Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Современное состояние изученности растений рода серпуха и особенности фармакологического действия 11
1.1 Ботаническая характеристика рода Серпуха
1.2 Краткая характеристика основных БАВ, содержащихся в растениях рода Серпуха
1.3 Характеристика класса экдистероидов 18
Заключение по главе 30
ГЛАВА 2 Объект и методы исследования 32
2.2.1 Методы морфологического и микроскопического исследования 32
2.8 Статистические методы анализа 40
ГЛАВА 3 Морфолого-анатомическое исследование серпухи пятилистной травы 41
3.1 Определение морфологических диагностических признаков серпухи пятилистной 41
3.2 Определение микроскопических диагностических признаков серпухи пятилистной 42
ГЛАВА 4 Интродукционные исследования серпухи пятилистной 49
4.2.2 Изучение ритма сезонного развития серпухи пятилистной 54
4.2.3 Изучение онтогенетического
ГЛАВА 5 Изучение химического состава серпухи пятилистной травы свежей и установление норм качества сырь ... 63
5.8 Технологическая схема комплексной переработки 89
Заключение по главе 93
ГЛАВА 6 Изучение фармакологической активности субстанции 20-Е 94
Изучение нейротропной активности субстанции 20-Е методом «открытое поле» 96
Выводы по главе 98
Общие выводы 99
Список сокращений
- Краткая характеристика основных БАВ, содержащихся в растениях рода Серпуха
- Статистические методы анализа
- Определение микроскопических диагностических признаков серпухи пятилистной
- Изучение ритма сезонного развития серпухи пятилистной
Введение к работе
Актуальность темы исследования. В настоящее время в мире вновь
наблюдается тенденция к росту потребности в лекарственных растительных
средствах, которые наряду с относительной безопасностью и возможностью
длительного применения имеют достаточную эффективность и широту
терапевтического действия, обусловленную поливалентностью биологически
активных веществ (БАВ). В связи с этим представляют интерес растения,
содержащие фитоэкдистероиды, обладающие антиоксидантной, анаболической и
тонизирующей активностью, существенно увеличивают адаптационные
возможности организма и устойчивость к негативному воздействию внешней среды, повышают интеллектуальные способности и физическую выносливость, что послужило основанием для включения данной группы соединений в правительственные программы «Здоровье нации» и «Фарма-2020».
Экономический аспект в получении фитоэкдистероидов, в частности субстанции 20-гидроксиэкдизона (20-Е), является одним из значимых факторов, так как его стоимость на мировом рынке превышает 1000 $ за 1,0 кг, а химическим путем синтезировать экдистероиды на данный момент пока не удается.
На сегодняшний день видами-сверхпродуцентами фитоэкдистероидов являются – левзея сафлоровидная (Raponticum carthamoides (Wilid) Iljin) и серпуха венценосная (Serratula coronata L.). В официальной медицине РФ применяются только два ЛП, получаемых из левзеи сафлоровидной, однако, их производство связано с рядом трудностей при заготовке сырья и низким содержанием экдистероидов, большими потерями при переработке. Все это ведет к удорожанию себестоимости продукции и низкой экономической эффективности.
В последнее время в качестве источников фитоэкдизонов предлагается
использовать растения рода Серпуха, а именно серпуха венценосная (Serratula
coronatа L.), из листьев которой получены и зарегистрированы: субстанция
«Серпистен», капсулированные формы БАД - «Кардистен», «Диастен» и
«Адастен». На Кавказе широко распространена серпуха пятилистная
(с. пятилистная) (Serratula quinquefolia Bied. ex Willd.), имеющая значительную
надземную сырьевую массу и также содержит экдистероиды. Тем не менее, по отношению к ней полных химических исследований до настоящего времени не проводилось. В связи с вышесказанным с. пятилистная представляет несомненный интерес для дальнейших глубоких фармакогностических исследований.
