Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Изучение z-препаратов в химико токсикологическом отношении 12
1.1. Химико-токсикологическое исследование залеплона 18
1.2. Химико-токсикологическое исследование золпидема . 23
1.3. Химико-токсикологическое исследование зопиклона 33
Заключение по обзору литературы 43
Экспериментальная часть 45
ГЛАВА 2 Исследование залеплона и других z-препаратов методами уф-спектрофотометрии и хроматографии 46
2.1. Идентификация и количественное определение залеплона, золпидема и зопиклона методом УФ-спектрофотометрии 46
2.2. Определение валидационных характеристик при исследовании Z препаратов методом УФ-спектрофотометрии 49
2.3. Применение метода ТСХ-скрининга для идентификации исследуемых веществ 58
2.4. Изучение стабильности анализируемых веществ 64
2.5. Использование метода ВЭЖХ для идентификации залеплона, золпидема и зопиклона 68
ГЛАВА 3 Разработка методики изолирования z-препаратов из водных растворов 76
3.1. Поиск оптимальных условий экстракции залеплона, золпидема и зопиклона из водных растворов 76
3.2. Определение кратности экстракции Z-препаратов из водных растворов 81
ГЛАВА 4 Изолирование, идентификация и определение залеплона и других z-препаратов при исследовании биологических объектов 85
4.1. Методика определения залеплона, золпидема и зопиклона в трупной ткани печени 85
4.2. Применение разработанной методики для определения залеплона, золпидема и зопиклона в трупной ткани желудка, кишечника и крови 103
4.3. Изолирование и определение анализируемых веществ при исследовании мочи 113
4.4. Изолирование и определение исследуемых веществ по модифицированному методу Васильевой А.А 116
ГЛАВА 5 Изучение сохраняемости залеплона и других z-препаратов в ткани печени при разных условиях и сроках хранения 119
5.1. Изучение сохраняемости залеплона и золпидема в ткани печени 119
5.2. Изучение сохраняемости зопиклона в ткани печени 124
ГЛАВА 6 Апробация разработанной методики химико-токсикологического анализа z-препаратов в опытах на экспериментальных животных 130
6.1. Применение разработанной методики для определения залеплона и золпидема в тканях внутренних органов крыс 130
6.2. Применение разработанной методики для определения зопиклона в тканях внутренних органов крыс 136
6.3. Определение залеплона, золпидема и зопиклона в биологических объектах крыс при их совместном присутствии 139
Заключение 142
Список литературы
- Химико-токсикологическое исследование золпидема
- Определение валидационных характеристик при исследовании Z препаратов методом УФ-спектрофотометрии
- Определение кратности экстракции Z-препаратов из водных растворов
- Изолирование и определение анализируемых веществ при исследовании мочи
Химико-токсикологическое исследование золпидема
Залеплон (Zaleplonum) – (N-[3-(цианопиразоло[1,5-] пиримидин-7-ил) фенил] – N-этилацетамид) – является производным пиразолпиримидина. Залеплон – белый или почти белый порошок, практически не растворим в воде, трудно – в этаноле и пропиленгликоле, умерено – в ацетоне, легко – в диметилформамиде, log P (октанол/вода) 1,23 в диапазоне значений рН 1-7 [2,7,8,104,125,137]. Препараты залеплона окрашены в ярко-синий цвет (индигокармин).
Залеплон (торговые названия - Andante, Sonata, Siesta, Plenidon) – ускоряет процесс засыпания, улучшает глубину и продлевает время сна, не вызывает изменений в соотношении различных фаз сна. При приме внутрь быстро и почти полностью всасывается. Сmax прямо пропорциональна дозе препарата и достигается в течение 1 ч, Т1/2 – около 1 ч, абсолютная биодоступность и связывание с белками плазмы составляют приблизительно 30% и 60%. Является липофильным соединением [4,5,8,30].
