Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1. Краткая систематическая и ботаническая характеристика видов рода Stellaria L. (звездчатка) yi
1.2. Химический состав представителей рода звездчатка 14
1.3. Биологическая активность видов рода Stellaria (звездчатка) и их применение в медицине 22
1.4. Биологическая активность С-гликозидов флавоноидов 30
1.5. Морфологическая характеристика и географическое распространение видов рода звездчатка - объектов исследования 35
1.5.1. Морфологическая характеристика и географическое распространение звездчатки средней Stellaria media (L.) Vill 36
1.5.2. Морфологическая характеристика и географическое распространение звездчатки вильчатой Stellaria dichotoma L 37
1.5.3. Морфологическая характеристика и географическое распространение звездчатки дубравной Stellaria nemorum L 3 8
1.5.4. Морфологическая характеристика и географическое распространение звездчатки ланцетовидной Stellaria holostea L 3 8
Глава 2. Объекты и методы исследования 40
2.1. Объекты исследования 40
2.2. Методы исследования надземной части видов рода Stellaria 42
2.2.1. Методы общего фитохимического анализа растительного сырья 42
2.2.2. Методы изучения качественного и количественного состава фенольных соединений 43
2.2.3. Методы выделения и установления структуры флавоноидов из растительного сырья 45
2.2.4 Методы изучения углеводного и аминокислотного состава 46
2.2.5. Качественный состав и количественное содержание элементов 47
2.2.6. Морфолого-анатомическое исследование 47
2.3. Метод определения антиоксидантного эффекта 48
2.4. Оценка острой токсичности 49
2.5. Метод микробиологического анализа 49
Глава 3. Общий фитохимическии анализ и изучение фенольных соединений надземной части видов рода stellaria
3.1. Общий фитохимический анализ 51
3.2 Анализ извлечений методом ВЭЖХ и ВЭЖХ-МС 54
3.3. Выделение основных флавоноидов из надземной части звездчатки дубравной и ланцетовидной 57
3.4. Идентификация флавоноидов 62
3.5. Идентификация и количественное определение фенольных соединений методом ВЭЖХ-МС/МС g4
Глава 4. Изучение веществ первичного обмена и элементный анализ надземной части видов рода stellaria
4.1. Изучение углеводного состава 94
4.2. Изучение состава свободных аминокислот 101
4.3. Изучение элементного состава 108
Глава 5. Макро- и микроскопический анализ надземной части видов рода stellaria 114
5.1. Сравнительный макроскопический анализ 114
5.2. Сравнительный микроскопический анализ 117
Глава 6. Исследование острой токсичности, антиоксидантного и антибактериального эффекта видов рода stellaria
6.1. Исследование острой токсичности сухих экстрактов 121
6.2. Исследование антиоксидантного эффекта сухих экстрактов и 121 флавоноидов 6.3. Исследование антибактериальной активности сухих экстрактов 127
Глава 7. Разработка методики количественного определения суммы флавоноидов в надземной
Части видов рода stellaria
Заключение 140
Список сокращений и условных обозначений 143
Список литературы
- Морфологическая характеристика и географическое распространение видов рода звездчатка - объектов исследования
- Методы общего фитохимического анализа растительного сырья
- Выделение основных флавоноидов из надземной части звездчатки дубравной и ланцетовидной
- Сравнительный микроскопический анализ
Морфологическая характеристика и географическое распространение видов рода звездчатка - объектов исследования
Род звездчатка (Stellaria) (название происходит от лат. Stella - «звезда», по форме цветков) объединяет более 100 видов, распространённых, в основном, в холодных и умеренно тёплых странах обоих полушарий, а также в горных районах субтропиков и тропиков; из них 61 вид произрастает на территории России и сопредельных государств, а в составе флоры Северо-Запада России встречаются 12 видов. Такие представители рода как звездчатка средняя (S. media (L.) Vill.) и звездчатка злаковидная (S. graminea L.), распространены почти по всему земному шару [72, 74, 122].
