосков. Существует так же мнение, что обильная влага, выделяется самой манжеткой. Встречается в кустарниках, в светлых редких лесах, так же на лугах, и в сухих канавах. Манжетка альпийская гораздо ниже (высотой около 15 см), замечательно подходит для маленькой альпийской горки. Этот компактный вид тоже долго цветёт и имеет изящные пальчато-рассечённые листья, покрытые снизу серебристым опушением. Красивые листья и нежные соцветия разнообразных манжеток хороши в букете, они широко используются флористами в цветочных композициях. М. мягкая часто выращивают в травянистом бордюре, но для альпинария она слишком велика. М. альпийская не такая Рисунок 1 – Alchemilla vulgaris высокая и не имеет вид кочек, образованных лопастными листьями. Летом на длинных слегка растопыренных веточках появляются соцветия мелких желтоватых цветков, но выращивают манжетку ради листьев. Достоинство манжетки в том, что она хорошо растет на каменистой горке и на торфяной клумбе, а недостаток – она легко размножается семенами и может засорить участок. Манжетка сверкающая выращивается и в качестве бордюра, и в крупном рокарии, и как эффектное почвопокровное растение. От её ползучего корневища отходят приподнимающиеся стебли высотой около 20-30 см; лопасти листьев по краю зубчатые.
Фармакологические методы исследования
Для морфолого-анатомических исследований были взяты образцы цельного и измельченного сырья травы манжетки тринадцатилопастной, собранные в Карачаево-Черкесской Республике (Даутское ущелье) в 2007 году в период цветения.
Цельное сырье представляет собой смесь олиственных стеблей с цветками и плодами различной степени развития и отдельных стеблей, цельных или измельченных листьев, цветков, плодов (рис. 8).
Трава манжетки тринадцатилопастной (цельное сырье) Стебли полые, цилиндрические, тонкие, ребристые длиной до 30 см, в нижней части покрыты рыхло прилегающими волосками. Листья супротивные, черешковые, простые, черешок короткий, край листа пильчатый, жилкование перистое, поверхность листа голая, снизу только по главным жилкам рыхло прилегающие волоски, размеры листовой пластинки длиной 11-13 см, шириной 5-7 см. сверху голые. Соцветие крупное, очень рыхлое, метельчатое, цветоножки голые. Цветки 5-6 мм в диаметре, желтые. Цвет сырья желто-зеленый, вкус терпкий, вяжущий, слегка горьковатый, запах слабо-бальзамический.
Измельченное сырье – кусочки стеблей желто-зеленого цвета, листьев светло-зеленого цвета, соцветий, желтых цветков, проходящие сквозь сито с отверстиями диаметром 7 мм. Вкус сырья терпкий, вяжущий, слегка горьковатый, запах слабо-бальзамический (рис. 9) [11, 24, 84].
Трава манжетки тринадцатилопастной (измельченное сырье) Порошок травы желто-зеленого цвета, проходящий сквозь сито с отверстиями 1 мм. Вкус сырья терпкий, вяжущий, слегка горьковатый, запах слабо-бальзамический. Для анатомических исследований были использованы фиксированные (70% этанол + глицерин + вода) образцы вегетативных органов цельной и измельченной травы манжетки тринадцатилопастной (стебель, лист). Материал подвергался просветлению в растворе хлоралгидрата. Микропрепараты изучали на интерференционно-поляризованном микроскопе BIOLAR. Снимки фотографировали цифровым аппаратом SONY SCN на фотобумагу Kodak. Лист. При рассмотрении временного микропрепарата листа с поверхности (рис.10) видны крупные многоугольные клетки верхнего эпидермиса со слабоизвилистыми стенками, у которых имеются неутолщенные антиклинальные стенки. Эпидермальные клетки жилок имеют вытянутую форму и прямые антиклинальные стенки. Вокруг жилок в эпидермальных клетках обнаружены друзы оксалата кальция. Рисунок 7 – Фотография эпидермы верхней стороны листа манжетки тринадцатилопастной (ув. 78) Клетки нижнего эпидермиса (рис. 11, 12), в отличии от аналогичных клеток верхнего эпидермиса имеют большую извилистость стенок клеток. Размеры клеток верхнего и нижнего эпидермиса примерно одинаковые и покрыты кутикулой толстой и складчатой. На обеих сторонах листа расположены погруженные устьица, устьичные щели которых ориентированы в разные стороны. Устьица окружены 3-4 одинаковыми околоустьичными клетками. На эпидермисе листа видны простые одноклеточные волоски, располагающиеся в основном вдоль главной жилки. Листовая пластинка дорзовентрального типа. Мезофилл дифференцирован. Палисадный мезофилл однорядный и перпендикулярен поверхности листа. Он прерывается в области главной жилки и боковой жилки. В зоне выступов главной жилки сразу под верхней и нижней эпидермой расположена механическая ткань – кутикула. Клетки губчатой паренхимы расположены обычно рыхло и имеют крупные межклетники. Проводящая система пучкового типа. Пучки закрытые, коллатеральные. Проводящий пучок центральной жилки имеет подковообразную форму.
