Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ РЫЖИКА ОЗИМОГО (CAMELINA SILVESTRIS) Павленко Ксения Сергеевна

ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ РЫЖИКА ОЗИМОГО (CAMELINA SILVESTRIS)
<
ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ РЫЖИКА ОЗИМОГО (CAMELINA SILVESTRIS) ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ РЫЖИКА ОЗИМОГО (CAMELINA SILVESTRIS) ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ РЫЖИКА ОЗИМОГО (CAMELINA SILVESTRIS) ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ РЫЖИКА ОЗИМОГО (CAMELINA SILVESTRIS) ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ РЫЖИКА ОЗИМОГО (CAMELINA SILVESTRIS) ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ РЫЖИКА ОЗИМОГО (CAMELINA SILVESTRIS) ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ РЫЖИКА ОЗИМОГО (CAMELINA SILVESTRIS) ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ РЫЖИКА ОЗИМОГО (CAMELINA SILVESTRIS) ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ РЫЖИКА ОЗИМОГО (CAMELINA SILVESTRIS) ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ РЫЖИКА ОЗИМОГО (CAMELINA SILVESTRIS) ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ РЫЖИКА ОЗИМОГО (CAMELINA SILVESTRIS) ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ РЫЖИКА ОЗИМОГО (CAMELINA SILVESTRIS)
>

Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Павленко Ксения Сергеевна. ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ РЫЖИКА ОЗИМОГО (CAMELINA SILVESTRIS): диссертация ... кандидата фармацевтических наук: 14.04.02 / Павленко Ксения Сергеевна;[Место защиты: Самарский государственный медицинский университет].- Самара, 2014.- 145 с.

Содержание к диссертации

Введение

ГЛАВА 1. Современное состояние исследований рыжика озимого как перспективного источника получения лекарственных средств (обзор литературы) . 13

1.1. Историческая справка . 13

1.2. Ботанико-фармакогностическая характеристика рыжика озимого 14

1.3. Заготовка и переработка семян рыжика озимого 16

1.4. Народно-хозяйственное значение рыжика озимого 17

1.5. Сравнительная характеристика компонентного состава и биологической ценности некоторых жирных масел 18 Выводы к главе 1 . 26

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ . 27

ГЛАВА 2. Объекты и методы исследования 27

2.1. Объекты исследования 27

2.2. Методы исследования 28

2.2.1. Методы морфолого-анатомического исследования. 28

2.2.2. Химические методы (качественные реакции) 28

2.2.3. Хроматографические методы 33

2.2.3.1. Тонкослойная хроматография (ТСХ) 33

2.2.3.2. Бумажная хроматография 34

2.2.3.3. Метод колоночной хроматографии 34

2.2.3.4. Газо-жидкостная хроматография 35

2.2.4. Спектральные методы 36

2.2.4.1. Спектрофотометрия 36

2.2.4.2. ЯМР-спектроскопия и масс-спектрометрия . 36

2.2.5. Методы, использованные для получения экстракционных препаратов 36

2.2.6. Фармакологические методы 38

2.2.7. Статистические методы обработки результатов исследования 38

ГЛАВА 3. Морфолого-анатомическое исследование плодов и семян рыжика озимого 40

3.1. Морфология плодов рыжика озимого 40

3.1.1. Морфолого-анатомическое исследование плодоножки 42

3.1.2. Морфолого-анатомическое исследование перикарпия . 46

3.2. Морфолого-анатомическое исследование семени . 53

3.3. Морфолого-анатомическое исследование порошка семян рыжика озимого . 59 Выводы к главе 3 . 61

ГЛАВА 4. Фитохимическое исследование сырья рыжика озимого 62

4.1. Сравнительное ТСХ-исследование надземных органов рыжика озимого . 63

4.2. Выделение и идентификация доминирующих компонентов из надземной части рыжика озимого 64

4.3. Подбор оптимальных условий экстракции . 68

4.4. Исследования по разработке методик качественного анализа семян рыжика озимого 69

4.5. Исследования по разработке методики количественного определения суммы флавоноидов в семенах рыжика озимого . 72

4.6. Изучение динамики накопления флавоноидов в надземной части рыжика озимого . 77

Выводы к главе 4 . 79

ГЛАВА 5. Исследование физико-химических характеристик и жирно-кислотного состава масла семян рыжика озимого 81

5.1. Определение физико-химических констант жирного масла рыжика озимого, культивируемого на территории Самарской области . 81

5.2. Изучение жирно-кислотного состава масла рыжика озимого методом газовой хроматографии 85

Выводы к главе 5 . 89

ГЛАВА 6. Разработка методов стандартизации лекарственных препаратов на основе рыжика озимого 90

6.1. Исследования по стандартизации лекарственного препарата «Рыжика озимого семян настойка» . 90

