Введение к работе
Актуальность темы. Производные 3-трифторметиланилина (флутамид -
2-метил-N-(4-нитро-3-(трифторметил)фенил)пропанамид – и его метаболиты:
4-нитро-3-трифторметиланилин, 2-метил-N-(4-амино-3-(трифторметил)фенил)-
пропанамид и N-(4-ацетамино-3-(трифторметил)фенил)ацетамид – являются
соединениями, обладающими биологической активностью. Флутамид применяется в медицине как противоопухолевое лекарственное средство для лечения рака предстательной железы. Базовыми структурами, на основе которых синтезируются прекурсоры рассматриваемой группы веществ, являются анилин и 4-нитроанилин (базовые структуры).
Соединения рассматриваемой группы токсичны для теплокровных организмов, в том числе и человека. Например, LD50 флутамида для крыс при пероральном введении 787 мг/кг, при внутрибрюшинном – 289 мг/кг. LC50 у крыс, отравленных ингаляционно, превышает 0,25 мг/л. LD50 данного вещества для собак при пероральном введении >2 мг/кг. Несколько меньшие показатели токсичности имеют другие рассматриваемые соединения. Токсичность данной группы веществ чаще всего сопряжена с нарушением функций печени, почек и щитовидной железы.
Известны случаи острого отравления человека производными 3-трифтор-метиланилина, в частности флутамидом. При длительном применении флутамида неоднократно регистрировались тяжёлые случаи поражения печени, что в итоге иногда приводило к летальному исходу. Производные 3-трифторметиланилина как отравляющие агенты представляют потенциальную опасность для человека в процессе контакта с ними на производстве, при ошибочном приёме токсических доз или при возможных попытках самоубийств.
Всё вышеперечисленное служит необходимым основанием для изучения этих соединений в химико-токсикологическом отношении. Повышение объективности доказательства отравлений флутамидом, в том числе летальных, возможно на основе определения в биологических объектах не только исходного отравляющего вещества, но и близких по структуре продуктов его биотрансформации. Учитывая высокую токсичность ряда метаболитов флутамида, возможно их рассмотрение в качестве самостоятельных объектов химико-токсикологического анализа.
Степень разработанности темы исследования. Анализ литературных данных показал, что многие вопросы изолирования флутамида и его метаболитов из тканей органов и биожидкостей, их очистки от эндогенных веществ биологических матриц, обнаружения, идентификации и оценки количественного содержания остаются малоразработанными. В научной литературе нами не обнаружены данные о распределении токсических доз изучаемых веществ в организме теплокровных животных и об их стабильности в гнилостно разлагающемся биоматериале.
Таким образом, проведение исследований в области разработки методик
химико-токсикологического анализа производных 3-трифторметиланилина
(флутамида и его метаболитов) является актуальным.
Цель исследования. Разработка методик изолирования, очистки и определения производных 3-трифторметиланилина (флутамида и его метаболитов) для химико-токсикологического анализа.
Задачи исследования. Задачами данного исследования явились:
– синтезировать и очистить рабочие стандартные образцы 4-нитро-
3-трифторметиланилина, 2-метил-N-(4-амино-3-(трифторметил)фенил)пропанамида и
N-(4-ацетамино-3-(трифторметил)фенил)ацетамида, доказать соответствие
синтезированных веществ ожидаемой химической структуре;
– изучить хроматографическое поведение (методы тонкослойной и колоночной хроматографии) и особенности экстракции производных 3-трифторметиланилина из водных и смешанных сред;
– разработать способы количественной оценки содержания флутамида,
4-нитро-3-трифторметиланилина, 2-метил-N-(4-амино-3-(трифторметил)фенил)-
пропанамида и N-(4-ацетамино-3-(трифторметил)фенил)ацетамида
хроматографическими (ВЭЖХ) и спектрофотометрическими методами;
– определить оптимальные условия изолирования производных 3-трифтор-метиланилина из биологических матриц с применением метода настаивания, предложить варианты экстракционных и хроматографических способов очистки извлечений от эндогенных веществ биоматериала;
– изучить особенности распределения токсических доз исследуемых веществ в организме теплокровных животных;
– определить влияние температуры и времени на стабильность соединений исследуемой группы, контактирующих с гнилостно разлагающимися биологическими тканями.