Согласно данным Шишкина В. К. во «Флоре СССР» [68] род звездчатка принадлежит подсемейству Alsinoideae (мокричные) семейства гвоздичные (Caryophyllaceae). Данное подсемейство характеризуется несросшейся (или почти свободной) чашечкой и отсутствием ноготка (сросшиеся в трубку лепестки), как у представителей подсемейства Silenoideae (смолевковые), а также отсутствием прилистников в отличие от видов подсемейства Paronychioideae (паронихиевые). Род Stellaria разделен на 5 секций, самая большая из которых Eustellaria Fenzl также подразделена на 11 рядов, отличающиеся между собой по форме, размеру, жилкованию листьев, а также по некоторым морфологическим признакам цветков и семян. Характерными морфологическими признаками секции Eustellaria является наличие четырех- или пятираздельной чашечки, хорошо развитых лепестков, 10 тычинок (реже от 3 до 8), 3 столбиков (реже 2), а также плода -многосемянной коробочки. К данной секции относятся четыре вида рода Stellaria - объекты диссертационного исследования. При этом S. media (L.) Vill. (звездчатка средняя) и S. nemorum L. (звездчатка дубравная) принадлежат ряду Petiolares Fenzl, для видов которого характерно присутствие хорошо развитого черешка яйцевидной или эллиптической формы у всех или, по крайней мере, у нижних листьев. Другой изучаемый вид S. dichotoma L. (звездчатка вильчатая) принадлежит ряду Dichotomae Roshev., отличительным признаком которого являются дихотомически ветвящиеся, ломкие в узлах стебли и двураздельные лепестки. S. holostea L. (звездчатка ланцетовидная) принадлежит ряду Holosteae Fenzl, для которого характерно наличие сросшихся попарно при основании ланцетовидных листьев [12, 68].
Представители рода Stellaria обычно многолетние, реже однолетние или двулетние травянистые растения. Стебли, как правило, четырехгранные, голые, реже опушенные, с сидячими или почти сидячими супротивными листьями от линейно-ланцетной до яйцевидной, или овальной формы. Цветки обоеполые, актиноморфные, собранные в рыхлые дихазиальные соцветия, или одиночные, расположенные в пазухах листьев. Прицветники перепончатые или травянистые (листовидные). Чашечка обычно неопушена и состоит из 4-5 ланцетных или ланцетно-яйцевидных чашелистиков, сохраняющихся при плодах. Одним из отличительных признаков рода звездчатка является наличие 5 (редко 4) белых лепестков, которые обычно разделены до середины или почти до основания, иногда надрезаны, на 2 доли, хотя и у некоторых видов лепестки практически редуцированы или отсутствуют. Андроцей представлен 3-10 свободными тычинками. Гинецей состоит из 3, редко 2 плодолистиков, сросшихся при основании в верхнюю одногнездную завязь, с многочисленными семязачатками; столбиков 3, реже 2. Плод ценокарпный - многосемянная цилиндрическая коробочка, раскрывающаяся 6, реже 4 зубцами или створками. Семена почти округлые, коричневые, мелко тупо- или остро бугорчатые [46, 67, 68].
В более поздних работах отечественных ученых проведен пересмотр систематики рода Stellaria. Цвелев Н.Н. считает целесообразным выделение из рода Stellaria L. (звездчатка) самостоятельных родов Alsine L. (мокрица) и Hylebia (Koch) Fourr. (мокричник). Так в изданной в 2004 году "Флоре Восточной Европы" под редакцией Н.Н. Цвелева [66] вид S. media (L.) Vill. (звездчатка средняя) отнесен уже к роду Alsine - Alsine media L. (мокрица обыкновенная, мокрица средняя), a S. nemorum L. (звездчатка дубравная) и S. bungeana Fenzl (звездчатка Бунге) отнесены к роду Hylebia - Hylebia nemorum (L.) Fourr. (мокричник лесной) и Hylebia bungeana (Fenzl) Tzvel. (мокричник Бунге), соответственно. Указанные представители отличаются от видов рода Stellaria L. (звездчатка) тем, что имеют почти цилиндрические, а не четырехгранные стебли, широкие нижние листья и развитое опущение, а между собой Alsine и Hybelia различаются жизненной формой, экологическими особенностями произрастания и хромосомным числом у видов. В данной классификации восточноевропейские виды рода Stellaria подразделены на 2 секции - Stellaria, включающая только один вид S. holostea L. (тип рода) с до половины двураздельными лепестками и волосистыми цветоножками и Larbrea (St.-Hil.) Bluff et Fingerh. с почти до основания двураздельными лепестками и голыми, редко волосистыми в верхней части цветоножками. [66, 71, 72].