Степень разработанности темы исследования. Исследованиями в области ресурсоведения рода Серпуха занимались Володина С.О., Бек С.А., Ревина Т.А., Чадин В.Ф., интродукции - Тимофеев Н.П., Харина Т.Г., Бек С.А. Фармакологическая активность изучалась Пчеленко Л.Д., Володиной С.О., Ганиевым Ш.Г., Машковским М.Д. и др. Выделением БАВ занимались Rolando A., Kubo I., Lamer-Zarawska E., Wang S., Глызин В.И. и др. Однако в РФ до сих пор отсутствуют нормативные документы, регламентирующие подлинность и доброкачественность серпухи пятилистной травы, сведения о сырьевой базе и возможности разработки ЛП на основе данного растения. Все это определило цель и задачи исследования.
Цели и задачи исследования. Целью настоящего исследования явилось обоснование возможности использования серпухи пятилистной в научной медицине на основании результатов фармакогностических и фармакологических исследований.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
изучить данные литературных источников по виду с. пятилистная;
провести интродукционные исследования с. пятилистной на базе
ботанического сада ПМФИ – филиала ФГБОУ ВО ВолгГМУ МЗ РФ. Определить
фазы и составить фенологические спектры изучаемого растения;
изучить морфолого-анатомическое строение травы и выявить основные диагностические признаки, характерные для с. пятилистной;
провести фитохимическое исследование, выявить содержание основных БАВ и установить числовые показатели качества с. пятилистной травы свежей;
разработать схему комплексной переработки с. пятилистной травы свежей.
на основании проведенных исследований разработать проекты ФСП
«Серпухи пятилистной трава свежая (Serratulaе quinqiefoliaе herba recens)», ФСП «20-гидроксиэкдизон. Субстанция»;
определить острую токсичность и провести скрининг фармакологической активности выделенной субстанции 20-гидроксиэкдизона (20-Е) из травы свежей.
Научная новизна. Впервые определены морфолого-анатомические
диагностические признаки с. пятилистной травы, необходимые для
дифференциации сырья.
Проведены интродукционные исследования с. пятилисной в условиях КМВ. Определенны основные фазы ее развития и составлены фенологические спектры. Установлено, что чем старше растение, тем оно выше и имеет большее количество генеративных побегов, а, следовательно, и значительный сырьевой объем. Так у растений 4-го года жизни урожайность - максимальная и достигает 7,0 кг/м2 сырой и 1,7 кг/м2 сухой массы.
Проведенное фитохимическое исследование позволило установить в изучаемой траве наличие фитоэкдизонов (20-Е, полиподин В, витикостерон Е), эфирного масла, фенольных соединений (-D-арбутин, гидрохинон), аминокислот, макро- и микроэлементов.
Разработаны основные критерии оценки качества и идентификации сырья.
Впервые предложена схема комплексной переработки с. пятилистной травы свежей, позволяющая в качестве целевых продуктов получить 20-Е, полиподин В, витикостерон Е, -D-арбутин, гидрохинон и эфирное масло.
Изучение фармакологического эффекта субстанции 20-Е, выделенной из сока с. пятилистной, подтвердило выраженное актопротекторное, адаптогенное, психоседативное действие, а также её способность повышать физическую выносливость и двигательную активность. Эффект сопоставим с известным адаптогенным средством – левзеи экстрактом жидким.
Разработаны схема комплексной переработки с. пятилистной травы свежей в условиях производства и методы ее стандартизации, а также проект ФСП «Серпухи пятилистной трава свежая (Serratulaе quinqiefoliaе herba recens)» и проект ФСП «20-гидроксиэкдизон. Субстанция».
Теоретическая и практическая значимость работы. Внедрение результатов исследования заключается в обосновании возможности интродукции с. пятилистной в условиях Кавказских Минеральных Вод (КМВ), а рассчитанная урожайность позволяет использовать ее в качестве самостоятельного сырьевого источника. Предложенные методики анализа БАВ в с. пятилистной траве свежей дают возможность идентифицировать растение. Схема комплексной переработки свежей травы позволяет в качестве целевых продуктов получить 20-Е, полиподин В, витикостерон Е, -D-арбутин, гидрохинон и эфирное масло.