Научная новизна. Определены основные ионы характерных кластеров
положительно заряженных частиц в масс-спектрах флутамида, 4-нитро-
3-трифторметиланилина, 2-метил-N-(4-амино-3-(трифторметил)фенил)пропанамида и N-(4-ацетамино-3-(трифторметил)фенил)ацетамида после фрагментации их молекул методом электронного удара.
Выявлены и обоснованы оптимальные условия хроматографирования в
различных типах сорбентов и рассчитаны параметры, характеризующие
хроматографическую активность и особенности разделения производных
3-трифторметиланилина при использовании ряда методов плоскостной и колоночной жидкостной хроматографии (ТСХ, макроколоночной хроматографии низкого давления, ВЭЖХ), а также комбинации методов ГЖХ и масс-спектрометрии.
Разработаны и статистически охарактеризованы методики количественной оценки группы рассматриваемых соединений в субстанциях и извлечениях из биологических матриц на основе применения методов нормальнофазовой и обращённофазовой ВЭЖХ, а также электронной спектрофотометрии.
Выявлены основные параметры и условия очистки соединений
рассматриваемой группы от эндогенных веществ биологических матриц с
использованием хроматографических (тонкослойная и макроколоночная
хроматография) и экстракционных (жидкость-жидкостная экстракция) методов.
Обоснована возможность применения ацетона как наиболее универсального
жидкого извлекающего агента для изолирования производных 3-трифтор-
метиланилина из биоматериала методом настаивания. Определены оптимальные
условия и предложены варианты определения флутамида, 4-нитро-
3-трифторметиланилина, 2-метил-N-(4-амино-3-(трифторметил)фенил)пропанамида и N-(4-ацетамино-3-(трифторметил)фенил)ацетамида в твёрдых (органы и ткани) и
жидких (кровь, плазма, моча) биологических матрицах на основе использования ацетона как изолирующего агента и очистки методами жидкость-жидкостной экстракции и хроматографии в тонких слоях и колонках сорбентов.
Выявлены характерные особенности распределения производных 3-трифтор-метиланилина в теплокровных организмах (на примере крыс), отравленных токсическими дозами соединений исследуемой группы.
Установлены сроки, в течение которых соединения рассматриваемой группы сохраняют стабильность в среде гнилостно разлагающихся биологических тканей при трёх различных температурных режимах.
Теоретическая и практическая значимость работы. Установлен рост
хроматографической активности производных 3-трифторметиланилина в тонких
слоях и колонках нормальнофазовых сорбентов с увеличением полярности
подвижных фаз и наличия в молекулах адсорбатов активных центров, способных к
образованию с поверхностью сорбента временных связей, в ряду флутамид < 2-метил-
N-(4-амино-3-(трифторметил)фенил)пропанамид < 4-нитро-3-трифторметиланилин <
N-(4-ацетамино-3-(трифторметил)фенил)ацетамид. Обратная зависимость
наблюдается при хроматографировании в обращённофазовых сорбентах.
Наибольшая степень экстракции рассматриваемых соединений из водных и смешанных сред достигается сложными эфирами алифатических кислот, причём степень экстракции возрастает с увеличением алкильного радикала в спиртовом фрагменте экстрагента. Степень экстракции возрастает при введении в водную фазу электролитов группы галогенидов К и Na. На степень экстракции не оказывает заметного влияния рН гидрофильных фаз. Из-за малой гидрофильности молекул и невыраженности кислотно-основных свойств производных 3-трифторметиланилина наибольшая их степень извлечения из биоматериала достигается гидролипофильными растворителями, в частности, ацетоном, очистку веществ от эндогенных соединений биологических матриц целесообразно проводить экстракцией из гидрофильных водно-органических сред гидрофобными органическими экстрагентами в сочетании с нормальнофазовым или обращённофазовым вариантами колоночной хроматографии.
При моделировании отравлений теплокровных смертельными дозами флутамида отравляющее вещество в организме крыс метаболизируется в основном в печени и тонком кишечнике с образованием продукта восстановления – 2-метил-N-(4-амино-3-(трифторметил)фенил)пропанамида.
