Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Характеристика ивы вавилонской и гибрида ивы вавилонской и ивы белой. Химический состав и фармакологические свойства 14
1.1 Ботаническая характеристика ивы вавилонской и гибрида ивы вавилонской и ивы белой, произрастающих на Северном Кавказе 14
1.2 Биологически активные вещества растений рода Salix 18
1.3 Применение растений рода Salix в медицине 30
Заключение по обзору литературы 33
Экспериментальная часть 35
Глава 2 – Объекты, материалы и методы исследования
2.1 Объекты и материалы исследования 36
2.2 Химические и физико-химические методы анализа
2.2.1 Определение флавоноидов 38
2.2.2 Определение дубильных веществ 42
2.2.3 Определение фенологликозидов 44
2.2.4 Определение полисахаридов 46
2.2.5 Определение фенолкарбоновых кислот 48
2.2.6 Определение органических кислот 50
2.2.7 Определение суммарного содержания водорастворимых антиоксидантов 53
2.2.8 Определение макро- и микроэлементов 55
2.3 Фармакологические методы исследования 56
Глава 3. Фитохимический анализ коры и побегов ивы вавилонской и гибрида ивы вавилонской и ивы белой 60
3.1 Исследование флавоноидов 60
3.2 Исследование дубильных веществ 66
3.3 Исследование фенологликозидов з
3.4 Выделение и исследование полисахаридного комплекса 75
3.4.1 Количественное определение полисахаридного комплекса 76
3.4.2 Качественный моносахаридный состав полисахаридов
3.5 Исследование фенолкарбоновых кислот 78
3.6 Исследование органических кислот 82
3.7 Определение суммарного содержания водорастворимых антиоксидантов 85
3.8 Определение макро- и микроэлементного состава 87
3.9 Сравнительная оценка результатов фитохимического анализа изучаемого сырья 91
Выводы по главе 3 93
Глава 4 Изучение фармакологической активности порошка коры и побегов ивы вавилонской и гибрида ивы вавилонской и ивы белой 95
4.1 Изучение противовоспалительного действия 96
4.2 Изучение ульцерогенного действия 99
Выводы по главе 4 100
Глава 5 Стандартизация коры и побегов ивы вавилонской и гибрида ивы вавилонской и ивы белой 102
5.1 Изучение динамики накопления БАВ в исследуемых объектах по фазам вегетации 102
5.1.1 Динамика накопления флавоноидов 102
5.1.2 Динамика накопления дубильных веществ 103
5.1.3 Динамика накопления фенологликозидов 104
5.2 Определение показателей норм качества коры и побегов ивы вавилонской и гибрида ивы вавилонской и ивы белой 105
5.2.1 Определение показателей подлинности сырья 105
5.2.1.1 Кора ивы вавилонской и ее гибрида с ивой белой 106
5.2.1.2 Побеги ивы вавилонской и ее гибрида с ивой белой 110
5.2.2 Разработка числовых показателей 118
5.2.2.1 Определение влажности 118
5.2.2.2 Определение золы 119
5.2.2.3 Определение примесей
5.2.3 Качественный анализ 120
5.2.4 Количественный анализ
5.2.4.1 Определение содержания флавоноидов 121
5.2.4.2 Определение содержания дубильных веществ 124
5.2.4.3 Определение содержания салицина 124
5.2.5 Определение сроков годности сырья и составление проектов ФС 126
Выводы по главе 5 129
Заключение 131
Список литературы
- Биологически активные вещества растений рода Salix
- Определение фенологликозидов
- Качественный моносахаридный состав полисахаридов
- Динамика накопления фенологликозидов
Введение к работе
Актуальность темы исследования. В настоящее время все больше
людей на Земле используют для лечения и профилактики заболеваний
растительные препараты. Особое значение в медицинской практике имеют
противовоспалительные лекарственные средства растительного
происхождения. Даже при применении современных синтетических
противовоспалительных препаратов использование новых эффективных и
малотоксичных растительных лекарственных средств, способных регулировать
течение воспалительного процесса, остается весьма актуальным. Кроме того,
современные противовоспалительные средства третьего поколения не всегда
доступны широкому кругу людей вследствие своей высокой стоимости.