6.1.1. Обоснование способа получения настойки рыжика 90

6.1.2. Стандартизация настойки рыжика 91

6.1.2.1. Разработка методики качественного анализа . 91

6.1.2.2. Разработка методики количественного определения суммы флавоноидов . 93

6.1.3. Изучение диуретической активности настойки и настоя семян рыжика озимого 95

6.1.4. Исследования по стандартизации жирного масла 99

Выводы к главе 6 . 99

Общие выводы 101

Список литературы 103

Приложения . 117

Введение к работе

Актуальность работы. В настоящее время заслуживают внимания растения, имеющие пищевое и народно-хозяйственное значение. Опыт применения подобных растений в народной медицине дает основание считать перспективным их детальное изучение с целью получения лекарственных препаратов. Широко известны преимущества фитопрепаратов перед синтетическими, поэтому интерес к субстанциям растительного происхождения на сегодняшний день высок (Киселева Т.Л. и др., 2008; Куркин В.А., 2007; Самылина И.А. и др., 2003; 2010). Немаловажными аспектами, влияющими на доступность и экономическую целесообразность получения препаратов на основе растительного сырья, являются масштабность культивирования растений на территории Российской Федерации, а также их устойчивость к различным климатическим условиям. В этом плане, среди растений, вызывающих несомненный интерес, особого внимания заслуживает рыжик озимый (Camelina silvestris L.).

Рыжик озимый – масличное растение, относящееся к семейству Крестоцветные (Brassicaceae). В настоящее время растение культивируется с целью получения жирного масла семян. Благодаря своему уникальному составу этот продукт нашел применение в технике, мыловарении, пищевой промышленности, народной медицине.

Основными зонами возделывания рыжика являются Сибирь, Республика

Мордовия, Оренбургская и Пензенская области. На сегодняшний день рыжик озимый не входит в номенклатуру официнального лекарственного растительного сырья Российской Федерации и зарубежные Фармакопеи.

Недостаточная степень изученности химического состава семян, надземной части, жирного масла рыжика препятствует внедрению в научную медицину, а также получению и применению препаратов на основе лекарственного сырья.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является фармакогностическое изучение рыжика озимого, культивируемого в Самарской области, а также обоснование внедрения в медицинскую практику нового вида лекарственного растительного сырья «Рыжика озимого семена» и жирного масла данного растения.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1) проведение анализа литературных данных современного состояния исследований рыжика озимого;

2) сравнительное анатомо-морфологическое исследование плодов и семян рыжика озимого;

3) сравнительное изучение химического состава плодов, семян, травы рыжика озимого, культивируемого в Самарской области;

4) выделение и идентификация доминирующих компонентов из надземной части рыжика озимого;

5) разработка методик качественного анализа и количественного определения суммы флавоноидов в надземной части рыжика озимого;

6) изучение жирно-кислотного состава масла семян рыжика, культивируемого на территории Самарской области;

7) обоснование технологии получения лекарственного препарата «Рыжика озимого семян настойка» (1:5);

8) разработка методов стандартизации лекарственного препарата «Рыжика озимого семян настойка» (1:5) и масла семян рыжика;

9) оценка диуретической активности настоя и настойки семян рыжика озимого;

10) разработка проектов фармакопейных статей на новый вид лекарственного растительного вида сырья - «Рыжика озимого семена» и «Рыжика семян жирное масло».

Научная новизна. Впервые проведено анатомо-морфологическое исследование плодов и семян рыжика озимого, культивируемого в Самарской области. Установлены диагностические признаки сырья, среди которых наибольшее значение имеют: строение семенной кожуры, а именно: наличие мелких щелевидных тонкостенных клеток со щелевидными полостями, в которых накапливаются крахмальные зерна; локализация слизи в клетках эпидермиса семян; наличие жирного масла в виде капель в семядолях, а также особый характер утолщения оснований ослизняющихся клеток поверхности, представляющий собой окружность.

Впервые проведено фармакогностическое изучение рыжика озимого, культивируемого в Самарской области, в результате чего обоснована целесообразность расширения сырьевой базы для использования в качестве нового вида ЛРС. На основании сравнительного исследования различных органов рыжика установлено наличие флавоноидов в траве, плодах, семенах рыжика, что свидетельствует о целесообразности комплексного использования данного растения.

Впервые с использованием колоночной хроматографии, 1Н-ЯМР-, УФ-спектроскопии, масс-спектрометрии, а также результатов химических превращений из семян рыжика выделены и идентифицированы доминирующие флавоноиды - нарциссин (3-О-рутинозид изорамнетина), изорамнетин, никотифлорин (3-О-рутинозид кемпферола), кемпферол.