Выполненный комплекс экспериментов обеспечил возможность разработки
двух оригинальных вариантов общей схемы исследования производных
3-трифторметиланилина (флутамида и его метаболитов) при доказательстве
отравлений соединениями данной химической группы. Первый вариант
предусматривает изолирование рассматриваемых соединений из органов и биожидкостей ацетоном, очистку в колонке силикагеля L 40/100 мкм, идентификацию и количественное определение методами ТСХ, ИК-, электронной спектрофотометрии, ГХ-МС и ВЭЖХ. Второй вариант предусматривает дополнительную очистку экстракцией из водно-ацетонитрильных растворов.
Формы внедрения и апробации полученных результатов исследований:
методика определения флутамида и его метаболитов методом
нормальнофазовой ВЭЖХ внедрена в работу Экспертно-криминалистического центра УМВД России по Орловской области (акт внедрения № 3 от 10.02.2016); методика
определения производных 3-трифторметиланилина в биологическом материале
методом ТСХ и нормальнофазовой ВЭЖХ внедрена в работу Экспертно-
криминалистического центра УМВД России по Орловской области (акт внедрения
№ 4 от 10.02.2016); методика идентификации 2-метил-N-(4-нитро-
3-(трифторметил)фенил)пропанамида (флутамид) сочетанием методов
хроматографии в тонком слое гидроксилированного сорбента и электронной
спектрофотометрии внедрена в работу ФГБУ «Информационно-методический центр
по экспертизе, учету и анализу обращения средств медицинского применения»
Росздравнадзора (Курский филиал) (акт внедрения № 55 от 05.02.2016); методика
определения 2-метил-N-(4-нитро-3-(трифторметил)фенил)пропанамида (флутамид) в
лекарственных формах методом обращённофазовой ВЭЖХ внедрена в работу ФГБУ
«Информационно-методический центр по экспертизе, учету и анализу обращения
средств медицинского применения» Росздравнадзора (Курский филиал) (акт
внедрения № 54 от 03.02.2016); методика изолирования производных
3-трифторметиланилина из биожидкостей и определения методами ТСХ и
УФ-спектрофотометрии после очистки в колонке нормальнофазового сорбента
внедрена в учебную (практические занятия) и научную работу кафедры
фармацевтической, токсикологической и аналитической химии Курского
государственного медицинского университета (акт внедрения № 6 от 01.02.2016);
методика изолирования производных 3-трифторметиланилина из животного
биологического материала (тканей органов) путём настаивания с ацетоном и
последующей очистки в колонке гидроксилированного сорбента внедрена в учебную
(практические занятия) и научную работу кафедры фармацевтической,
токсикологической и аналитической химии Курского государственного медицинского
университета (акт внедрения № 5 от 01.02.2016); методика идентификации 2-метил-
N-(4-нитро-3-(трифторметил)фенил)пропанамида (флутамид) в лекарственных
формах методами ТСХ и электронной спектрофотометрии внедрена в научную работу
кафедры фармацевтической технологии Курского государственного медицинского
университета (акт внедрения № 4 от 15.02.2016); методика количественного
определения 2-метил-N-(4-нитро-3-(трифторметил)фенил)пропанамида (флутамид) в
лекарственных формах методом электронной спектрофотометрии внедрена в
научную работу кафедры фармацевтической технологии Курского государственного
медицинского университета (акт внедрения № 3 от 16.02.2016); методика
определения флутамида (2-метил-N-(4-нитро-3-(трифторметил)фенил)пропанамида) и
близких по структуре соединений при судебно-химическом исследовании
биологического материала апробирована в ОБУЗ «Бюро судебно-медицинской
экспертизы» Комитета здравоохранения Курской области (акт апробации от
11.02.2016).