Поэтому поиск и разработки новых препаратов растительного происхождения,
обладающих достаточной активностью, низкой токсичностью, широким
спектром фармакологических эффектов и возможностью длительного
использования без опасности развития побочных эффектов, является
актуальной задачей фармации. Одним из перспективных источников получения
таких препаратов являются различные виды ивы, которые имеют достаточную
сырьевую базу в России, доступность сырья, высокую продуктивность и
повышенную регенерационную способность. Извлечения из ивы широко
используются в народной медицине уже около 3,5 тысяч лет.
В настоящее время кора ивы включена в Европейскую (2007) и
Британскую (2009) фармакопеи, а также в Американскую травяную
фармакопею (1999). В нашей стране зарегистрирован в официальной медицине
комбинированный препарат «Инсти» (производства Пакистан), содержащий
кору ивы белой. Все остальные средства, содержащие в основном
измельченную кору или экстракт ивы белой, применяются только в качестве
биологически активных добавок («Гербасприн» компании «Парафарм» г.
Москва и другие). Работами О.О. Хитевой (2012) показана перспективность
применения побегов ивы белой (Salix alba L.), произрастающей на Северном
Кавказе, как альтернативного сырья, для уменьшения наносимого растению
вреда при заготовке. Поэтому актуальной проблемой является расширение
сырьевой базы растительного сырья ивы на примере ивы вавилонской (Salix babylonica L.) и гибрида ивы вавилонской и ивы белой (Salix babylonica L. Salix albaL.), являющихся декоративными интродуцентами Северного Кавказа с богатой сырьевой базой не только коры, но и побегов.
Степень разработанности темы исследования. В 60-е годы прошлого столетия в СССР изучением химического состава некоторых видов ивы занимались В.А. Компанцев (1970, 1993) и А.А. Насудари (1966). За последние годы был проведен ряд исследовательских работ по изучению ив России (В.Б. Браславский (2012), О.О. Хитева (2012), А.И. Бонцевич (2007).
Продолжается изучение ивы азиатской части России (А.А. Петрук, 2012) и Северного Кавказа (Е.Г. Санникова, 2015). Ивы изучаются в Украине (Н.В. Бородина, 2015) и Белоруссии (Н.А. Кузьмичева, 2012).
Наименее изученными объектами являются ива вавилонская (плакучая) и
ее гибрид с ивой белой. До настоящего времени они рассматривались только
как декоративные растения. При этом следует отметить, что они хорошо
культивируются в южных районах нашей страны, в том числе на Северном
Кавказе. В таких странах, как Турция, Египет, Мексика, Иран, Германия, Китай
изучался химический состав ивы вавилонской. Были обнаружены в коре и
листьях флавоноиды, фенологликозиды, дубильные вещества, алифатические
углеводороды. В нашей стране данные виды растительного сырья ранее
изучались В.А. Компанцевым (1970, 1993). Исследования касались
установления качественного состава фенольных соединений (флавоноидов,
дубильных веществ, фенологликозидов) в коре и листьях. Было определено
количественное содержание фенологликозидов в коре гибрида ивы
вавилонской и ивы белой (2,1%). Использованные им методы были трудоемки
и требовали больших затрат сырья. Несомненным достоинством ивы
вавилонской и ее гибрида с ивой белой является большая сырьевая масса
молодых, не одревесневших ветвей, которые можно заготавливать в
значительном объеме без ущерба для растения. Для включения в проект
нормативной документации на кору и побеги данных видов ивы, необходимо
дополнить и расширить сведения о химическом составе сырья, используя
современные методы определения биологически активных веществ (БАВ), а также определить морфолого-диагностические признаки данных видов сырья. Решение этих вопросов позволит обосновать возможность использования коры и побегов ивы вавилонской и ее гибрида с ивой белой в медицинской практике.
Цель и задачи исследования. Целью диссертационной работы явилось изучение коры и побегов ивы вавилонской и гибрида ивы вавилонской и ивы белой, произрастающих на Северном Кавказе, для расширения сырьевой базы лекарственного растительного сырья (ЛРС) и обоснования возможности дальнейшего использования в медицине.
