Изолирование лекарственных средств из плазмы крови с применением протеолитических ферментов Чувина Наталья Александровна

Введение к работе

Актуальность проблемы. Химико-токсикологический анализ в случае острых отравлений различными ядами, и в частности лекарственными средствами, является одним из наиболее важных этапов в комплексе диагностических и лечебных мероприятий. Проведение лабораторного исследования включает четыре основных этапа: изолирование токсических веществ из биологического объекта (биологических жидкостей, биологического материала), очистку и концентрирование полученного извлечения, идентификацию веществ и их количественное определение.

Для диагностики острых отравлений наиболее информативной жидкостью является кровь, так как после поступления в кровеносное русло любое химическое вещество, в том числе и лекарственное средство, в той или иной степени связывается с белками плазмы крови, преимущественно с альбумином. Исследование плазмы крови позволяет судить о наличии и фактическом содержании токсикантов в организме в определенный момент времени, при этом фармакокинетический показатель степени связывания с белками плазмы крови для некоторых лекарственных средств может достигать 90-98% (например, дифенгидрамин, фенотиазины и др.).

Основным и наиболее важным в анализе токсических веществ является этап изолирования ксенобиотиков из биологического объекта. На этом этапе можно частично или полностью потерять токсическое вещество и впоследствии не обнаружить его даже при использовании современного и высокочувствительного аналитического оборудования. Применяемые в настоящее время методы изолирования лекарственных средств не всегда отвечают требованиям современной аналитической токсикологии. Известно, что для изолирования лекарственных средств из крови (плазмы крови) используются методы: прямой жидкость-жидкостной экстракции органическим растворителем (ЖЖЭ) при определенном значении рН среды; экстракция после использования осаждающих агентов (трихлоруксусной кислоты раствора 50% (ТХУ) или натрия вольфрамата раствора 10% в серной кислоты растворе 25%) или высаливающих агентов (аммония сульфата, натрия хлорида растворы насыщенные); также изолирование после гемолиза эритроцитов крови водой очищенной. В то же время, существующие методы изолирования токсических веществ из крови практически не позволяют выделить фракцию токсиканта, связанную с белками крови, и при ЖЖЭ в органический слой экстрагируется только его свободная фракция.

В связи с вышеизложенным, для целей химико-токсикологического анализа актуальным остается вопрос разработки новых или усовершенствование существующих методик изолирования токсических веществ, позволяющих максимально разрушить комплекс «белок – токсикант». Это позволит существенно увеличить процент выделенного токсического вещества, что, в свою очередь, повысит эффективность лабораторной диагностики острых отравлений. Весьма перспективным является применения с этой целью различных ферментативных препаратов. Методики ферментативного гидролиза биологических жидкостей (мочи) для разрушения водорастворимых метаболитов ксенобиотиков (глюкурониды, сульфаты) с применением ферментов -глюкуронидазы и -сульфотазы в литературе описаны, однако сведения о применении протеолитических ферментов для гидролиза крови, плазмы крови с целью выделения токсиканта в литературе отсутствуют.

Цель работы. Разработка метода изолирования лекарственных средств из плазмы крови после гидролиза ее белковых молекул протеолитическими ферментами для целей химико-токсикологического анализа.

Задачи исследования. Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

1. 1. 1. Выбрать лекарственные средства, различающиеся по химическому строению, кислотно - основным свойствам, степени связывания с белками плазмы крови и наиболее часто встречающиеся в судебно — химической и химико — токсикологической экспертизе.

      2. Установить оптимальные условия (время и температура инкубации, значение рН среды, соотношение субстрат : фермент) для проведения гидролиза протеолитическими ферментами (пепсин, трипсин, химотрипсин, химопсин) на примере модельного комплекса «раствор альбумина – раствор кофеина»

      3. Применить разработанные методики ферментативного гидролиза для изолирования анализируемых веществ из модельного комплекса «плазма крови – раствор анализируемого вещества».