Методом газовой хроматографии изучен жирно-кислотный состав масла семян рыжика озимого, культивируемого в Самарской области. Впервые идентифицированы 13 жирных кислот, среди которых доминирующими оказались линоленовая (30,7%), линолевая (20,6%), олеиновая (17,6%) кислоты. Впервые в жирном масле рыжика озимого определены эйкозадиеновая, докозадиеновая и селахоевая кислоты. Разработаны методы стандартизации жирного масла рыжика озимого.

Разработана методика определения кислотного числа жирного масла рыжика озимого (удостоверение на рационализаторское предложение №260 от 11.06.2013 г. «Методика определения кислотного числа жирного масла рыжика озимого»).

Проведены фармакологические исследования настоя и настойки (1:5) семян рыжика озимого. Установлено наличие диуретического эффекта настоя в дозе 50 мг/кг на фоне 3% водной нагрузки за 4 и 24 часа. Проведенные исследования позволяют говорить о перспективе применения препаратов на основе семян рыжика в качестве фитодиуретиков.

Практическая значимость. Полученные результаты позволили расширить представления о морфолого-анатомических признаках, химическом составе и биологической активности надземной части рыжика озимого.

Для установления подлинности сырья рыжика разработана методика качественного анализа семян рыжика методом тонкослойной хроматографии с использованием в качестве растворов сравнения РСО нарциссина, никотифлорина (3-О-рутинозида кемпферола), изорамнетина и кемпферола.

Обоснована целесообразность использования для целей идентификации спектрофотометрия (максимум поглощения при длине волны l max = 256±2 нм, 362 ±2 нм).

Разработана методика количественного определения суммы флавоноидов в семенах рыжика озимого в пересчете на рутин (методом спектрофотометрии с использованием реакции комплексообразования с алюминия хлоридом).

Изучены показатели качества нового вида ЛРС, включая содержание суммы флавоноидов, а также характеристики жирного масла рыжика озимого.

В результате морфолого-анатомического исследования выявлены диагностические признаки для определения подлинности сырья, установлены показатели качества сырья. Материалы аналитических и морфолого-анатомических исследований включены в проекты ФС «Рыжика озимого семена», «Рыжика семян жирное масло», направленные в ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» для включения в Государственную Фармакопею Российской Федерации XII издания.

Разработана технология получения лекарственного препарата «Рыжика озимого семян настойка» (1:5). Изучены его показатели качества, предложены методы их оценки.

Результаты диссертационных исследований используются в учебном процессе на кафедрах фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии, фармацевтической технологии, химии фармацевтического факультета ГБОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет» Минздрава России, ЗАО «Самаралектравы» (п. Антоновка), ГНУ «Самарский НИИ сельского хозяйства РАСХН им. Н.М. Тулайкова (п. Безенчук), ГБУЗ «Центр контроля качества лекарственных средств Самарской области» (г. Самара).

Положения, выдвигаемые на защиту:

1. Результаты морфолого-анатомических исследований плодов и семян рыжика озимого, включая установленные диагностические признаки сырья.

2. Результаты сравнительного изучения химического состава плодов, семян, травы рыжика озимого, культивируемого в Самарской области.

3. Результаты выделения и определения доминирующих компонентов из надземной части рыжика озимого.

4. Результаты разработки методики количественного определения суммы флавоноидов в семенах рыжика озимого.

5. Результаты изучения физико-химических характеристик и жирно-кислотного состава масла семян рыжика, культивируемого на территории Самарской области.

6. Результаты разработки технологии получения лекарственного препарата «Рыжика озимого семян настойка» (1:5), методов его стандартизации.

7. Результаты исследования диуретической активности настоя и настойки рыжика.

8. Результаты исследований и обоснование показателей качества семян с целью стандартизации сырья «Рыжика озимого семена».

9. Результаты исследований и обоснование показателей качества жирного масла с целью стандартизации и разработки проекта ФС «Рыжика семян жирное масло».

Апробация работы. Основные положения диссертации представлены и обсуждены на Всероссийских конференциях с международным участием «Молодые ученые – медицине» «Аспирантские чтения (г. Самара, 2012; 2013); II Международной научно-практической конференции студентов и молодых ученых «Молодежь и наука: Модернизация и инновационное развитие страны» (Пенза, 2012); I Международной интернет-конференции «Современные тенденции в сельском хозяйстве» (Казань, 2012); Международной виртуальной интернет-конференции «Медицина в XXI веке: тенденции и перспективы» (Казань, 2013), V Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы использования природных ресурсов России» (г. Самара, 2013); XVIII Всероссийском конгрессе «Экология и здоровье человека» (Самара, 2013).