В первичном метаболизме залеплона участвует фермент альдегид – оксидаза, за счет чего образуется 5-оксозалеплон. CYP3A4 также участвует в метаболизме залеплона с образованием дезэтилзалеплона, который в свою очередь под воздействием фермента альдегидоксидазы превращается в 5-оксо-дезэтил-залеплон. В дальнейшем продукты окисления подвергаются коньюгации с глюкуроновой кислотой. Залеплон в процессе биотрансформации в организме не образует активных метаболитов. Выделяются метаболиты, главным образом с мочой (71%) и калом (17%) [8,30,32,62,81,100]. В нормативной документации описаны способы анализа залеплона в его лекарственных формах. Подлинность залеплона в субстанции устанавливают методом ИК-спектроскопии путм сравнения ИК-спектра препарата со спектром стандартного образца, полученных в дисках с бромидом калия в идентичных условиях. Для количественного определения применн метод УФ спектрофотометрии с использованием для расчта скорректированных значений оптических плотностей спиртовых растворов испытуемой пробы и стандартного образца при 233 нм и 400 нм [53]. В спецификации [39] (Анданте капсулы 5 мг и 10 мг) подлинность и количественное определение залеплона проводят методом ВЭЖХ: сорбент С18, мобильная фаза фосфатный буфер рН 4,5 метанол (9:1 и 1:9), градиентный режим, УФ-детектор, 235 нм. Метод ВЭЖХ разработан для определения залеплона и шести синтезированных примесей [114]: колонка YMC Pac C8, мобильная фаза: фосфатный буфер рН 3,0 (растворитель 1) и ацетонитрил (растворитель 2), градиентный режим, УФ-детектор ( 225 нм), выход залеплона составил в среднем 99,86%, предел обнаружения равен 0,050 мкг/мл, предел определения – 0,101 мкг/мл. Приведены также некоторые валидационные характеристики примесей. Залеплон подвергали воздействию разных агрессивных факторов и определяли степень деградации, которая была наибольшей (13,7%) при действии на залеплон 5 М раствора гидроксида натрия в течение 10 мин.
Метод дифференциальной пульсовой полярографии (DPP) разработан и применн для анализа залеплона в порошке и капсулах [135]. Полярограммы получали при исследовании стандартного раствора залеплона в диапазоне концентраций 110-6 - 310-5 М и содержимого капсул в смеси этанола и буферного раствора Робинсона-Бриттона рН 4,5 (30:70). Выход залеплона при исследовании препарата составил 99,97%, пределы обнаружения и определения залеплона соответственно были равны 5,1310-7 и 1,1110-6 М. Разработанный метод сравнивали с УФ-спектрофотометрическим и методом ВЭЖХ: показано, что по точности, воспроизводимости и селективности методы оказались адекватными, а по экспрессности предлагаемый метод имеет преимущества и является менее дорогим по сравнению с методом ВЭЖХ.
Для определения залеплона в таблетках авторы [70] применили метод ВЭЖХ: хроматограф – HPLC (Shimadzu system), колонка – Symmetry C8, мобильная фаза – смесь 0,02М раствора дигидрофосфата калия, ацетонитрила и метанола (60:25:15), детектор – УФ при 240 нм, линейность – 0,01-2,00 мг/л, пределы обнаружения и определения – 0,01 и 0,03 мг/л, выход – 95%.
С целью изучения фармакокинетики залеплона предложен метод определения его в плазме крови с помощью системы ВЭЖХ с флюоресцентным детектированием [57]: установлена минимально определяемая концентрация залеплона, равная 0,2 нг/мл, выход – 87-92%. Залеплон, также как и другие Z-препараты, обладает побочными эффектами и токсичностью, однако проявляются они несколько в меньшей степени по сравнению с другими препаратами этой группы. Описаны случаи смертельных и не смертельных отравлений залеплоном.
Simonson K.W. et al. [45] разработали метод ультраэффективной жидкостной хроматографии тандемной масс-спектроскопии (система Waters AQUITY UPLC) для скрининга и определения залеплона, зопиклона и 23-х производных бензодиазепина в цельной крови живых лиц и трупов: минимально определяемые концентрации веществ были равны 0,002-0,005 мг/кг, выход лежал в пределах 73-108%.
Авторами [138] приведены два случая интоксикации залеплоном (суицид). Оба потерпевших были доставлены в больницу в коматозном состоянии и после проведения интенсивной терапии пациенты остались живы. Отмечено, что промывные воды желудка и моча были окрашены в сине-зелный цвет (индигокармин).
Определение валидационных характеристик при исследовании Z препаратов методом УФ-спектрофотометрии
Для идентификации Z-препаратов методом ТСХ, нами применен вариант ТСХ-скрининга, предложенный Карташовым В.А. с соавт. [20]. Сущность метода при исследовании токсических веществ основного характера заключается в следующем.