По результатам проведенных исследований разработаны и апробированы следующие материалы:
- Проект ФСП «Серпухи пятилистной трава свежая (Serratulaе quinqiefoliaе
herba recens)» (ООО «Краснодарский краевой центр гомеопатии» 2016г.).
- Проект ФСП «20-гидроксиэкдизон. Субстанция» (ЗАО «Вифитех» г.
Москва).
- Акт о внедрении результатов научно-исследовательской работы в учебный
процесс кафедры фармакогнозии ПМФИ – филиала ФГБОУ ВО ВолгГМУ МЗ РФ
(«20» июля 2016г.).
Методология и методы исследования. Методологической основой работы
явилось комплексное фармакогностическое изучение с. пятилистной травы
свежей, включающее морфолого-анатомические, интродукционнные,
фитохимические и фармакологические исследования. Фитохимические
исследования проводились с использованием колоночной, тонкослойной, высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), газожидостной хромато–масс–спектрометрии, атомно-адсорбционной спектроскопии, ЯМР-спектроскопии 1Н и 13С.
Основные положения, выносимые на защиту.
результаты интродукционных исследований с. пятилистной в условиях
КМВ;
результаты морфолого-анатомического изучения с. пятилистной травы;
результаты фитохимического изучения основных групп БАВ;
схема комплексной переработки с. пятилистной травы свежей;
результаты стандартизации интродуцированной с. пятилистной травы
свежей;
результаты фармакологического скрининга.
Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность
полученных результатов подтверждена анализом значительного объема информационной базы, а также применением современных химических, физико-химических, фармакогностических и фармакологических методов анализа, их статистической обработкой, позволяющей получить репрезентативные данные.
Основные положения диссертации доложены на межрегиональной конференции «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (Пятигорск, 2012г.).
По материалам диссертации опубликовано11 работ, в том числе 5 статей – в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Личный вклад автора. Автор участвовал во всех этапах
экспериментальных работ. Им проведен литературный поиск, полный фитохимический анализ с. пятилистной травы с обработкой и интерпретацией полученных данных, установлены морфолого-анатомические диагностические признаки травы, разработана схема комплексной переработки сырья, изучена возможность введения в культуру с. пятилистной, проведен фармакологический скрининг активности выделенной субстанции 20-Е, подготовлены статьи для публикации, оформлены 2 проекта ФСП и диссертационная работа.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 119 страницах текста компьютерного набора и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 4 глав собственных исследований, заключения, списка цитируемой литературы, включающего 188 источников, из которых 50 - на иностранном языке, приложения. Диссертация иллюстрирована 35 рисунками, 23 таблицами.
Краткая характеристика основных БАВ, содержащихся в растениях рода Серпуха
В настоящее время наиболее изучен экдистероидный состав для растений вида Serratula coronata L. (серпуха венценосная) [169]. Сведения об экдистероидах в серпухе пятилистной весьма ограничены. Ранее сообщалось, что экстракцией метанолом из надземной части культивированного растения серпухе пятилистной (S. quinquefolia) была выделена смесь (1:1,19) а- и р-эпимеров арбутина, тогда как экдистероиды в экстракте не были обнаружены [168].
Кроме того, в 2010г. в Институте химии Коми НЦ УрО РАН проф. В.В. Володиным были проведены исследования и установлена закономерность влияния различных условий произрастания вида, в частности эколого-географических, на качественный состав и количественное соотношение экдистероидов в них. Серпуха пятилистная, собранная в районе Кавказских Минеральных Вод, ранее была культивирована в средне-таежной зоне Республики Коми с целью изучения влияния светового режима на состав и содержание экдистероидов (20-Е и 258-инокостерон) [19, 21, 24].