Личный вклад автора. Автор принимал участие в выборе направления исследования, постановке целей и задач. Диссертантом проведен информационно-аналитический поиск результатов современных исследований по изучению объектов; выполнены анатомо-морфологические, химические, аналитические, фармакологические исследования. Автором разработаны методики качественного и количественного анализа сырья, методики стандартизации предложенных субстанций. Автором разработаны проекты ФС «Рыжика озимого семена», «Рыжика семян жирное масло». Под руководством научного руководителя осуществлен анализ полученных экспериментальных данных, проведена статистическая обработка результатов, сделаны выводы.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Диссертация соответствует паспорту специальности 14.04.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия (фармацевтические науки). Результаты диссертационной работы соответствуют области исследования специальности, конкретно – пунктам 3 и 6 паспорта специальности.

Связь задач исследования с планами научной работы. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ГБОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (№ Гос. регистрации 01200900568).

Публикации. Основные результаты диссертационных исследований отражены в 18 научных работах, из них 7 - в изданиях, включенных в Перечень журналов, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 116 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы, характеризующей материалы и методы исследования, экспериментальной части (четырех глав), общих выводов, списка литературы и приложений. В тексте содержится 12 таблиц, 44 рисунка. Список цитируемой литературы включает 142 источника, из них 12 – на иностранных языках.

Народно-хозяйственное значение рыжика озимого

В настоящее время рыжик культивируется с целью получения семян, в которых содержится до 46% жирного масла [1, 25]. Масло употребляется в пищу, используется в мыловарении, металлургической промышленности и для изготовления олифы. Имеются литературные данные, свидетельствующие об опыте применения рыжикового масла в народной медицине для лечения гастритов, ожогов, воспалений [41, 64, 66].

Рыжиковое масло широко используется в мыловарении для получения зеленого мыла [103].

Олифа, полученная при варке смеси рыжикового и льняного масел в пропорции 1:1, практически не уступает по качеству олифе, изготовленной из чистого жирного масла льна [84, 95].

Из-за высокого содержания фосфорной кислоты, жмых семян рыжика озимого можно считать хорошим удобрением [17, 103]. К тому же рыжиковый жмых является ценным кормом для животных. Благодаря высокому содержанию жиров, азотистых веществ и своей высокой питательности, он не уступает другим видам жмыха [118]. По современным данным, в 100 кг жмыха рыжика содержится около 120 кормовых единиц и 30 кг переваримого протеина [103]. Содержание же нежелательных глюкозиналатов в семенах низкое, и составляет 0,3 – 0,8% [90].

На пастбищах животных рыжик поедается плохо. Однако имеются данные о том, что в Англии культивировали рыжик в качестве кормового растения для овец [103].

Имеются сведения о том, что стебли рыжика в прежнее время использовали для изготовления веников, крыли ими крышу [17, 103].

Незначительная требовательность рыжика к почве, климату, устойчивость к вредителям делают процесс культивирования растения низкозатратным и выгодным, что весьма актуально в современных рыночных условиях [10]. Именно поэтому в настоящее время рыжик озимый успешно культивируется во многих регионах России и странах СНГ. 1.5. Сравнительная характеристика компонентного состава и биологической ценности некоторых жирных масел

Растительные масла во все времена пользовались у людей большим спросом. Их использовали и как целебное и косметическое средство и как ценный пищевой продукт [60, 76].

Биологическая ценность жирных масел обусловлена, прежде всего, их высокой энергетической ценностью и содержанием в них незаменимых компонентов – полиненасыщенных жирных кислот, которые, подобно некоторым аминокислотам и витаминам, не могут синтезироваться в нашем организме и должны обязательно поступать с пищей [113, 125]. Полиненасыщенные жирные кислоты играют важную роль в процессах жирового обмена.

Жиры используются организмом не только в энергетических, но и в пластических целях [128, 129]. Они являются одним из главных компонентов клеток и межклеточных мембран, регулирующих все жизненные функции организма.

С пищевыми жирами организм получает жирорастворимые витамины А (ретинол), D (кальциферол) и Е (токоферол), причем жиры способствуют более полному усвоению их организмом [42].

Разные семейства растений имеют лидеров по маслосодержанию [98, 112]. Наиболее высоким содержанием масел отличаются следующие растения: горчица, рапс (сем. Крестоцветные, Brassicaceae), соя, арахис (сем. Бобовые, Fabaceae), миндаль, абрикос (сем. Розоцветные, Rosaceae). Достаточно высокое содержание жирного масла наблюдается и у растений других семейств: лен, пальмы кокосовая и масличная, шоколадное дерево).

Интерес к Крестоцветным растениям обусловлен их высокой урожайностью, уникальным жирно-кислотным составом масла современных сортов и возможностью их многопланового использования [21, 27, 72]. Не менее значимы и масличные растения других семейств.