На пластины Силуфол или Сорбфил наносят исследуемые пробы в виде точек, а по краям пластины – смесь растворов стандартных веществ в форме оснований, в качестве которых используют кодеин (К), дикаин (Д), новокаин (Н), амидопирин (А) и сибазон (С). Хроматографирование проводят до продвижения фронта растворителя на 9 или 14 см при использовании соответственно пластин 10х10 см или 10х15 см в стандартных камерах ненасыщенных парами ацетона.
В некоторых случаях разделение веществ более эффективно происходит в камерах без насыщения. Так, в работе Карташова В.А. и Черновой Л.В. [19,38], показано, что при использовании в качестве растворителя ацетона и пластин с силикагелем исследуемые вещества разделялись значительно эффективней без насыщения камер по сравнению с хроматографированием в камерах, насыщенных парами ацетона. При этом, чем более длительнее проходило предварительное насыщение камеры парами растворителя, тем хуже получались результаты (пятна анализируемых веществ были размытыми и имели низкие значения Rf). Полученные результаты авторы теоретически обосновали и подтвердили экспериментально. Таким образом, при использовании ацетона в качестве растворителя и пластин с силикагелем, авторы рекомендуют проводить хроматографирование в камерах, ненасыщенных парами растворителя.
После окончания хроматографирования и удаления растворителя хроматограмму рассматривают в УФ-свете ( = 365 нм и 254 нм), отмечают пятна флюоресценции и обрабатывают реактивом Драгендорфа. Затем центры желто оранжевых пятен стандартных веществ, нанесенные в две разные точки стартовой линии и разделившихся в условиях эксперимента, осторожно с помощью препаровальной иглы соединяют линиями, пересекающими направление движения фронта растворителя. Таким образом, на хроматограмме получают шесть зон, расположенных между двумя соседними линиями: стартовой линией, линиями миграции стандартных веществ и линией фронта растворителя (рисунок 11). Далее, определяют, в какую зону (хроматографическую группу) попадает анализируемое вещество, которое проявляется в виде пятна желто оранжевого цвета (в случае положительного результата). Если пятно оказалось между линией старта и линией миграции кодеина, вещество относится к первой хроматографической группе, если между линиями миграции кодеина и дикаина – ко второй группе, и так далее. Токсические вещества внутри каждой хроматографической группы могут иметь разную миграцию, что позволяет их дополнительно идентифицировать. Для этого авторы [20] предлагают определять индексы удерживания исследуемых веществ в каждой хроматографической группе. Индексы удерживания рассчитывают по формуле (3): Iуд = x – 1 / 2 – 1 + N (3) где Iуд - индекс удерживания вещества в соответствующей хроматографической группе I x - расстояние от линии старта до центра пятна анализируемого вещества ї1 -расстояние от линии старта до линии миграции одних и тех же стандартных веществ предыдущей хроматографической группы (для І хроматографической группы h = 0) І2 -расстояние от линии старта до линии миграции стандартных веществ следующей хроматографической группы (для VI группы 12 равно величине миграции фронта растворителя) N - номер хроматографической группы
Нами с целью идентификации исследуемых веществ методом ТСХ -скрининга были получены рабочие этанольные растворы залеплона, золпидема и зопиклона с содержанием 2 мг/мл, 2 мг/мл и 2,25 мг/мл, соответственно. Для этого содержимое 2-х капсул залеплона, две таблетки золпидема и три таблетки зопиклона тщательно смешивали в трех пенициллиновых флаконах с 5,0 мл 0,1 н. раствора хлористоводородной кислоты, центрифугировали при 2000 об/мин в течение 5 мин и надосадочные жидкости сливали в колбы. Процедуру выделения повторяли четырехкратно, объединяя в каждом случае надосадочные жидкости. Далее проводили двукратную экстракцию 10,0 мл хлороформа из щелочной среды (рН 9,0-10,0) в течение 5 мин. Фазы разделяли путем центрифугирования, хлороформный слой отделяли, фильтровали через сухой бумажный фильтр и выпаривали досуха при 40о С на водяной бане под слабым током воздуха. Сухие остатки растворяли в 10,0 мл этанола. Для хроматографического анализа использовали полученные растворы оснований исследуемых веществ, пластины «Sorbfil» ПТСХ-П-В (высокоэффективные) и ПТСХ-П-А-УФ (аналитические), размером 10х10 см с флюоресцирующей добавкой (люминофор) и без не, сорбент: силикагель СТХ-1ВЭ и СТХ-1А, соответственно, подложка -полиэтилентерефталат. Растворитель - ацетон, смесь метчиков (стандартных веществ) - хлороформный