      4. Сравнить эффективность известных методов изолирования изучаемых веществ из плазмы крови (жидкость — жидкостная экстракция с осаждением и без осаждения белков, твердофазная экстракция) с разработанным методом ферментативного гидролиза белков плазмы крови и определить для него некоторые валидационные характеристики (сходимость, внутрилабораторная воспроизводимость и робастность).

      5. Апробировать разработанный метод на экспертном материале и внедрить его в практику работы бюро судебно-медицинской экспертизы и наркодиспансеров.

      Научная новизна работы. Доказано, что при прямой ЖЖЭ органическим растворителем извлекается из плазмы крови лишь свободная, не связанная с белками крови фракция анализируемых веществ; предварительное использование осаждающих реагентов при изолировании токсических веществ не всегда приводит к увеличению степени экстракции.

      Впервые изучена возможность изолирования исследуемых веществ из плазмы крови с применением гидролиза протеолитическими ферментами и выявлены ее особенности. Показано, что на процесс ферментативного гидролиза белков плазмы крови влияют свойства фермента, время инкубации, соотношение субстрат : фермент, значение рН среды и температура.

      Установлено, что по сравнению с методом ЖЖЭ изолирование исследуемых веществ из плазмы крови после гидролиза химопсином для кофеина, целекоксиба, оснований дифенгидрамина, хлоропирамина, клемастина, папаверина и ферментом трипсином для производных барбитуровой кислоты (фенобарбитал, барбамил) приводит к увеличению степени экстракции в 1.8-2 раза, как и при изолировании их методом твердофазной экстракции (ТФЭ) на патронах марки Oasis HLB. Использование при гидролизе ферментов: пепсин, химотрипсин приводит к незначительному увеличению степени экстракции изученных лекарственных средств по сравнению с методами ЖЖЭ и ТФЭ, ввиду их большой специфичности по отношению к гидролизу пептидных связей определенных пар аминокислот в белковой молекуле.

      При целенаправленном исследовании оснований дифенгидрамина, хлоропирамина, клемастина, папаверина и целекоксиба следует использовать патроны марки Oasis МСХ, а для веществ кислотного характера (производные барбитуровой кислоты) - патроны марки Oasis МАХ, что также позволяет увеличить степень экстракции по сравнению с методом ЖЖЭ. Патроны марки Oasis WCX и WAX не могут быть использованы для изолирования изучаемых ксенобиотиков, так как они не осаждаются на сорбенте патрона.

      Впервые показано, что при использовании метода ферментативного гидролиза плазмы крови с целью изолирования ксенобиотиков и метода ТФЭ результаты исследования сопоставимы. Метод ферментативного гидролиза можно рекомендовать для использования в практике работы судебно-химических и химико-токсикологических лабораторий.

      Практическое значение работы. Разработаны методики гидролиза плазмы крови протеолитическими ферментами с целью последующего изолирования токсических веществ.

      Проведена сравнительная оценка методов изолирования токсикантов из плазмы крови: ЖЖЭ органическим растворителем, изолирование после осаждения белков, изолирование после ферментативного гидролиза и изолирование методом ТФЭ.

      Определены некоторые валидационные характеристики (прецизионность – сходимость и внутрилабораторная воспроизводимость, робастность) для разработанного метода ферментативного гидролиза плазмы крови ферментом химопсином для изолирования кофеина, целекоксиба, дифенгидрамина, хлоропирамина, клемастина, папаверина и трипсином для некоторых производных барбитуровой кислоты (барбамила, фенобарбитала).

      Разработанные методики апробированы, утверждены и внедрены в практику работы судебно-химических отделений ГКУЗ БСМЭ ЛО и СПб ГБУЗ БСМЭ, химико-токсикологической лаборатории СПБ ГБУЗ МНД №1 и ГУ СПб НИИ СП им. И.И. Джанелидзе и используются в учебном процессе кафедр фармацевтической химии ГБОУ ВПО СПХФА Минздрава России и ГБОУ ВПО ПГФА Минздрава России.