Кроме экдистероидов в растениях рода Serratula обнаружены: фенольные соединения (флавоноиды), дубильные вещества, антоцианы, кумарины, эфирные масла, сесквитерпеновые лактоны, каротиноиды, витамины, аминокислоты, протеин, микроэлементы и др. Данные о БАВ, обнаруженных в растениях рода Serratula, систематизированы и приведены в таблице 2. Таблица 2 - БАВ представителей рода Serratula
Вид Фитоэкдистероиды Фенольные соединения Другие БАВ Проведенныеисследования(источниклит-ры) S. algida Экдистерон Сесквитерпеноиды 2, 76, 87 S. bractifolia Кверцетин Кемпферол - 87 S. centauroides Экдистерон Витикостерон Е - - 2, 76, 87 S. coronata Экдистерон Аюгастерон С 25s-инокостерон Дакрихайнанстерон а-экдизон Полиподин В Таксистерон Макистероны А и С Витикостерон Е Интегристерон А ЛютеолинАпигенинКверцетинРутинАпиинАнтоцианыДубильныевеществаКумарины КаротиноидыТерпеноидыАскорбиновая кислотаАлкалоиды (следы)АминокислотыКаучукВысшие жирные кислоты(пальмитиновая, линоле-новая, линолевая) 1,2, 76, 87, 100, 78, 55, 23, 31, 39, 45, 50, 75, 80, 88, 89, 90, 115, 116, 119, 121, 123, 125, 130, 134, 143, 146, 149, 157, 169, 176 S. erucifolia S.xeranthemoides Экдистерон Интегристерон А Арбутин - 2, 87, 113 S. tinctoria S. inermis Экдистерон Интегристерон А Витикостерон Е Полиподин В АпигенинЛютеолин3-0 -метилкверце -тин Терпеноиды 37, 76, 87,75, 123, 136 S. manshurica Экдистерон - - 44,50, 87, 116 S. procumbens Экдистерон Витикостерон Е - - 2, 76 S. quinquefolia Экдистерон Полиподин В,25S-инокостерон Витикостерон Е Согдистерон Арбутин - 2, 87 S. sogdiana Экдистерон Витикостерон Е Согдистерон Арбутин - 2, 87, 30, 51, 52, 135 S. strangulata Экдистерон Странгузин А и В - Глицерогликолипиды 140, 150, 155 S. wolfii Экдистерон Полиподин В 3-0 -метилкемп-ферол Терпеноиды Полины 166 Таким образом, как показывают данные таблицы 2, у различных видов рода Серпуха были идентифицированы: фитоэкдистероиды, флавоноиды, сесквитерпеноиды, причем максимально изученной является серпуха венценосная (S. coronata) в отличие от других видов.
В результате изучения сухой травы серпухи пятилистной были идентифицированы: 20-гидроксиэкдизон (экдистерон или 20-Е), 258-инокостерон, а также гликозид арбутин и его агликон гидрохинон [22, 26,174].
При изучении экдистероидного состава серпухи пятилистной, интродуцированной в условиях европейского Севера, были идентифицированы 20-Е и инокостерон, являющийся структурным изомером 20-Е и отличающийся от него лишь положением одной гидроксильной группы в боковой цепи [22]. Инокостерон обладает более выраженным антиоксидантним действием по сравнению с 20-Е, что является дополнительным защитным фактором растений против повреждающего действия в экстремальных условиях.
Поскольку комплекс экдистероидов является ведущим среди БАВ рода Serratula, то представляет интерес описание данного класса соединений. Экдистероиды - это группа близких по химическому строению полигидроксилированных стероидов, участвующих в регуляции процессов линьки и метаморфоза членистоногих и являющихся их гормонами [9, 62].
История открытия экдистероидов начинается с 1936г., когда Плаггер Е. и Беккер Е. впервые выделили экстракты из личинок и куколок мясной мухи (Calliphorae rytrocephala), обогащенные гормонами линьки. Затем Бутенандтом А. и Карлсоном П. было выделено 25,0 мг гормона в кристаллическом виде, впоследствии названного а-экдизоном (от греческого «экдизис» - линька), из 500,0 кг сухих куколок тутового шелкопряда [63]. Долгое время вещества данного класса соединений были объединены под термином «экдизоны». Сам термин «экдистероиды» был предложен в 1976г. Карлсоном П., но в настоящее время в научной литературе встречаются оба названия.