раствор, содержащий по 1 мг/мл оснований кодеина, дикаина, новокаина, амидопирина и сибазона. Хроматографирование проводили в камерах без насыщения парами растворителя при температуре 19-21 С. Для детектирования зон локализации залеплона, золпидема, зопиклона и метчиков использовали: а) визуальное наблюдение в УФ-свете при 254 нм (золпидем и зопиклон обнаруживались в виде темно–сиреневых пятен, залеплон – голубой флюоресценции); б) гашение флюоресценции (при использовании пластины с флюоресцирующей добавкой): золпидем, зопиклон и метчики проявлялись в виде тмных пятен; в) реактив Драгендорфа (для залеплона с последующей обработкой 10% раствором серной кислоты) наблюдали жлто–оранжевые пятна анализируемых и стандартных веществ. Результаты хроматографического исследования исследуемых веществ приведены на рисунке 11 и в таблице 10, из которых следует, что в описанных условиях ТСХ-скрининга исследуемые вещества разделяются: зопиклон попадает в , а залеплон и золпидем в V хроматографическую группы. Попадая в одну группу, залеплон и золпидем имеют разные индексы удерживания.
Определение кратности экстракции Z-препаратов из водных растворов
По химическому строению залеплон, золпидем и зопиклон являются веществами основного характера, т.к. содержат атомы азота, обладающие основными свойствами, характеризуются гидрофобностью из-за наличия в своих структурах сложно-эфирных групп, атомов галогенов, циклов и др. гидрофобных фрагментов.
Анализируя многочисленные работы, опубликованные в специальной литературе и посвящнные выбору оптимальных условий экстракции веществ основного характера из водных растворов, мы пришли к следующим выводам. Экстракция подавляющего числа токсических лекарственных веществ основного характера проводилась из водных растворов при рН 8,0-10,0 такими растворителями, как хлороформ, хлористый метилен, смеси хлороформа и высших спиртов, диэтиловый эфир (реже). В этих условиях исследуемые вещества, находясь в неионизированной (молекулярной) форме, экстрагировались в максимальных количествах. Диэтиловый эфир, н-гексан и некоторые другие растворители не извлекали вещества или извлекали их в минимальных количествах из кислой среды при рН 1,0-2,0 (ионизированная, протонированная форма).
Как видно из таблицы 13, золпидем и зопиклон в максимальных количествах находятся в неионизированной форме при рН 9,0-10,0 и могут быть экстрагированы из водных растворов при этих значениях рН также в максимальных количествах. Исключительно малое содержание исследуемых веществ в неионизированной форме присутствует в растворе при рН 2,0-3,0 поэтому в данных условиях вещества либо не будут извлекаться, либо их выход будет ничтожно мал. Расчты для залеплона не проводились, в связи с тем, что в литературе нами не найдена величина его рКа. Можно предполагать, что расчетные данные для залеплона не будут сильно отличаться от приведенных в таблице 13.
Используя полученные данные, для изучения экстракции залеплона, золпидема и зопиклона нами выбраны значения рН растворов 2,0 и 9,0. В качестве органических растворителей использовали н-гексан, хлороформ и диэтиловый эфир. Для этого были приготовлены рабочие водные раствора залеплона, золпидема и зопиклона с концентрациями 5 мкг/мл, 10 мкг/мл и 15 мкг/мл соответственно. Были проведены две серии экспериментов. В первой серии водные растворы в количестве 5,0 мл подкисляли концентрированной хлористоводородной кислотой (рН 2,0) и экстрагировали 5,0 мл указанных органических растворителей (с каждым растворителем выполняли по пять определений). Во второй серии водные растворы подщелачивали 25% раствором аммония гидроксида (рН 9,0) и далее исследование проводили, как указанно выше. Органические фазы в том и другом случае выпаривали, остатки растворяли в 5,0 мл этанола и растворы спектрофотометрировали в диапазоне 200-400 нм. При исследовании залеплона для каждого органического растворителя и значения рН среды получены спектры поглощения. Для примера приводим спектры абсорбции залеплона после экстракции н-гексаном из кислой среды (рисунок 25) и хлороформом при рН 9,0 (рисунок 26), результаты количественного определения приведены в таблице 14, из которой видно, что наименьший выход залеплон наблюдается при экстракции н-гексаном при рН 2,0, а максимальное количество извлекается хлороформом из щелочной среды. Необходимо отметить, что залеплон сравнительно в больших количествах извлекается из кислой среды хлороформом и диэтиловым эфиром, что может быть связано со слабыми основными свойствами залеплона.