Простые одноклеточные волоски встречаются только на нижней эпидерме в области центральной жилки [11]. Рисунок 12 – Фотография поперечного среза листа манжетки тринадцатилопастной (ув. 78)
Черешок. На поперечном сечении черешок листа в нижней части имеет седловидную форму и два острых выступа на абаксиальной стороне. Под однослойной эпидермой расположена колленхима в 2-3 слоя клеток. Проводящая система тканей представлена тремя коллатеральными округлыми проводящими пучками. Вентральный пучок (центральный) отличается по размеру от двух дорзальных. Сосуды ксилемы расположены рядами (рис. 13).
Стебель на поперечном сечении имеет цилиндрическую форму. Покровная ткань представлена эпидермой с кутикулой. Кора состоит из колленхимы пластинчатого типа, клетки которой расположены в один сплошной слой. Сразу под колленхимным слоем расположена хлоренхима и выполняющая паренхима. Завершающим слоем коры является эндодерма, клетки ее паренхимной формы расположены в один слой. Ткани центрального цилиндра обособляет перициклическая зона, которая дифференцирована в склеренхимные волокна. Проводящие ткани представлены флоэмой и ксилемой. Флоэма представлена ситовидными элементами и паренхимой. Ксилема расположена сплошным слоем и состоит из крупных сосудов, либриформа и паренхимной ткани с лигнифицированными стенками. Проводящая система непучкового типа. Сердцевина представлена крупными паренхимными клетками (рис. 14, 15).
Морфолого-анатомическое исследование травы манжетки тринадцатилопастной
Результаты фитохимического анализа показали, что трава манжетки тринадцатилопастной содержит значительный комплекс полифенольных соединений, в том числе флавоноиды, которые и обуславливают фармакологический эффект сухого экстракта травы манжетки тринадцатилопастной (см. главу 5), именно поэтому в раздел «Качественные реакции» проекта ФСП «Манжетки тринадцатилопастной трава» предлагаем включить химические реакции на флавоноиды, так как аналитическую пробу травы манжетки измельчают до величины частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями размером 2 мм. Около 1,0 г измельченного сырья помещают в колбу вместимостью 100 мл, прибавляют 30 мл спирта этилового 70% и нагревают на водяной бане в течение 30 минут, фильтруют через бумажный фильтр.
К 1 мл фильтрата добавляют 10-15 мг металлического магния, 5-7 капель кислоты хлористоводородной концентрированной должно наблюдаться оранжево-красное окрашивание (флавоноиды). К 1 мл фильтрата прибавляют 0,5 мл раствора аммиака должно наблюдаться ярко-желтое окрашивание, при нагревании переходящее в оранжевое (флавоноиды).
В раздел «Хроматография» предлагаем включить методику ТСХ обнаружения флавоноидов в траве манжетки тринадцатилопастной. Этот метод отличается точностью, наглядностью, простотой исполнения и аппаратурного оснащения, малой трудоемкостью, быстротой выполнения. Анализу подвергались полученные нами извлечения.