В растениях концентрация экдистероидов многократно превышает их содержание в насекомых. Множество насекомых адаптировалось или приспособилось обезвреживать фитоэкдизоны, при этом взамен синтезируя собственные зооэкдистероиды (экдизоны), по метаболическим механизмам, отличным от растений [42]. Первые представители экдистероидов из растений были выделены в 1966г. Наканиси К. из листьев подакарпа Накая (Podocarpus Nakai Hayata) [148]. Биологические испытания активности выделенных соединений установили их сходство с гормонами линьки (МН-активность). В том же году австралийскими химиками Гэлбрайтом и Хорном из подокарпа высокого (Podocar puselatus R.Br.) был выделен экдистерон [148]. В зависимости от источника получения экдистероидов их разделили на фито-, зоо- и микоэкдистероиды.
В Советском Союзе изучение экдистероидов было начато в 70-х годах. В это время Яцюк ЯК. и Сегаль Г.М. выделили экдистерон из серпухи неколючей (Serratula inermis) [134]. Истинными экдистероидами считаются соединения, молекула которых содержит в себе стероидную структуру с обязательным наличием цис-сочлененных А и В колец, 14 а-гидроксильной группы и 7-ен-6-оновой группировки, а активность в тесте на гормон линьки у них является не обязательной (рисунок 2) [179].
Статистические методы анализа
Для качественного обнаружения аминокислот 100,0 г измельчённой свежей травы серпухи пятилистной, предварительно растертой с песком, заливали 80 спиртом этиловым. Экстракцию проводили на водяной бане при 70С в течение 1 часа. Полученное извлечение фильтровывали, промывали 80 спиртом этиловым, упаривали с многократной обработкой хлороформом. Водный слой, в котором предположительно должны содержаться аминокислоты, отделяли и упаривали в вакууме. С водным извлечением проводили нингидриновую пробу.
Идентификацию аминокислотного состава проводили по методике жидкостной колоночной хроматографии с использованием аминокислотного анализатора AAA 339М на колонке ОСТИОН ЛГ АНБ диаметром 8мм и длиной 35мм. С соблюдением следующих условий хроматографирования: весь цикл составил 120 минут, подвижной фазой служил раствор нингидрина с добавлением натрий лимонно-кислотного буфера с рН 2,2, подача элюента осуществлялась со скоростью 15,0 мл/час. Все стандартные образцы аминокислот хроматографировались одновременно [68].
Определение микроэлементного состава проводили методом атомно-адсорбционной спектроскопии, после озоления травы в муфельной печи при температуре 400С в течение 10 часов, на приборе СТЭ-1, в качестве образцов сравнения применялись ГСО горных пород и руд [68]. Изучение предельно допустимых концентраций токсичных элементов проводили в соответствии с установленными нормами ГФ РФ XIII изд. Том. 2 [40].
Фармакологические методы исследования проводили совместно с сотрудниками кафедры фармакологии с курсом клинической фармакотерапии ПМФИ- филиала ФГБОУ ВО ВолгГМУ МЗ РФ (под руководством доц. Кулешовой С.А.).
Экспериментальные исследования по определению «острой» токсичности и изучению биологической активности проводили на беспородных мышах и крысах линии Wistar. Опыты выполняли, исходя из требований и методических рекомендаций Фармкомитета Министерства здравоохранения РФ по работе с животными и в соответствии с правилами доклинической оценки безопасности фармакологических средств [91, 92].
Определение «острой» токсичности проводили на мышах обоего пола массой 20,0-24,0г. Субстанцию 20-Е вводили перорально в нарастающих дозах от 3000,0 мг/кг до 6000,0 мг/кг.
Влияние субстанции 20-Е на физическую выносливость изучали на белых обоеполых беспородных мышах весом 34,0±2,0 г. Методика заключается в тестировании животных на модели актографии, для чего деревянный гладкий стержень, вращающийся со скоростью 10 об/мин и диаметром 2 см, использовался, как актограф [93]. Изучаемую субстанцию 20-Е вводили в дозе 20,0 мг/кг в виде водного раствора в объеме 0,5 мл. В качестве препарата -аналога для сравнительной оценки эффекта использовали левзей экстракт жидкий в дозе 0,66 мл/кг [94]. В таком же объеме вводился физиологический раствор и животным в группе контроля. В каждой группе было по 8 мышей, критерием оценки действия субстанции 20-Е служило время удержания мышей на стержне.