В диссертационной работе исследуемые виды рассматриваются в соответствии с систематикой представителей рода Stellaria L., приведенной во Флоре СССР [68, 74].
Анализ отечественной и зарубежной литературы показал, что наиболее изученными видами рода Stellaria являются S. media (L.) Vill. звездчатка средняя и S. dichotoma L. звездчатка вильчатая. Особый интерес исследователей к этим растениям обоснован их широким применением в народной, а также традиционной медицине Востока.
Довольно подробно изучен химический состав образцов звездчатки средней, собранной на территории Восточной Европы, Китая и Восточной Сибири. В данном виде были обнаружены различные группы биологически активных веществ, основными из которых являются фенольные соединения (флавоноиды, фенолокислоты), сапонины тритерпеновой природы и полисахариды.
Методы общего фитохимического анализа растительного сырья
Данные исследования проводились на базе Института фармацевтической биологии и биотехнологии (Германия). В качестве элюентов при выделении основных флавоноидов из исследуемого сырья использовали растворители различной полярности и их смеси в разных соотношениях: гексан, этилацетат, хлористый метилен, спирт метиловый, вода. Эффективное разделение и очистка веществ достигались чередованием сорбентов, систем растворителей и типов хроматографии. Окончательная очистка соединений проводилась методом обращенно-фазовой полупрепаративной ВЭЖХ с использованием градиентного режима элюирования на приборе «Lachrom-Merck Hitachi HPLC system» (насос L7100 с УФ детектором L7400) с помощью колонки Eurospher 100-10 С18 (300 mm х 8 mm) (Knauer, Germany) Программа градиента подачи растворителей подбиралась с учетом соотношения растворителей подвижной фазы, при которых наблюдается элюирование соответствующих пиков на хроматограммах при проведении аналитической ВЭЖХ [14, 40, 45, 155].
Для выделения индивидуальных соединений из растительного сырья получали суммарные 90 % метанольные экстракты и проводили дальнейшую очистку индивидуальных компонентов при использовании следующих методов [88, 92, 128]:
Для установления молекулярной массы индивидуальных флавоноидов использовали масс-спектрометр высокого разрешения «UHR-QTOF maXis 4G» (Bruker Daltonics, Bremen) или масс-спектрометр низкого разрешения «Finnigan LCQ Deca» (Thermo Finnigan). Дальнейшее установление структуры соединений индивидуальных флавоноидов проводили методом ЯМР спектроскопии. Н, Си двумерные ЯМР-спектры записывались на спектрометре Bruker Avance III 600. Для подтверждения природы углеводов в составе гликозидной части флавоноидов проводили кислотный гидролиз и последующую идентификацию Сахаров методом ТСХ в сравнении со стандартными образцами. Удельное вращение флавоноидов определяли на поляриметре марки «JASCO Р-2000» [33, 45, 98, 139, 142].
Свободные углеводы, а также моносахаридный состав выделенных полисахаридных фракций после их гидролиза изучали методами БХ и газо-жидкостной хроматографии (ГЖХ) с использованием стандартных образцов -моносахаридов. Их обнаруживали после обработки хроматограмм раствором анилиния гидрофталата с последующим выдерживанием в термостате при температуре 100-105 С в течение 10 мин. Моносахариды обнаруживались в виде пятен вишнево-красной, красно-коричневой и желто-коричневой окраски [65, 70]. Качественное определение свободных углеводов, а также моносахаридного состава водорастворимых полисахаридов и пектиноподобных веществ, проводили на хроматографе «Кристалл-2000М» (Россия) с пламенно-ионизационным детектором на капиллярной колонке HP-5. Для моносахаридов предварительно проводили дериватизацию с образованием триметилсилильных производных (ТМС-производных) по методу, предложенному НЛП «Экотехника» (Санкт-Петербург) [61]. Состав свободных аминокислот был изучен методом обращенно-фазовой ВЭЖХ после дериватизации фенилизотиоцианатом на жидкостном хроматографе производства фирмы Shimadzu, Япония, «LC-20AD Prominence» со спектрофотометрическим детектором SPD-20A и колонкой Discovery LC-18, 4,6 х 250 мм, диаметр гранул 5 мкм (производство фирмы Supelco). Длина волны детектора: 254 нм (278 нм для определения триптофана). Идентификация и оценка содержания производилась в сравнении со стандартными образцами исследуемых соединений [44, 78].