При изучении экстракции зопиклона из растворов, содержащих 15 мкг/мл, во всех случаях были получены отрицательные результаты, как при извлечении из кислых, так и щелочных растворов. Эксперименты были повторены с раствором, содержащим 150 мкг зопиклона в 1 мл. В результате зопиклон удалось извлечь из щелочной среды только хлороформом, получить характерные для него спектры и определить в количестве 34,67±0,21% (таблица 18). Полученные данные, а также результаты по изучению деградации зопиклона свидетельствуют о том, что зопиклон в щелочной среде является неустойчивым и разрушается.
Таким образом, результаты проведенных экспериментов по изучению экстракции залеплона, золпидема и зопиклона из водных растворов, показали, что оптимальным органическим растворителем, который может быть применн для экстракционной очистки исследуемых веществ из кислой среды, является н-гексан. Наибольшей экстрагирующей способностью в щелочной среде обладает хлороформ.
Эксперименты по определению количества ступеней экстракции для полного извлечения исследуемых веществ из водных растворов проводили по следующей методике.
По 5,0 мл водных растворов залеплона, золпидема и зопиклона, содержащих 25 мкг, 50 мкг и 750 мкг соответственно, помещали в пенициллиновые флаконы, подщелачивали 25 % раствором аммония гидроксида до рН 9,0 и экстрагировали 5,0 мл хлороформа в течение 5 мин. После центрифугирования при 2000 об/мин органическую фазу отделяли, фильтровали через сухой бумажный фильтр в присутствии безводного натрия сульфата, фильтр промывали небольшим количеством хлороформа (1,0-1,5 мл) и растворитель выпаривали досуха на водяной бане при температуре 40оС под слабым током воздуха (I ступень экстракции). Процедуру экстракции повторяли еще два раза 5,0 мл хлороформа в течение 5 мин (II и III ступени экстракции). Сухой остаток растворяли в 5,0 мл этанола и растворы спектрофотометрировали в диапазоне 200-400 нм по сравнению с холостыми пробами (среднее значение оптической плотности холостых проб равно 0,020). Характер спектральных кривых представлен на рисунках 29,30,31, а значения оптических плотностей и выход - в таблицах 16,17,18. Количественное определение проводили по стандарту.
Изолирование и определение анализируемых веществ при исследовании мочи
В специальной литературе нами не найдено работ, посвящнных изучению сохраняемости залеплона и золпидема в тканях внутренних органов. В работе Егоровой Е.И. [6], посвященной исследованию золпидема в химико-токсикологическом отношении, изучено влияние процессов биодеградации на исследуемое вещество в моче при разных сроках и условиях хранения проб.
Разработанный нами метод был применен для исследования трупного материала, находящегося в стадии гнилостного разложения. С этой целью были проведены эксперименты по сохраняемости золпидема и залеплона в образцах трупной печени в процессе хранении их при температуре 5оС и 18-20оС в течение трх и шести месяцев.
По 5,0 г измельченной ткани печени трупов людей, погибших от травм, помещали в пенициллиновые флаконы вместимостью 20 мл, в пять из которых добавляли по 1,0 мл водного раствора исследуемых веществ (залеплона и золпидема тартрата), содержащих 400 мкг в 1,0 мл, в шестой флакон помещали 1,0 мл воды. Содержимое флаконов перемешивали в течение 10 мин, герметично закрывали и хранили в указанных выше условиях. После чего проводили анализ по разработанной методике, экстракционную очистку н-гексаном в случае хранения объектов при температуре 18-20 оС повторяли 2-3 раза.