Основные положения, выносимые на защиту:
– синтез рабочих стандартных образцов 4-нитро-3-трифторметиланилина,
2-метил-N-(4-амино-3-(трифторметил)фенил)пропанамида и N-(4-ацетамино-
3-(трифторметил)фенил)ацетамида, способы очистки синтезированных субстанций и подтверждение структуры основных веществ;
– результаты поиска оптимальных условий проведения процесса
хроматографирования и параметры, характеризующие хроматографическую
активность рассматриваемых производных 3-трифторметиланилина в
гидроксилированных и привитых неподвижных фазах, сформированных в виде тонких слоёв и колонок;
– способы качественной и количественной оценки содержания флутамида,
4-нитро-3-трифторметиланилина, 2-метил-N-(4-амино-3-(трифторметил)фенил)-
пропанамида и N-(4-ацетамино-3-(трифторметил)фенил)ацетамида в различных объектах с применением методов фoтoмeтpии, хроматографии и комбинации хроматографии с мacc-спектрометрией;
– особенности экстракции производных 3-трифторметиланилина из жидких гидрофильных сред экстрагентами различной природы и параметры их хроматографического поведения в колонках гидроксилироанного и привитого сорбентов при моделировании очистки производных 3-трифторметиланилина от эндогенных веществ биологических матриц;
– оптимальные условия и методики изолирования производных
3-трифторметиланилина из биологических матриц путём настаивания с ацетоном и очистки извлечений от эндогенных веществ биоматериала экстракционными и хроматографическими способами;
– характер локализации производных 3-трифторметиланилина в организме теплокровных животных при отравлениях летальными дозами этих соединений и стабильности соединений исследуемой группы в гнилостно разлагающихся биологических тканях.
Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность
результатов выполненного диссертационного исследования обусловлена достаточным объемом экспериментального материала, адекватностью заключений и выводов по результатам экспериментов, использованием современных принципов и методов исследования, валидацией разработанных методик, перспективных для практического использования, статистической обработкой данных в соответствии с рекомендациями ГФ XI с применением комплекса прикладных программ «Micrisoft Excel 2013».
Ключевые положения настоящей работы апробированы на ІІ Международной научно-практической интернет-конференции «Аналитическая химия в фармации» (Украина, Харьков, 17 марта 2016); 79-й Всероссийской научной конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Молодежная наука и современность», посвящённой 79-летию КГМУ (Курск, 2014); 80-й Всероссийской научной конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Молодежная наука и современность», посвящённой 80-летию КГМУ (Курск, 2015); на VII и VIII Всероссийских научно-практических конференциях с международным участием: «Биомедицинская инженерия и биотехнология» (Курск, 2014, 2015).
Личный вклад автора. Автор принимал непосредственное участие во всех этапах исследования: им составлен общий план и разработана структура исследований, проведён анализ отечественных и зарубежных литературных источников по теме диссертации, выполнены экспериментальные исследования, проведены статистическая обработка и анализ данных, сделаны выводы и заключения. В работах, выполненных в соавторстве, использованы результаты исследования с долей участия автора 80-95%.
Публикации. Материалы диссертации представлены в 17 публикациях, 6 из которых – статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК, 10 – печатные работы в сборниках материалов конференций, 1 – патент.
Объем и структура диссертации. Структура диссертации включает введение, обзор литературы (глава 1), экспериментальные главы (2-6), общие выводы, список литературы и приложение (128 страниц). Диссертационная работа представлена на 196 страницах машинописного текста, включает 17 таблиц и 40 рисунков. Библиографический список состоит из 163 источников, 144 из них – на иностранном языке.
Условные сокращения в автореферате: 4-Н-3-ТФМА – 4-нитро-
3-(трифторметил)анилин, 2-М-N-4-А-3-ТФМФП – 2-метил-N-(4-амино-
3-(трифторметил)фенил)пропанамид, N-4-АА-3-ТФМФАА – N-(4-ацетамино-
3-(трифторметил)фенил)ацетамид, БР – буферный раствор, ВЭЖХ –
высокоэффективная жидкостная хроматография, ГЖХ – газожидкостная
хроматография, ГХ-МС – газовая хроматография с масс-спектрометрическим
детектированием, ДМФА – диметилформамид, ЖЖЭ – жидкость-жидкостная
экстракция, ЖКТ – желудочно-кишечный тракт, ИК – инфракрасный, ОФ –
обращённофазовый, ТСХ – тонкослойная хроматография, УФ – ультрафиолетовый,
ХМС – хромато-масс-спектрометрия, ЯМР – ядерный магнитный резонанс, LD50 –
половинная летальная доза вещества.