На линию старта хроматографической пластинки «Сорбфил» наносят 10 мкл полученного раствора и 10 мкл раствора СО рутина. Пластинку сушат при комнатной температуре в течение 15 минут, затем помещают в камеру со смесью растворителей этилацетат : муравьиная кислота : вода (10:2:3). Когда фронт растворителей пройдет 10 см от линии старта, пластинку вынимают из камеры, сушат и просматривают в УФ-свете (длина волны 254 нм). На хроматограмме испытуемого раствора должна обнаруживаться ярко флуоресцирующая желто-зеленая зона адсорбции на уровне зоны адсорбции на хроматограмме раствора СО рутина. Затем хроматограмму опрыскивают 2% спиртовым раствором алюминия хлорида. На хроматограмме испытуемого раствора должна обнаруживаться желтая зона адсорбции на уровне зоны адсорбции на хроматограмме раствора СО рутина. На хроматограмме испытуемого раствора кроме основной зоны адсорбции допускается наличие дополнительных зон адсорбции (фенольные соединения).
В разделе «УФ спектр» приводится дифференциальный спектр поглощения испытуемого раствора, приготовленного согласно методике количественного определения с добавлением раствора алюминия хлорида спиртового 2%. Спектр в интервале длин волн от 300 до 450 нм должен иметь максимум при длине волны 410+2 нм.
В раздел «Количественное определение» предлагаем включить методику определение суммы флавоноидов методом дифференциальной спектрофотометрии.
Аналитическую пробу травы манжетки тринадцатилопастной измельчают до величины частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями 2 мм. Около 0,5 г сырья (точная навеска) помещают в термостойкую колбу вместимостью 100 мл, заливают 15 мл спирта этилового 70%, нагревают на водяной бане с обратным холодильником в течение 30 минут. Затем извлечение охлаждают, фильтруют в мерную колбу вместимостью 50 мл. Операцию повторяют дважды порциями спирта этилового 70% по 15 мл. Затем объем в мерной колбе доводят до метки спиртом этиловым 70% (раствор А). 1 мл раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 10 мл спирта этилового 95%, 0,5 мл 33% раствора кислоты уксусной, доводят объем раствора спиртом 95% до метки и перемешивают (раствор Б). 1 мл раствора А помещают в колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 1 мл 2% спиртового раствора алюминия хлорида, 0,5 мл 33% раствора уксусной кислоты и доводят до метки спиртом этиловым 95%. Через 30 минут измеряют оптическую плотность полученного раствора при 410 нм относительно раствора Б.
Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин и абсолютно сухое сырье в процентах (Х) вычисляют по формуле: Ax-mйб-50-100 (?.\ a-Aib-100-W) где: Ах - оптическая плотность испытуемого раствора; Аст - оптическая плотность раствора стандартного образца; піст - масса навески стандартного образца рутина, г; а - масса навески сырья, г; W - потеря в массе при высушивании сырья, %.
Приготовление раствора СО рутина. Около 0,05 г (точная навеска) рутина (ФС 42-2508-96), высушенного при температуре 132-135 С в течение 2-х часов, помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл и растворяют в 70 мл спирта этилового 95%, доводя до метки этим же растворителем (раствор А). Раствор устойчив в течение 30 дней при хранении в темном месте в хорошо укупоренной стеклянной склянке. 1 мл раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 0,5 мл 33% раствора кислоты уксусной и 2 мл 2% раствора алюминия хлорида и доводят объем раствора спиртом этиловым 95% до метки, перемешивают. Через 30 минут измеряют оптическую плотность полученного раствора при 410 нм относительно раствора рутина, приготовленного аналогично, но без добавления алюминия хлорида. Нормирование числовых показателей проводилось в соответствии с требованиями общих фармакопейных статей. Содержание суммы флавоноидов определяли в соответствии с разделом «Количественное определение». Определение проводилось в шести образцах сырья, заготовленных в различное время (2010-2014 гг.) в период цветения в Карачаево-Черкесской Республике. Органические и минеральные примеси. Определение проводили по методике ГФ ХI изд., вып.1, стр. 276. Минеральная примесь манжетки тринадцатилопастной (земля, песок, камешки) не превышала 1,0%. Амбарные вредители в сырье манжетки тринадцатилопастной отсутствовали. Каждый вид примеси взвешивали отдельно с погрешностью ± 0,1 г при массе аналитической пробы более 100 г. Определение измельченности травы манжетки тринадцатилопастной проводили по методике ГФ ХI изд., вып.1, стр. 275. Частиц, не проходящих сквозь сито с отверстием диаметром 7 мм, должно быть не более 15%, проходящих сквозь сито 0,3 мм, не более 13%. Результаты эксперимента представлены в таблице 18. Определение микробиологической чистоты сырья манжетки тринадцатилопастной определяли по методике ГФ ХI изд., вып.2, с.194-195 и Изменение № 2 Категория 4А и 4Б.