В результате ТСХ-скрининга полученные хроматограммы просматривали в УФ-свете (залеплон обнаруживался в виде светло-голубой полосы, золпидем - в виде гашения флюоресценции темно-сиреневого цвета) и последовательно обрабатывали реактивом Драгендорфа - наблюдали полосы, окрашенные в оранжевый цвет, расположенные в V хроматографической группе на уровне стандартов, имеющие одинаковые индексы удерживания, равные 5,78±0,06 для залеплона и 5,19+0,09. Результаты представлены на рисунке 64. Отмеченные окрашенные полосы счищали в пенициллиновые флаконы, добавляли по 5,0 мл 0,1 М раствора натрия гидроксида и хлороформа, экстрагировали в течение 5 мин и центрифугировали при 3000 об/мин в течение 5 мин.
Хроматограммы, полученные при исследовании залеплона (а) и золпидема (б): 2/- обнаруженные полосы исследуемых веществ; 2,3 и 4- полосы соэкстрактивных веществ; остальные обозначения приведены на рис.11 Хлороформные экстракты отделяли, фильтровали, выпаривали досуха, растворяли сухие остатки в различных объемах этанола и спектрофотометрировали по сравнению с холостыми пробами. Необходимо отметить, что оптические плотности холостых проб по сравнению с этанолом в максимумах поглощения залеплона и золпидема не превышали значений, равных 0,050. Для примера приводим спектры абсорбции залеплона и золпидема, выделенных после хранения объектов в течение 6 месяцев при температуре 18 121 20оС (рисунки 65,66). Характер спектральных кривых веществ, изолированных после хранения в других условиях, аналогичен приведнным на рисунках 65,66. Рисунок 65 – Спектры абсорбции залеплона, выделенного из ткани печени при условии хранения проб в течение 6 месяцев при t = 5 оС (2-6), 1 – спектр нативного вещества Рисунок 66 – Спектры абсорбции золпидема, выделенного из ткани печени при условии хранения проб в течение 6 месяцев при t = 5 оС (2-6), 1 – спектр нативного вещества Как видно из рисунков 65,66 спектры поглощения анализируемых веществ, выделенных из гнилостно изменнных образцов печени, полностью совпадают со спектрами нативных веществ. Для расчта количественного содержания веществ, выделенных из объектов исследования, использовали метод стандарта (оптические плотности растворов золпидема и залеплона, содержащих по 10 мкг в 1,0 мл, соответственно равны
Из приведнных в таблицах данных, следует, что анализируемые вещества сохраняются в ткани печени при указанных сроках хранения и температурных режимах. Выход залеплона и золпидема после 6-ти месячного хранения при комнатной температуре составил в среднем 19% и 34% соответственно.
Проводили идентификацию методом ВЭЖХ, при условиях, описанных выше (глава 4, п. 4.1.). Результаты исследования методом ВЭЖХ показывают, что параметры удерживания залеплона и золпидема совпадают с параметрами удерживания стандартных веществ и равны 16,486 и 10,715, соответственно. Для примера приводим хроматограммы (рисунки 67,68), при исследовании залеплона и золпидема, выделенных из гнилостного материала при условиях хранения в течение 6 месяцев при температуре 18-20оС. DDIA3g4BQ4№Wf (l\«lCPCQeaDip Norm. 100 I/ аэ- ш- 0- - 1 „ , I „ —- -___-__
В специальной литературе по химико-токсикологическому анализу зопиклона нами найдена только одна работа [22], в которой показано, что зопиклон сохраняется в биологическом материале в течение 21 дня при изолировании его с помощью хлороформа из щелочной среды. Зопиклон, в отличие от залеплона и золпидема, имеет характерные особенности - является не достаточно стойким соединением (разрушается в щелочной среде). Поэтому представляло интерес выяснить, насколько стабилен зопиклон в биологическом материале при длительном хранении.
Изолирование зопиклона из объектов, содержащих 600 мкг в 5 г печени и экстракционную очистку проводили также как при исследовании залеплона и золпидема. В результате ТСХ-скрининга и рассматривания хроматограмм в УФ-свете ( 254 нм) наблюдали полосы темно-сиреневого цвета в III хроматографической группе на уровне пятен зопиклона с 1уд 3,04+0,08 и полосы слабой интенсивности, по-видимому, соэкстрактивных веществ (рисунок 69). Далее выделенные зоны, на уровне стандарта, счищали в пенициллиновые флаконы