Гиперкапническую гипоксию на обоеполых белых беспородных мышах весом 30,0±2,0 г. вызывали путем помещения животных в герметически закрывающиеся емкости объемом 225,0 мл. Критерием оценки антигипоксической активности в данном тесте было время от момента помещения мышей в закрытую емкость до появления у них судорог. Исследуемые вещества вводили за 30 мин до эксперимента [93].
Оценку нейротропной активности проводили путем определения ориентировочной реакции и исследовательской деятельности в условиях метода «открытое поле» [91, 32]. Все опыты проводили на обоеполых белых крысах (30 особей) линии Wistar массой от 250,0 до 300,0г, которые были выращены и содержались в виварии ПМФИ- филиала ФГБОУ ВО ВолгГМУ МЗ с соблюдением стандартных условий. Тестирование в «открытом поле» проводили в свето- и звукоизолированном помещении с 12 до 14 часов. «Открытое поле» представляет собой круглую арену диаметром 80 см. В центре арены - круг, от которого отходят равные секторы. При испытании животное помещали в центр арены и в течение 3-х минут контролировали его поведение. Влияние субстанции 20-Е на ЦНС изучали по поведенческой активности животных в «открытом поле». Оценивали спонтанную двигательную активность по числу пересеченных квадратов, ориентировочно - исследовательскую активность по числу вставаний на задние лапы и уровень эмоционального реагирования по времени нахождения крыс в центральной зоне, а также по времени груминга и количеству дефекационных болюсов.
Тестирование в «открытом поле» проводили через 30 минут после введения исследуемых объектов. Каждое животное подвергалось тесту только один раз. На время эксперимента животные лишались пищи и воды.
Определение микроскопических диагностических признаков серпухи пятилистной
Цельное свежее сырье представляет собой смесь олиственных стеблей с цветками и плодами различной степени развития и отдельных стеблей, цельных или измельченных листьев, цветков и плодов. Стебли многогранные, прямостоячие, в верхней части ветвистые, голые, полностью олиственные, высотой до 160 см. Цвет темно зеленый. Листья крупные очередные бесчерешковые жестковатые. Листовая пластинка с верхней стороны темно-зеленая, с нижней - светло-зеленая.
Листья глубоко непарноперисторассчеченные со сливающимися у основания долями (сегментами) в 2-3 пары продолговатых эллиптических листочков, до 25 см шириной и 25-27 см длиной, по краю крупнозубчатые. Дольки листовых пластинок пильчатозубчатые и шиповидно-рассеченные; нижние черешковые, стеблевые сидячие. Листья скудноволосистые.
Цветки трубчатые, лилово-пурпурные, крупные, многочисленные, собраны в корзинки. Цветочные корзинки в числе нескольких, располагаются на верхушках стеблей и длинных цветоносах, образуя щитковые соцветия.
Наружные цветки - женские, венчик узкий с 3-4-мя надрезами, тычинки -недоразвиты. Листочки обертки яйцевидные длиной 15-25 мм и шириной 10-18 мм, опушенные, бурые или рыжевато-войлочные, с красновато-бурым содержимым, расположены черепитчато в 5-6 рядов. Внутренние листочки обертки более крупные, на вершине окрашенные, наружные - мелкие, зеленые. Цветоложе плоское, густо опушенное длинными волосками. Плод - семянка с хохолком, длиной 4-5 мм, продолговатая, гладкая, тонкобороздчатая; хохолок длиной 8-10 мм. Запах своеобразный слабо уловимый, вкус водного извлечения слегка горьковатый.
Характерным макроскопическим признаком, позволяющим отличить сырье от сопутствующих видов (серпуха венценосная и др.), является строение листовой пластины, а именно: наличие конечной доли листа, длина которой может достигать до 18 см, ширина - 9 см, что почти в 1,5 раза превышает размер боковых долей.