В настоящее время активно ведутся работы по изучению возможностей обогащения рациона питания полноценным белком с высоким содержанием незаменимых аминокислот, растительным маслом с высоким содержанием полиненасыщенных жирных кислот, витаминами и другими биологически активными компонентами [52, 97, 125]. В этой связи, особо актуальным становится поиск новых видов масличных культур, которые могли бы успешно культивироваться на территории Поволжья и компенсировать существующий недостаток масличного сырья [104, 105, 77]. Для представления общей картины свойств и преимуществ некоторых жирных масел, в том числе представителей семейства Крестоцветные, нами проведен сравнительный анализ литературных данных об их химическом составе и перспективе применения в различных областях.

Горчичное масло - полувысыхающее масло, получаемое прессованием из семян горчицы (Brassica juncea sp., сем. Крестоцветные - Brassicaceae) [87]. Масличность семян данного растения составляет до 47%. Цвет масла желтый, иногда с зеленоватым оттенком. Жирное масло имеет специфические, но приятные вкус и запах. Оно содержит сравнительно мало (до 20%) линолевой кислоты [48, 98, 129].

В настоящее время посевы горчицы значительно сократились и занимают лишь около 80 тыс. га. Широкое применение горчичного масла долгое время было ограничено из-за высокого содержания в нем эруковой кислоты (более 5%), нежелательных для пищевых жиров. В настоящее время селекционерам удалось создать горчично-рапсовые гибриды, характеризующиеся низким содержанием эруковой кислоты. Жирное масло семян низкоэруковых сортов горчицы можно использовать в пищевых, медицинских либо технических целях.

Рапс (Brassica napus L., сем. Крестоцветные - Brassicaceae) – растение, культивируемое как масличная культура [82, 89]. По мнению некоторых авторов, низкоэруковое масло рапса по вкусовым и пищевым и иным достоинствам сравнимо с подсолнечным и соевым. Оно используется как пищевое: в составе кухонных жиров и маргарина [107]. Масло рапса также широко применяется в металлургической, лакокрасочной, мыловаренной и текстильной отраслях промышленности [115, 118]. Сурепица (Barbarea vulgaris, сем. Крестоцветные - Brassicaceae) – однолетнее масличное растение [112]. Масло получают из семян сурепицы. Семена сурепицы характеризуются более низким содержанием масла, чем семена рапса [107]. Данное масло относится к категории слабовысыхающих с йодном числом 98-104 [115].

Сурепное масло характеризуется высоким содержанием эруковой кислоты (38—50%). Содержание других жирных кислот (%): олеиновой 15—32; линолевой 15—21; линоленовой 8—10; пальмитиновой 4,0—4,5; эйкозановой до 4,0; стеариновой 2,0; арахиновой до 1,8; лигноцериновой 0,6—1,0; гексадеценовой 0,6; бегеновой 0,5-0,6 [43]. Сурепное масло используют главным образом для технических целей - в мыловарении, производстве смазочных средств, рафинированное - в пищу [112, 107].

Катран абиссинский (Crambe abyssinica Hochst, cем. Крестоцветные -Brassicaceae) – новая масличная культура. В настоящее время масло крамбе используется как пищевое и по своим пищевым качествам сопоставимо с маслом белой горчицы [112]. Рассматриваемое масло легко рафинируется, имеет низкое йодное число (86-97). Масло катрана абиссинского, благодаря высокому содержанию эруковой кислоты (55,6%), может использоваться на технические цели, в частности для получения биодизеля [112].

Методы, использованные для получения экстракционных препаратов

Спектрофотометрическое исследование надземной части рыжика проводили для качественной и количественной оценки содержания его суммы флавоноидов в траве, плодах, семенах, собранных на разных этапах вегетации. Для этой цели использовали метод дифференциальной спектрофотометрии (с использованием комплексообразующих добавок) на спектрофотометре «Specord 40» (Analytik Jena) в кюветах толщиной слоя 10 мм. Раствором сравнения служил 95% спирт этиловый [135, 136, 134, 137, 138]. Кроме того, метод УФ-спектроскопии использовали для идентификации выделенных веществ в совокупности с данными результатов химических превращений, а также ЯМР- и масс-спектров [8, 59, 62, 74, 75, 80, 81, 110, 141].

Спектральные и физико-химические свойства выделенных веществ изучали с использованием следующих методов: 1Н-ЯМР-спектры регистрировали на приборе Bruker AM 300 (300 МГц). Масс-спектры электронного удара регистрировали на приборе масс-спектрометр «Kratos MS-30» при энергии ионизирующих электронов 70 эВ и варьировании температуры ионного источника от 3 до 250 oС [79].

Определение температуры плавления выделенных веществ осуществляли на блоке Кофлера [79].

Лекарственные препараты готовили в соответствии с правилами фармацевтической технологии. Для получения настойки семян рыжика озимого использовали мацерационные баки и перколяторы. В качестве экстрагента – 40% спирт этиловый. Определение концентрации этилового спирта проводили в соответствии с требованиями ГФ XI, вып. 1, стр. 26-29. Показатели качества полученной лекарственной формы проверяли на соответствие нормативной документации (общей фармакопейной статьи «Настойки» - ГФ XI вып. 2, стр. 148 - 149) [38].