Содержание 23 элементов в надземной части представителей рода Stellaria определяли методом атомно-эмиссионной спектроскопии с индуктивно-связанной плазмой на спектрометре Shimadzu ICPE-9000 при следующих условиях: система ввода - стандартная, кварцевая, с использованием мини-горелки; мощность высокочастотной катушки - 1,2 кВт; режим обзора газа - аксиальный; поток газа плазмы - 10 л/мин, несущего газа - 0,7 л/мин, вспомогательного газа - 0,6 л/мин; время экспозиции - 30 сек. Идентификацию и количественное определение элементов проводили с помощью библиотечных данных программного обеспечения спектрометра [134].
Для проведения макроскопического и микроскопического анализа сырья руководствовались рекомендациями, изложенными в общих фармакопейных статьях ГФ XI издания [34, 35].
При определении внешних признаков рассматривали сырье невооруженным глазом и с помощью лупы (ХЮ), чтобы установить наличие опушения и рассмотреть мелкие части растений. Предварительно сырье размачивали, погружая траву на несколько минут в горячую воду. При определении внешних признаков обращали внимание на строение стеблей, листьев, цветков и плодов. Цвет определяли у сухого сырья при дневном освещении, запах - при растирании, вкус - пробуя кусочек сухого сырья [34].
Для проведения микроскопического анализа сырья руководствовались рекомендациями, изложенными в общих фармакопейных статьях ГФ XI, в монографии «Анатомия растений» К. Эсау и учебном пособии «Фармакогнозия. Атлас» [34,35,56,75]. Изучение и фотографирование микропрепаратов выполняли с помощью микроскопа Микромед 1 (увеличение х40, хЮО, х400) и цифрового фотоаппарата «Sony». Фотографии обрабатывали на компьютере в программе «Adobe Photoshop 7.0».
Выделение основных флавоноидов из надземной части звездчатки дубравной и ланцетовидной
Интерпретация констант спин-спинового взаимодействия и химических сдвигов в Н ЯМР спектре, записанном в двух растворителях - МеОН-й и DMSO-d6 при повышенной темепературе (таблица 9, стр. 71), позволили однозначно определить сахарный остаток дисахарида, связанного С-С связью с агликоном как /?-ксилопиранозу. /?-Аномерная конфигурация этого сахара была определена по высокому значению константы спин-спинового взаимодействия между HI" и Н2" (3./і"д" = 9.2 Hz). В НМВС спектре наблюдаемые корреляции между аномерным протоном Н-1" и С-5" (5С 71.5) были в соответствии с существованием этого моносахарида в пиранозной форме. Кроме того, НМВС корреляции между Н-1" и С-6 (5С 109.1), С-5 (8С 162.8) и С-7 (8С 165.1), подтвердили присоединение /?-ксилопиранозы в положении С-6 апигенина посредством С-гликозидной связи (рисунок 12).
Таким же образом, идентификация терминального сахара основывалась на анализе вицинальных констант спин-спинового взаимодействия и химических сдвигов соответствующих протонов в Н ЯМР спектре (рисунок 6). Большое значение константы спин-спинового взаимодействия (в МеОН-й ) между Н-Г" и Н-2 " (Jrд" = 6.7 Hz) сахара, свидетельствовала об их диаксиальном расположении в пространстве, в то время как константы Н-3 " ( J2»\y» = 8.6 Hz; ) указывали на аксиальную и экваториальную ориентацию Н-3 " (5Н 3.42) и Н-4 " (5Н 3.60), соответственно. Эти данные позволили сделать вывод о том, что терминальным моносахаридом является а-арабинопираноза. Это было также подтверждено присутствием интенсивного фрагментарного ионного пика с отношением массы к заряду m/z 402,9 [М+Н-132] в масс-спектре соединения, который указывал на потерю остатка пентозы (рисунок 13). Положение связи между моносахаридами было установлено с помощью НМВС спектра, который показал корреляцию между Н-Г" (5Н 4.35) и С-2" (5С 81.8) (рисунок 8), таким образом, подтверждая присоединение а-арабинопиранозы в положении С-2" /? -ксилопиранозы посредством (1— 2) гликозидной связи. Ветэ007И733 KT:20J63 АЧ HL: 9.55В F: +с ESI Full гге FIDO.DD-1DDD.DD]