Для определения диагностических признаков травы серпухи пятилистной, в качестве объектов исследования использовали листья, стебли и цветки.
При рассмотрении микропрепаратов листа с поверхности видны слабоволнистые клетки разной формы от изодиаметрических до вытянутых верхнего эпидермиса (рисунок 5А), и сильно извилистые клетки нижнего эпидермиса. Лист гипостоматический - устьица расположены только на нижней стороне листа. Тип устьичного аппарата аномоцитный. Устьица широкоовальные, граничат с 3-5 побочными клетками эпидермы (рисунок 5Б).
На поперечном срезе листовой пластинки в области главной жилки четко видна дифференциация клеток на столбчатый и губчатый мезофилл. Лист имеет дорзовентральное строение, так как под верхней эпидермой расположен палисадный мезофилл. Под верхней эпидермой находятся клетки колленхимы 3-5 слоев (рисунок 6А). Проводящая система представлена 3 проводящими пучками коллатерального типа (рисунок 6Б).
Черешок листа на поперечном сечении имеет седловидную форму с двумя характерными выступами на абаксиальной стороне. Под эпидермой располагается колленхима пластинчатого типа в 2-3 слоя, в участках между хроренхимой. Хлоренхима состоит из живых паренхимных клеток, расположенными отдельными участками. В зоне ребер и выступов количество слоев колленхимы увеличивается до 7-8. Проводящая система пучкового типа. Проводящие пучки открытые коллатеральные в количестве 5 штук, из них 3 дорзальные, 2- более мелких - вентральные (рисунок 8, 9).
На поперечном срезе форма стебеля округлоребристая, количество ребер 6-8. Под эпидермой в несколько слоев расположена колленхима пластинчатого типа. Проводящие пучки коллатерального открытого типа, расположены близко к поверхности стебля равномерно, в один ряд в количестве 20-25 штук и отделены межпучковыми зонами. Крупные проводящие пучки расположены в ребрах, а более мелкие - между ребрами. Перициклическая склеренхима располагается отдельными участками над проводящими пучками. Проводящие пучки имеют хаарктерную паренхимную обкладку, примыкающую к ксилемной части проводящего пучка. Паренхимные клетки имеют среднюю степень лигнификации. Паренхимные клетки сердцевины округлые, тонкостенные. Межклетники не развиты, (рисунок 10). 1 -эпидерма, 2-хлоренхима ;3- колленхима;, 4-перициклическая склеренхима, 5 - коллатеральный проводящий пучок; 6 -лигнифщированная паренхима; 7 - межпучковый камбий; 8-паренхима сердцевины Верхняя часть листочка обертки густо опушена мелкими простыми одноклеточными, головчатыми волосками, собранными в пучок. Также имеются и мешочковидные железки неправильной формы (рисунок 11). Клетки эпидермиса в верхней части листочка обертки мелкие изодиаметрические, в нижней части имеют вытянутую форму На поперечном срезе листочков обертки видны удлиненные клетки эпидермиса с мелкоизвилистыми стенками. Эпидермис основания листочка -голый (рисунок 12).
Изучение ритма сезонного развития серпухи пятилистной
Установлено, что ее проведение в течение 10 дней при 4-7 С существенно повышает как всхожесть (87,6%), так и энергию прорастания семян (82,2%). Кроме того, такие условия способствуют уменьшению числа выпадов и неполноценных проростков. Результаты проведенного исследования показали, что стратифицированные семена начинают прорастать уже на 3-й сутки, а нестратифицированные - на 5-7-е сутки при очень низкой энергии прорастания. Но следует указать, что сама процедура стратификации не оказывает серьезного влияния на темпы развития проростков. Так, их наиболее активное развитие наблюдалось на 15-16-е сутки, и к этому сроку длина семядолей у обоих видов обработки семян серпухи пятилистной в среднем составила 27,3 мм.