Количественное содержание сухого остатка определяли по фармакопейной методике ГФ XI вып. 2, стр. 149. Определение экстрактивных веществ проводили в соответствии с ГФ XI вып. 1, стр. 295. Испытания на микробиологическую чистоту проводили в соответствии с ГФ XI вып. 2, стр. 193 и Изменением №3 к ГФ XI [38].

Срок годности лекарственных субстанций определяли в естественных условиях, в прохладном и защищенном от света месте. Статистическую обработку экспериментальных данных (Р=95%) фитохимических исследований проводили с использованием критерия Стьюдента с вычислением граничных значений доверительного интервала среднего результата и определением ошибки единичного определения (ГФ XI вып. 1, стр. 199) [26, 44, 119]

Метод перколяции

Данный метод использовался для получения образцов настоек (1:5) из семян рыжика озимого и заключался в пропускании через сырье непрерывного потока всего рассчитанного количества экстрагента. В мацерационный бак помещали необходимое количество сырья и заливали двукратным по отношению к массе сырья объемом экстрагента, замачивали 1,5 часа. Набухший материал загружали в перколятор, сверху сырье прижимали перфорированным диском. Непрерывным потоком экстрагента заливали сырье (при открытом кране для вытеснения воздуха). Как только экстрагент начинал вытекать в приемник, кран перколятора закрывали, экстрагент возвращали на сырье и добавляли его до «зеркала», толщина которого составляла 30-40 мм. Мацерационная пауза составляла 24 часа. Затем у перколятора открывали кран, а на сырье с постоянной скоростью непрерывно подавали экстрагент. Перколировали до получения заданного количества настойки [39, 40].

Фармакологические исследования проводились на кафедре фармакологии им. А.А. Лебедева СамГМУ под руководством зав. кафедрой, профессора Дубищева А.В., к.м.н., доцента Зайцевой Е.Н.

Изучение диуретической активности препаратов (настой семян и «Рыжика озимого семян настойка»).

Предварительно за 1 день до эксперимента крысы получали внутрижелудочно водную нагрузку при помощи желудочного зонда в объеме 3% от массы тела [57, 58]. В день эксперимента крысы получали аналогичную водно-спиртовую нагрузку, после чего они помещались на 4 и 24 часа в обменные клетки для сбора мочи [54, 55]. Опытным крысам одновременно с водной нагрузкой вводились исследуемые препараты. Все препараты вводились внутрижелудочно. Водно-спиртовая нагрузка контрольных и опытных животных была идентична [54, 55, 56, 58]. Определялся объем мочи, концентрация натрия и калия регистрировалась методом пламенной фотометрии (ПАЖ-1), креатинина мочи – фотоэлектроколориметрическим методом (КФК-3) [54, 57, 142].

В каждом эксперименте расчитывали показатели диуреза, натрийуреза, калийуреза и креатининуреза за 4 ч и 24 ч. Для более точной оценки результатов все показатели пересчитывались на 100 г массы тела животного [54, 55, 58].

Всего было поставлено 4 серии экспериментов с водным диурезом (40 опытов).

Статистическую обработку экспериментальных данных исследований (Р=95%) проводили с помощью программ StatSoft Statistica 6.0, Microsoft Exel с вычислением граничных значений доверительного интервала среднего результата и определением ошибки единичного определения (ГФ XI, вып. 1, стр. 199) [39, 40, 44, 53]. Отсутствие систематической ошибки разработанных методик подтверждали опытами с добавками РСО рутина [44, 53].

Обработка результатов фармакологических исследований проводилась с использованием стандартных методов вариационной статистики: расчет средней арифметической величины (М) и средней ошибки средней арифметической (m) – при помощи программ Microsoft Excel 2000 (MS Office 2000, USA) «Пакет анализа», Statistica 8.0 по критерию Манна-Уитни [40, 53].

Выделение и идентификация доминирующих компонентов из надземной части рыжика озимого

Измельченные (0,3 мм) семена рыжика озимого (150 г) экстрагировали десятикратным объемом 50% этилового спирта методом перколяции (глава 2). Полученный продукт упаривали на роторном испарителе под вакуумом при температуре 40-60 оС. Сгущенный экстракт выдерживали течение 2 суток, затем высушивали на силикагеле L 40/100 (30 г).