Для достижения цели планируется решение следующих задач:
S провести поиск и систематизацию литературных данных по вопросу изучения химического состава, использования в народной и официальной медицине ивы вавилонской и ее гибрида с ивой белой в России и за рубежом;
S провести сравнительный анализ химического состава ивы вавилонской и ее гибрида с ивой белой по известным группам БАВ (флавоноиды, фенологликозиды, дубильные вещества), найденным в ранее изученных видах ивы;
S на примере ивы вавилонской и ее гибрида с ивой белой для расширения представления об их химическом составе провести определение полисахаридов, органических кислот и аскорбиновой кислоты;
S изучить динамику накопления основных групп биологически активных веществ в коре и побегах ивы вавилонской и ее гибрида с ивой белой в зависимости от времени года для выбора оптимальных сроков заготовки сырья;
S определить суммарное содержание водорастворимых
антиоксидантов в коре и побегах ивы вавилонской и ее гибрида с ивой белой и изучить фармакологическую активность порошков коры и побегов исследуемых видов ивы;
провести морфолого-анатомическое изучение и разработать предварительный проект нормативной документации на предлагаемое лекарственное растительное сырье.
Научная новизна исследований. Проведен комплексный химический
анализ коры и побегов ивы вавилонской и ее гибрида с ивой белой,
произрастающих на Северном Кавказе. С использованием современных
методов анализа идентифицированы флавоноиды (рутин, лютеолин,
кверцетин), конденсированные дубильные вещества, фенольные гликозиды
(салицин, триандрин), фенолкарбоновые кислоты (салициловая, кофейная,
феруловая, п-гидроксибензойная). Количественно определено содержание
флавоноидов (методом дифференциальной спектрофотометрии), салицина
(методом высокоэффективной жидкостной хроматографии), конденсированных
дубильных (окисляемых) веществ (методом перманганатометрического
титрования), фенолкарбоновых кислот (экстракционно-
спектрофотометрическим методом). Идентифицированы органические кислоты (щавелевая, яблочная, аскорбиновая кислоты) и определено их количественное содержание.
В коре и побегах ивы вавилонской и ее гибрида выделены полисахариды,
определено их количественное содержание и состав моносахаров
водорастворимых полисахаридов (ВРПС) и пектиновых веществ (ПВ). Определено суммарное содержание водорастворимых антиоксидантов с использованием амперометрического метода.
Проведенные фармакологические исследования порошков коры и побегов ивы вавилонской и ее гибрида показали наличие антиэкссудативной активности, сопоставимой с лекарственным средством диклофенак натрия. Выявленные эффекты порошков коры и побегов исследуемых видов ивы в определенной степени способствуют регенерации тканей в очаге воспаления.
Масс-спектрометрическим методом определен макро- и
микроэлементный состав коры и побегов исследуемых видов ивы. Найдено 35 элементов, в том числе 7 эссенциальных и 5 условно-эссенциальных. Установлено содержание тяжелых металлов, которое не превышает нормы, предлагаемые ГФ ХIII издания.
Проведены морфолого-анатомические исследования коры и побегов ивы
вавилонской и ее гибрида с ивой белой, а также порошка побегов исследуемых
видов ивы, выявлены основные диагностические признаки, позволяющие определить подлинность сырья.
При изучении динамики накопления основных групп БАВ (флавоноидов, салицина, дубильных веществ), в сырье собранном за период с 2012 по 2015 года, были определены основные сроки заготовки.
Теоретическая и практическая значимость работы. Теоретическая значимость. В результате проведенных исследований были получены новые данные о морфолого-анатомических признаках и химическом составе коры и побегов ивы вавилонской и ее гибрида с ивой белой. Выявлены диагностические признаки исследуемых видов. Определено количественное содержание групп биологически активных веществ, найденных в ранее изученных видах ивы (флавоноиды, фенологликозиды, дубильные вещества). Расширены представления о полисахаридах, органических кислотах и микроэлементах, входящих в состав растений рода Salix.
Практическая значимость. Фармакологические исследования показали, что данное сырье перспективно для использования в медицинской практике как эффективное противовоспалительное средство с хорошими регенерирующими свойствами. Сбор побегов даст возможность для расширения сырьевой базы лекарственного растительного сырья и не нанесет растению значительного ущерба при заготовке. Впервые проведена стандартизация коры и побегов ивы вавилонской и ее гибрида с ивой белой и составлены предварительные проекты фармакопейных статей (ФС). Предложенные в диссертационной работе методики количественного определения суммы флавоноидов и салицина в ЛРС используются в учебном процессе кафедры фармации КГБОУ ДПО «Институт повышения квалификации специалистов здравоохранения» Минздрава России и кафедры фармакогнозии ГБОУ ВПО ДГМУ Минздрава России. Методика количественного определения салицина в ЛРС апробирована в Хабаровском филиале ФГБУ «Информационно-методический центр по экспертизе, учету и анализу обращения средств медицинского применения» Росздравнадзора РФ.