Изучение органических кислот методом ВЭЖХ
Ниже приведена методика приготовления контрольного раствора рутина. Приготовление исходного раствора рутина с массовой концентрацией 1 г/л
На аналитических весах в стаканчике взвешивали (0,0570 ± 0,0001) г рутина, добавляли приблизительно 30 мл дистиллированной воды и подщелачивали 0,1 М раствором гидроксида натрия до полного растворения рутина (рН раствора 9,5±0,2). После этого содержимое стакана количественно переносили в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводили объем до метки дистиллированной водой и тщательно перемешивали. Срок хранения данного раствора в холодильнике - 1 месяц при температуре 4 ± 1 С.
Приготовление раствора рутина с массовой концентрацией 100 мг/л В мерную колбу вместимостью 10 мл пипеточным дозатором вводили 1мл исходного раствора рутина, доводили объем до метки дистиллированной водой и тщательно перемешивали. Раствор готовили непосредственно перед градуировкой прибора. Приготовление градуировочных растворов рутина с массовой концентрацией 0,2; 0,5; 1,0; 2,0; 4,0 мг/л В мерные колбы вместимостью 10 мл пипеточным дозатором вводили 20, 50, 100, 200, 400 мкл раствора рутина с массовой концентрацией 100 мг/л, доводили объем до метки бидистиллированной водой и тщательно перемешивали. Градуировочные растворы готовили каждый раз при градуировке, их погрешность не должна превышать ± 2,5 %.
Для определения водорастворимых антиоксидантов в качестве подвижной фазы разработчики прибора предлагают использовать раствор ортофосфорной кислоты с молярной концентрацией 0,0022 моль/л (элюент) [61]. В мерную колбу вместимостью 1 л наливали примерно 700 мл дистиллированной воды и пипеточным дозатором добавляли 150 мкл концентрированной ортофосфорной кислоты, после чего доводили объем до метки дистиллированной водой и тщательно перемешивали.
После ввода анализируемого раствора рутина возникающие на электроде электрические токи преобразуются в цифровой сигнал, который регистрируется процессорным блоком и отображается в виде пиков на мониторе. При снижении тока до фонового значения кран дозатора переводят в положение «ВВОД» и вводят следующую пробу.
Для построения градуировочного графика последовательно регистрируют сигналы растворов рутина в порядке возрастания их концентрации.
С целью исключения случайных результатов и усреднения данных проводили по 5 последовательных измерений каждого из пяти градуировочных растворов рутина. За результат принимали среднее арифметическое значение из 5 измерений (относительное среднеквадратическое отклонение не более 5 %).
По полученным данным строили градуировочный график, который описывается уравнением Y = aХ + b. В координатах: X – массовая концентрация рутина, мг/л; Y – сигнал рутина (площадь пика), нАС. Ниже на рисунке 23 представлен градуировочный график зависимости выходного сигнала от концентрации рутина. Рисунок 23 – Градуировочный график рутина
Исследуемые сухие экстракты предварительно растирали в ступке. Точную массу измельченной пробы (около 0,5 г) помещали в коническую колбу вместимостью 100 мл, добавляли приблизительно 70 мл дистиллированной воды и встряхивали в течение одного. Пробу фильтровали через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 100 мл, промывали фильтр дистиллированной водой и доводили объем фильтрата до метки. В случае необходимости пробу разбавляли дистиллированной водой [49].
Перед выполнением каждого цикла анализируемых проб проводили контроль чистоты аналитической системы. Для этого после выхода прибора на рабочий режим в него в качестве пробы вводили элюент. Если дрейф фонового тока не превышает 5 %, система считается чистой.