Препаративное разделение экстрактивных веществ осуществляли методом адсорбционной колоночной хроматографии с использованием силикагеля марки L 40/100 мкм (Чехия). В хроматографическую колонку на слой силикагеля, сформированный в хлороформе (высота слоя сорбента – 8 см, диаметр – 6 см), переносили сухой порошок (фильтрат+силикагель). Колонку элюировали хлороформом, затем хлороформом, содержащим в различных концентрациях этиловый спирт (3%, 5%, 7%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 96%). Кристаллизацию и перекристаллизацию веществ осуществляли с использованием различных растворителей: воды, спирта этилового в различных соотношениях.

В результате хроматографического разделения веществ и последующей очистки рехроматографией и (или) перекристаллизацией выделены вещества, характеристики которых приведены в таблице 3.

Таким образом, с использованием колоночной хроматографии, 1Н-ЯМР-, УФ спектроскопии, масс-спектрометрии, а также результатов химических превращений из семян рыжика озимого, культивируемого в Самарской области, впервые выделены и идентифицированы доминирующие флавоноиды – 3-О рутинозид изорамнетина (нарциссин), изорамнетин, 3-О-рутинозид кемпферола (никотифлорин), кемпферол впервые описанные для сырья рыжика озимого [2, 74, 78].

Полнота и скорость экстрагирования действующих веществ из лекарственного растительного сырья зависит от: степени измельчения сырья, концентрации экстрагента, соотношения сырья и экстрагента, времени экстракции [39, 40, 79]. Их необходимо учитывать в процессе экстрагирования.

Степень измельчения сырья.

Результаты исследований влияния размеров частиц измельченных семян рыжика озимого на полноту и скорость экстракции показали, что оптимальным являются размеры частиц 0,5 – 2 мм. Измельчение сырья должно быть полным без остатка. Сырье должно быть отсеяно от пыли.

Соотношение «сырье:экстрагент».

Проведенный сравнительный анализ суммарного содержания веществ флавоноидной природы в экстракционных препаратах показал, что оптимальным является соотношение 1:5.

Выбор концентрации этилового спирта и времени экстракции. Для определения оптимальной концентрации экстрагента были проведены исследования с использованием этилового спирта различной концентрации (30%, 40%, 50%, 70%, 95%) (таблица 3).

В ходе проведения исследования нами получены сопоставимые значения содержания суммы флавоноидов из семян рыжика озимого в водно-спиртовых извлечениях, где экстрагентом являлся 40 и 50% этиловый спирт (таблица 3). Однако в случае использования в качестве экстрагента 40% этилового спирта, фильтрование извлечений затруднено из-за большого содержания полисахаридов. С целью оптимизации методики нами было принято решение использовать в качестве экстрагента 50% этиловый спирт.

На полноту извлечения действующих веществ из растительного сырья влияет время экстракции. Водно-спиртовые извлечения семян рыжика озимого, полученные при различном времени настаивания, анализировались методом спектрофотометрии. На основании проведенных исследований выявлено оптимальное время экстракции – 60 мин, дальнейшее увеличение времени стадии экстракции не приводит к увеличению действующих веществ в извлечении.

Результаты подбора оптимальных условий экстракции сведены в таблицу 3. Таблица 3 - Зависимость полноты извлечений суммы флавоноидов из семян рыжика озимого от условий экстракции Для качественного определения флавоноидов в семенах рыжика озимого предложен метод тонкослойной хроматографии, УФ-спектроскопии.

Изучение УФ-спектров растворов извлечений из семян рыжика озимого дает возможность увидеть, что кривая поглощения практически соответствует характеру поглощения нарциссина (рис. 38). Данный факт позволяет предполагать, что нарциссин является основным компонентом извлечения. Рисунок 36 – УФ спектр раствора водно-спиртового извлечения семян рыжика озимого

Обозначения:1 – водно-спиртовое извлечение; 2 – водно-спиртовое извлечение в присутствии алюминия хлорида (AlCl3) В ходе разработки методики качественного анализа семян рыжика были проведены исследования по подбору оптимальных условий хроматографирования, позволяющих эффективно разделить и идентифицировать доминирующие БАС – нарциссин, изорамнетин, никотифлорин, кемпферол. В результате проведенных опытов с различными хроматографическими системами, содержащими в различных соотношениях хлороформ, этанол, воду, было установлено, что наиболее четкое разделение компонентов удается достичь в системе растворителей хлороформ – спирт этиловый – вода (26:16:3). При просмотре хроматограммы в УФ-свете при длине волны 254 нм обнаруживаются пятна с фиолетовой флуоресценцией на уровне пятен растворов нарциссина (величина Rf около 0,4), изорамнетина, никотифлорина (величина Rf около 0,45) (рис. 37). Хроматограмму проявляли щелочным раствором диазобензолсульфокислоты (ДСК), затем хроматографические пластинки нагревали при температуре 100-105 оС в течение 2-3 мин в сушильном шкафу. В результате обнаруживались пятно желто-оранжевого цвета с величиной Rf около 0,4 – нарциссин (рис. 37).