В результате кислотного гидролиза флавоноида 1 был получен один моносахарид, который был идентифицирован как арабинопираноза с помощью ТСХ-анализа гидролизата при сравнении со стандартным образцом арабинозы. Кроме того, ВЭЖХ-МС анализ продуктов гидролиза показал присутствие интенсивного пика с отношением массы к заряду m/z 402,9 [М+Н] , соответствующий монопентозиду апигенина. Устойчивость к кислотному гидролизу вышеуказанного соединения также подтверждала тип структуры флавоноида по типу С-гликозидов, что не противоречило данным ЯМР. Таким образом, структура флавоноида 1 была установлена как 6-С-[(а-арабинопиранозил)-(1— 2)-(9-/?-ксилопиранозил] апигенина. При этом данное соединение было идентифицировано как новое природное вещество. Абсолютная конфигурация /?-ксилопиранозы и а-арабинопиранозы предполагается как D и L, соответственно, основываясь на встречаемости в природе и при сравнении со спектральными данными аналогичных структур похожих соединений [96, 156]. Спектральные характеристики этого вещества представлены в таблице 9. Таблица 9 - 1Я, 13С и НМВС ЯМР данные флавоноида 1 (1Я: 600 MHz, 13С: 150 MHz)
Примечания 5Н - химический сдвиг Н; 5С. химический сдвиг С; mult. - мультиплетность;НМВС - дальняя гетероядерная корреляционная спектроскопия; а- спектр снят в DMSO-U ; b - спектр снят в МеОН-й?4; s - синглет;br s - уширенный синглет; d - дуплет;dd - дуплет дуплетов; ddd - дуплет дуплета дуплетов; t - триплет; m - мультиплет При анализе Н ЯМР спектра флавоноида 1 в DMSO-Й (Г=298 К) была обнаружена дупликация сигналов, соответствующих протонам гидроксильных групп 5-ОН и 7-ОН (рисунок 14).
Данный эффект наблюдается из-за феномена ротамеризма, который уже был описан в литературе для С-гликозидов, и, в частности, для 6-С-гликозилфлавонов [130, 138]. В случае флавоноидов вращение вокруг С (sp ) - С (sp ) гликозидной связи затруднено за счет стерического барьера Дополнительные ЯМР эксперименты в DMSO-Й при постепенном повышении температуры (298 К, 308 К, 318 К, 333 К, and 353 К) показали коалесценцию (слияние) дуплицированных сигналов, что доказало факт существования флавоноида 1 в виде смеси ротамерических конформеров в растворе DMSO- i6 (рисунок 15).
Кроме нового природного соединения (флавоноида 1), из надземной части звездчатки дубравной были впервые выделены 4 известных по литературным данным флавоноида (2-5) (рисунок 3), которые идентифицировали как 6-С-[(а арабинопиранозил)-(1 2)-0-/?-глюкопиранозил] апигенина (2), 6-С-/? глюкопиранозид-8-С-а-арабинопиранозид апигенина (шафтозид) (3), 6-С-/? глюкопиранозид-8-С-/?-ксилопиранозид (виценин 3) (4) и 6-С-/? галактопиранозид-8-С-/?-глюкопиранозид апигенина (5) [91, 93, 115, 130].
Ниже приведены сигналы Н спектра, а также время удерживания, ультрафиолетовый спектр и масс-спектр положительных ионов для этих соединений 2-5, записанные при анализе методом ВЭЖХ-МС (рисунки 16-19). 6-С-[(«-арабинопиранозил)-(1 2)-0-/?-глюкопиранозил] апигенина (2)
Сравнительный микроскопический анализ
Для обоснования применения в качестве лекарственных средств того или иного растительного сырья требуются наиболее полные данные о его химическом составе. Литературные данные о составе свободных аминокислот представителей рода Stellaria L. в доступной отечественной и зарубежной литературе отсутствуют. Целью данной работы является изучение качественного и количественного состава свободных аминокислот надземной части звездчатки средней, звездчатки вильчатой, звездчатки дубравной и звездчатки ланцетовидной методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии после дериватизации фенилизотиопианатом.
Как известно, в растениях аминокислоты выполняют ряд важных функций: являются транспортной формой азота, предшественниками фитогормонов, входят в состав ферментов, защищают от неблагоприятных абиотических факторов. Они же являются продуктами первичного метаболизма и в свободном виде встречаются во всех растениях, поэтому часто входят в состав комплексных фитопрепаратов. При этом аминокислоты обладают не только биологической активностью, но в составе сопутствующих веществ способствуют улучшению всасывания, пролонгации терапевтического эффекта и потенцированию действия основных растительных компонентов [38].