Методология и методы исследования. Методологическая основа
исследования построена на изучении и обобщении литературного материала по
теме диссертации и включает фитохимические, фармакологические и стандартизационные исследования. Работа проведена с использованием современных физико-химических методов (масс-спектрометрия, тонкослойная (ТСХ) и высокоэффективная жидкостная хроматография, спектрофотометрия (СФМ)), которые просты в выполнении, экспрессны и объективны. Кроме того, были использованы химические и фармакологические методы, а также методы фармакогностического анализа лекарственного растительного сырья.
Положения, выдвигаемые на защиту:
1. Результаты химического исследования коры и побегов ивы
вавилонской и ее гибрида с ивой белой;
2. Результаты морфолого-анатомического исследования коры и побегов
исследуемых видов ивы, диагностические признаки порошка, сравнительный
анализ с ивой белой;
3. Фармакологические исследования порошков коры и побегов
исследуемых видов ивы;
4. Результаты установления норм качества сырья.
Степень достоверности и апробация результатов исследования.
Достоверность полученных результатов обусловлена использованием
современных методов анализа и их статистической обработкой. Фрагменты
диссертационной работы были доложены и обсуждены на 70-й, 71-й, 72-й
научно-практической конференции молодых ученых и студентов
Дальневосточного государственного медицинского университета с
международным участием (Хабаровск, апрель 2013 г., апрель 2014 г., апрель
2015 г.); на межрегиональной научно-практической конференции с
международным участием «Современное состояние и перспективы
фармацевтического образования и науки для повышения кадрового потенциала Дальневосточного региона», посвященной 50-летию открытия первого на Дальнем Востоке фармацевтического факультета (Хабаровск, 17-18 сентября 2014 г.); на научно-практической конференции «Современные фитопрепараты в фармацевтической и медицинской практике» (Хабаровск, 27 февраля 2015 г.);
на 4-й всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Беликовские чтения» (Пятигорск, 1-2 декабря 2015 г.).
По теме диссертации опубликовано 12 работ, из них в журналах, рекомендованных ВАК - 4.
Личный вклад соискателя. Автором проведены поиск и систематизация данных отечественной и зарубежной литературы, фитохимическое и морфолого-анатомическое изучения коры и побегов ивы вавилонской и ее гибрида с ивой белой и исследования по стандартизации данного сырья. Автор лично принимал участие во всех экспериментальных исследованиях, а также в научных конференциях, в написании диссертации и статей по теме диссертации.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 154 страницах компьютерного текста и состоит из обзора литературы, 4 глав собственных исследований, заключения, списка литературы, состоящего из 191 источников, в том числе 43 иностранных, содержит 37 таблиц, 25 рисунков и 2 приложения.
Биологически активные вещества растений рода Salix
Терапевтическая ценность лекарственных растений определяется входящими в их состав биологически активными веществами. БАВ - это вещества, способные оказывать влияние на биологические процессы, протекающие в организме. За долгую историю поисков и практического использования таких веществ накопились сведения о биологической активности большого числа химических соединений с полностью или частично установленной структурой. Только фармакологическая активность, если судить по различным справочникам и фармакопеям, описана примерно у 12 тыс. различных соединений. Для некоторых из них известны органы - мишени, то есть физиологические системы организма, на которые действует данное соединение. В значительно меньшем объёме известны те биохимические или молекулярно-биологические процессы, на которые действуют эти вещества.
Изучением химического состава различных видов ивы начали заниматься еще в XVIII веке. История применения и химический состав ивы достаточно полно описаны в диссертациях по изучению ивы белой (Salix alba L.) и ивы остролистной (Salix acutifolia Willd.), выполненных за последние годы [10,11]. В своей работе, чтобы избежать повторений с вышеуказанными работами, мы ограничились кратким аналитическим обзором известной на данный момент информации о химическом составе некоторых видов ивы и проявляемых видах фармакологической активности. Кроме того, более подробно мы остановились на исследованиях ивы, проведенных за последние несколько лет в нашей стране и за рубежом.
В настоящий момент известно, что основными действующими веществами изученных видов ивы являются фенологликозиды, флавоноиды, дубильные вещества [12,13], а также в их состав входят фенолокислоты, аскорбиновая кислота, аминокислоты, сапонины, эфирные масла и полисахариды, которые могут вносить вклад в общий фармакологический эффект [14,15,16,17]. Известно, что количественное содержание БАВ в коре и листьях может меняться в различные фазы вегетации и зависит от условий произрастания [18].