Изучение жирно-кислотного состава масла рыжика озимого методом газовой хроматографии

Изучение жирно-кислотного состава масла рыжика озимого, культивируемого в Самарской области, осуществляли методом газовой хроматографии на кафедре химии Самарского государственного аэрокосмического университета имени академика С.П. Королева).

Объектом для изучения служило масло семян рыжика озимого, культивируемого на территории Самарской области (ГНУ Самарский НИИ сельского хозяйства РАСХН им Н.М. Тулайкова, п. Безенчук). Изучение жирно-кислотного состава масла проводили методом газо-жидкостной хроматорафии после предварительного перевода жирных кислот в метиловые эфиры по методике ГОСТ Р 51486-99.

Лабораторную пробу жидкого растительного масла тщательно перемешивают, отобранную навеску массой 0,1 г помещают в стеклянную пробирку и растворяют в 1,9 см3 гексана. В гексановый раствор вводят 0,1 см3 раствора метилата натрия в метаноле молярной концентрации 2 моль/дм 3. После интенсивного перемешивания в течение 2 мин реакционную смесь отстаивают 5 мин и центрифугируют в течение 10 мин. Отбирают для анализа верхний прозрачный слой – 1 мкл.

Анализ проводили на газовом хроматографе «Кристалл 5000». В ходе исследования использовали капиллярную кварцевую колонку HP-FFAP длиной 50 м, внутренним диаметром 0,32 мм, толщиной фазы 0,32 мкм. Подготовленную согласно ГОСТ 51486-99 анализируемую пробу в объеме 1 мкл вводили в испаритель газового хроматографа. Газом- носителем являлся азот, скорость потока – 1 мл/мин.

Разделение компонентов масла осуществляли при следующих хроматографических условиях: температура испарителя – 200 0С, температура термостатов колонок – режим программы температур 100 - 220 0С, скорость нагревания 5 0С/мин. Определение жирно-кислотного состава масла осуществляли по времени выхода метиловых эфиров соответствующих жирных кислот. Общее время анализа составляло 2 часа с детектором по ионизации пламени. Полученные в ходе эксперимента значения сравнивали с результатами экспериментальных данных по времени удерживания, полученных при газохроматографическом анализе стандартов веществ, в качестве которых использовали смесь метиловых эфиров высших жирных кислот марки Supelco 37 Comp. FAME Mix 10 mg/ml in CH2Cl2 47885-U (США). С помощью метода газовой хроматографии в масле рыжика озимого идентифицированы 13 кислот (таблица 9). Впервые для семян растения, культивируемого в Самарской области, определены эйкозадиеновая, докозадиеновая и селахоевая кислоты. Исследуемое масло рыжика озимого, культивируемого в Самарской области, соответствует ГОСТ 300623-98 по содержанию пальмитиновой, стеариновой, олеиновой, линолевой, линоленовой, гондоиновой, бегеновой и эруковой кислот. Однако количественное содержание пальмитолеиновой и арахиновой (эйкозановой) кислот в исследуемом образце жирного масла ниже нормируемого показателя. На наш взгляд, полученные данные о жирно-кислотном составе масла рыжика озимого имеют взаимосвязь с местом его культивирования. Выводы к главе 5

1. В ходе исследований определены физико-химические характеристики жирного масла семян рыжика озимого, культивируемого в Самарской области. Перекисное число составляет 8± 0,002 ммоль (1/2О)/кг, показатель йодного числа - 141±0,01г йода/100 г, число омыления - 183±0,05 мг КОН/г. Проведя сравнительный анализ физико-химических характеристик рыжикового масла, культивируемого в Самарской области и промышленного образца «Рыжиковое масло», изготовленное по ТУ У 15.4-32448339-001:2007, нами получены сопоставимые результаты.

2. С помощью метода газовой хроматографии определен жирно-кислотный состав жирного масла семян рыжика озимого, культивируемого в Самарской области. Идентифицированы 13 жирных кислот, среди которых доминирующими оказались линоленовая (30,7%), линолевая (20,6%), олеиновая 17,6%) кислоты. Впервые в жирном масле рыжика озимого определены эйкозадиеновая, докозадиеновая и селахоевая кислоты.

3. Полученные результаты исследований жирно-кислотного состава свидетельствуют о соответствии ГОСТ 30623-98 по содержанию пальмитиновой, стеариновой, олеиновой, линолевой, линоленовой, гондоиновой, бегеновой и эруковой кислот. Содержание пальмитолеиновой и арахиновой кислот ниже нормируемого показателя.

4. Благодаря тому, что рыжик озимый успешно культивируется в Самарской области, а его семена содержат ценные жирные кислоты в уникальном сочетании, считаем целесообразным проведение дальнейших исследований, направленных на изучение фармакологических свойств масла, а также оценку перспективности использования в медицинской промышленности.