В качестве объектов исследования служили образцы надземной части сырья S. media, S. nemorum, S. dichotoma и S. holostea, собранные в мае-июне 2012 г. Растительный материал - высушенные воздушно-теневым способом надземные части перечисленных видов - измельчали до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 2 мм. Аналитическую пробу сырья помещали в круглодонную колбу со шлифом, добавляли экстрагент (70 % спирт этиловый в соотношении 1:10 к массе сырья) и нагревали на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 30 мин. Экстракцию проводили трехкратно. Полученные извлечения, охлажденные до комнатной температуры, фильтровали через бумажный фильтр, объединяли и упаривали на роторно-пленочном испарителе до густой консистенции, а затем сушили в термостате при температуре 50 С до получения сухого остатка. Измельченный до состояния порошка сухой остаток подвергали хроматографическому анализу.
Качественный и количественный состав свободных аминокислот проводился методом ВЭЖХ на жидкостном хроматографе производства фирмы Shimadzu (см. раздел 2.2); детектирование производилось при длине волны 254 нм (278 нм для определения триптофана); подвижная фаза - смесь раствора натрия ацетата 0,06 моль/л, рН = 5,5 (компонент А), раствор спирта изопропилового 1 % в ацетонитриле (компонент В) и раствор натрия ацетата 0,06 моль/л, рН = 4,05 (компонент С). Хроматографический анализ проводили в режиме градиентного элюирования. Скорость потока подвижной фазы - 1,2 мл/мин. Система сбора и обработки данных для жидкостного хроматографа: компьютер с программным обеспечением LC solution.
Использовали стандартные образцы следующих аминокислот (Sigma): аспарагин (асп), глутамин (глу), гидроксипролин (о-про), серии (сер), глицин (гли), гистидин (гис), аргинин (арг), треонин (тре), аланин (ала), пролин (про), тирозин (тир), валин (вал), лизин (лиз), изолейцин (илей), лейцин (лей), фенилаланин (фен), метионин (мет), цистин (цис), цистеин (цис-цис), триптофан (три), а также реактивы: фенилизотиоцианат, ацетонитрил, спирт изопропиловый, натрия ацетат, кислота хлористоводородная, натрия гидроксид.
Для построения калибровочных графиков навески стандартных образцов растворяли в растворе кислоты хлористоводородной 1 моль/л. Аликвоты стандартного раствора 5, 10, и 15 мкл помещали в три пробирки. Для удаления кислоты хлористоводородной аликвоты высушивали досуха на водяной бане при температуре 60 С в токе воздуха. К высушенным аминокислотам добавляли 0,1 мл раствора натрия гидроксида 0,15 моль/л, перемешивали, а затем добавляли 0,35 мл раствора фенилизотиоцианата в спирте изопропиловом и 0,05 мл воды бидистиллированной. Раствор оставляли на 20 мин при комнатной температуре, после чего высушивали досуха при температуре 60 С. Сухой остаток растворяли в 1 мл воды бидистиллированной. Полученные растворы подвергали хроматографическому анализу (рисунок 31).
Для определения суммы цистеина и цистина, стандартные образцы предварительно окисляли кислотой надмуравьиной, затем определяли кислоту цистеиновую в виде фенилтиокарбаматного производного (для получения кислоты надмуравьиной, в пробирке вместимостью 10 мл смепшвали одну часть водорода пероксида и 9 частей кислоты муравьиной, тщательно перемешивали). После этого проводили дериватизацию фенилизотиоцианатом, отфильтровывали и образец вводили в хроматографическую колонку (рисунок 33).
Для анализа аминокислотного состава образцов (общий состав аминокислот) методом ВЭЖХ точную навеску высушенного 70 % спиртового извлечения (-100 мг) из растительного материала растворяли в 5 мл спирта этилового 40 % и выдерживали в ультразвуковой ванне 10 мин. Отбирали аликвоты (0,1-0,2 мл) и помещали их в пробирку. Высушивали досуха на водяной бане при температуре 60 С в токе воздуха. Дальнейшую пробоподготовку проводили аналогично стандартным образцам аминокислот.