      Апробация работы. Основные материалы работы доложены на Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 90 и 95-летию СПб ГУЗ БСМЭ, «Актуальные вопросы судебно-медицинской экспертизы трупа» (Санкт-Петербург, 2008, 2013); Российской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные вопросы судебно-химических, химико-токсикологических исследований и фармацевтического анализа» (Пермь, 2009); Всероссийской научной конференции студентов и аспирантов с международным участием «Молодая фармация – потенциал будущего» (Санкт-Петербург, 2011); Российской научной конференции с международным участием «Актуальные проблемы токсикологии и радиобиологии» (Санкт-Петербург, 2011); научной конференции «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (Пятигорск, 2011 и 2012).

      Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 печатных работ, из них 6 в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК.

      Связь задач исследования с планом фармацевтических наук Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом исследовательских работ ГБОУ ВПО СПХФА Минздрава России «Синтез, изучение строения, фармакологического действия новых биологических веществ или модифицированных субстанций, препаратов и разработка валидированных методик их стандартизации», номер государственной регистрации ЦИТиФ №01201252028.

      Основные положения, выносимые на защиту:

      1. Обоснование результатов экспериментальных исследований по изолированию заявленных ксенобиотиков из плазмы крови методом ЖЖЭ органическим растворителем, и производных барбитуровой кислоты после осаждения белков трихлоруксусной кислоты раствором 50% и натрия вольфрамата раствором 10% в серной кислоты растворе 25% .

      2. Данные экспериментальных исследований по изолированию ксенобиотиков из плазмы крови после ферментативного гидролиза протеолитическими ферментами.

      3. Результаты экспериментальных исследований по изолированию веществ методом ТФЭ на патронах марки Oasis (HLB, MCX, WAX, MAX).

      4. Сравнительная оценка разработанного метода ферментативного гидролиза с методами прямой ЖЖЭ органическими растворителем, с осаждением и без осаждения белков плазмы крови и ТФЭ.

      Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 157 страницах машинописного текста, иллюстрирована 36 рисунками и 45 таблицами, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (4 главы), результатов и выводов, списка литературы, включающего 150 наименований (источников 35 зарубежной литературы) и приложения.

      Похожие диссертации на Изолирование лекарственных средств из плазмы крови с применением протеолитических ферментов

      

      Динамика содержания витаминов А и Е в плазме крови больных до и после приема комплексных витаминных препаратовХашан Имад

      Исследование взаимодействия рентгеноконтрастных средств с белками плазмы крови методами ядерной радиоэлектроскопииПанов, Вадим Олегович

      

      Реконструированные липопротеины плазмы крови : Получение, структура, свойства, применениеМишарин Александр Юрьевич

      Клинико-лаболаторное обоснование применения лазерной корреляционной спектроскопии (ЛКС) плазмы крови в качестве скрининг-метода по формированию групп повышенного онкологического риска среди населения, подвергшегося облучениюПашков, Игорь Александрович

      

      Антиоксидантная активность плазмы крови как критерий оценки функционального состояния антиоксидантной системы организма и эффективности применения экзогенных антиоксидантов Теселкин Юрий Олегович

      Препараты внутривенных иммуноглобулинов из донорской плазмы для терапии бактериальных и вирусных инфекций : Получение и клиническое применениеШарыгин, Сергей Леонидович

      Разработка новой технологии и исследование процессов обесклеивания натурального шелка с применением ферментовХамидова, Венера Джавдатовна

      Комплексное лечение гнойно-воспалительных заболеваний мягких тканей с применением фермента и антисептиков, иммобилизированных на сорбентеКоваленко, Тимофей Федорович

      Разработка технологии соленых изделий из парной свинины в условиях электромеханических воздействий и применения комплекса ферментовРариву, Сулунантенаина Жеминирина

      Гидролиз и модификация липидов с применением липолитических ферментов дрожжей Candida rugosa и Yarrowia lipolyticaЧан Тхи Тху Хыонг