Далее нами были изучены необходимые условия увлажнения почвы для наилучшего прорастания семян. Известно, что серпуха пятилистная предпочитает именно увлажненные места (17-36%), а наиболее благоприятный период для создания таких природных условий на КМВ является подзимний посев. Кроме того, при подзимнем посеве происходят физиологические процессы доразвития зародыша. Было установлено, что при таком виде посева всхожесть семян достигала 89%, а при весеннем высеве - она была невысока и в среднем составила 44%. Однако на застойных участках с большим количеством воды пребывание семян в почве более 10 дней привело к их гибели.
Оптимальный запас всхожести семян в пересчете на 1м2 составил 6,0 г. Максимальная естественная плотность отмечена к 4-му году жизни и в среднем составила 17-19 экземпляров на 1 м .
Далее установлено, что сеянцы подзимнего посева (23.10.06г.) по биометрическим показателям превосходят сеянцы весеннего посева (16.05.07г.), а именно: имеют более развитую корневую систему, в 2-3 раза большую массу и количество корешков, развитую надземную массу, большее количество листьев в розетке и почек возобновления в конце вегетации. При весеннем посеве растения отстают в развитии, изреживаются и чаще зарастают сорняками.
Изучение влияния температуры на активную жизнедеятельность семян серпухи пятилистной показало, что оптимальный диапазон находился в пределах 7-10 С
Таким образом, полученные данные позволяют сделать заключение о том, что на повышение всхожести семян и энергию их прорастания, в основном, влияют три фактора: либо сухое хранение при комнатной температуре в течение 1 года; либо нарушение физиологического покоя (стратификация) при низкой температуре (4-70С) в течение 10 суток, преимуществом которого является значительное снижение неполноценных экземпляров, а также увлажненность почвы с подзимним высевом семян серпухи пятилистной. Вегетативное размножение В качестве альтернативы семенному размножению нами были изучены возможности вегетативного размножения, которое проводили в двух вариантах: 1. Особи живых дикорастущих растений серпухи пятилистной были высажены на открытой делянке ботанического сада квадратно-гнездовым способом 25x25 см в подзимней период. Такой вид высадки показал, что растения хорошо укоренялись и приживались. 2. Вегетативное размножение путем деления на отдельные партикулы. Для этого были заготовлены 8 кустов предположительно 4-х летнего возраста путем корчевки в осенний период. Отделенные партикулы были высажены в лунки глубиной 15-18 см на растоянии 25x25 см в подзимний период. Полив и рыхление почвы осуществляли весной, когда и появились первые всходы. Такой вид размножения также показал хорошее укоренение растений. Почти все из них зацвели и дали семена уже в первый год вегетации. Наиболее интенсивный рост побегов наблюдался в фазы бутонизации и цветения, к концу цветения рост побегов заканчивался. При постоянных агротехнических мероприятиях, включающих полив и рыхление почвы, длина периода вегетации увеличивалась до 220 дней. Таким образом, установлено, что для интродукции серпухи пятилистной возможно использование двух способов размножения, но наиболее предпочтительным является семенной.
Изучение ритма сезонного развития серпухи пятилистной Ритм сезонного развития является ярким признаком способности к адаптации растения к окружающим климатическим и экологическим условиям среды и представлен фенофазами: вегетации, цветения (от начала до конца), плодоношения, созревания семян и окончания вегетации.
При оптимальных природно-климатических условиях рост, развитие и длительность онтогенеза многолетних видов рода «Серпуха» с высокой продуктивностью может составлять до 11 лет. Причем с возрастом происходит увеличение надземной биомассы, которая достигает максимума к 4-му году жизни и составляет в среднем 310,0 г.
Наблюдения показали, что серпуху пятилистную можно отнести к морозоустойчивым растениям, поскольку выпадов в результате перезимовки не наблюдалось, а устойчивость к заморозкам составила 100%.
Примерно к середине сентября у растения наступает период массового плодоношения. В целом промежуток времени между вегетацией и массовым плодоношеним занимает 100 - 130 дней. Но на фенологические сроки развития существенное влияние оказывали климатические условия, так при дождливом лете семена завязывались медленно, и период вегетации удлинялся, а при сухом и жарком лете - семена завязывались быстрее.