Рассмотрим отдельные группы БАВ ивы и возможные фармакологические действия, связанные с ними.
Одними из основных представителей БАВ семейства Salicaceae являются фенологликозиды, агликоном которых является салициловый спирт. Первый фенологликозид, выделенный из растений - салицин (саликозид) - представляет собой -глюкозид салицилового спирта. Его получил из коры ивы французский ученый И. Леру в 1829 году [19]. Именно с салицилатами связаны основные виды действия ивы – противовоспалительное, жаропонижающее и мягкое анальгезирующее [20]. Что касается количественного содержания салицина в изученных на данный момент видах ивы, то оно варьирует по имеющимся сведениям достаточно широко: в коре – от 0,20% до 4,11%, в листьях – от 0,14% до 2,31%, в побегах – от 0,05% до 0,25% [11,21]. А.А. Петрук (2013г.) было определено содержание салицина в листьях и соцветиях некоторых видов рода Salix, произрастающих на территории Алтайского края и Новосибирской области. Содержание салицина в листьях исследованных видов находилось в пределах от 0,72% (S. alba var. vitellina) до 2,31 % (S. alba (женский экземпляр). Содержание салицина в соцветиях находилось в пределах от 1,31% в S. alba var. vitellina до 1,78 % в S.alba (женский экземпляр) [22]. Следует отметить, что в Европейской Фармакопее к фармакопейным видам ивы относят виды, содержащие в коре не менее 1,5% салицина (после щелочного гидролиза) [23]. Подобное исследование было проведено на примере коре ивы остролистной, произрастающей в Поволжье. Общее содержание салицина после щелочного гидролиза колебалось от 6,5% до 9,5% [24].
В 1926 г. из коры ивы был выделен другой фенологликозид – салидрозид, который обладает бифункциональными свойствами, т.е. проявляет себя как ингибитор или инициатор окислительных процессов. Проявление одного из свойств зависит от концентрации салидрозида в реакционной среде, так если концентрация низкая, то салидрозид выступает как ингибитор окислительных процессов, при высоких концентрациях он является инициатором [25].
Открытие в ХХ веке новых методов анализа дало возможность для изучения БАВ различных видов ивы в ведущих научных центрах мира. С помощью хроматографических и спектральных методов анализа расширено представление о гликозидном составе различных видов ивы, были обнаружены такие представители данной группы соединений как саликортин, фрагилин, салирепозид [26,27,28], тремулоидин (тремулацин) [29,30], грандидентатин, пурпуреин [31], триандрин и другие соединения [25,32,33]. Позже, триандрин и вималин по одной из классификаций были отнесены к группе фенилпропаноидов [34]. Установлено, что триандрин, имеет нейротропную активность, проявляя актопротекторное, антигипногенное, церебропротективное действие [35]. В 2014 г. в Корее было проведено исследование ветвей S. glandulosa Seemen, обнаружены 12 новых фенольных гликозидов и 13 описанных ранее. Ряд соединений проявили выраженный ингибирующий эффект на синтез окиси азота в организме человека [36].
Определение фенологликозидов
Определения элементного состава коры и побегов ивы вавилонской и гибрида проводили методом масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой на приборе масс-спектрометр ICP-MSElan 9000, производства Канада.
2,0 г мелко измельченной анализируемой пробы помещали в стеклянный стакан, приливали 20 мл концентрированной азотной кислоты, перемешивали и постепенно нагревали на электрической плитке до температуры 950С, избегая бурного кипения. При уменьшении объема пробы до 10 мл, пробу охлаждали и добавляли 2 мл водорода перекиси 33 %, затем снова нагревали пробу до состояния «влажных солей». После охлаждения к пробе добавляли 5 мл кислоты азотной концентрированной и около 20 мл бидистиллированной или деионизированной воды и выщелачивали при слабом нагревании до растворения солей, затем раствор пробы охлаждали. После охлаждения анализируемый раствор доводили бидистиллированной или деионизированной водой до объема 100 мл, фильтровали пробу в сухую посуду через фильтр «синяя лента». Параллельно с партией анализируемых проб готовили «холостую пробу», которая содержала те же реактивы и в тех же количествах, что и анализируемые пробы [134].
Содержание (массовую долю) анализируемых металлов в пробе, с учетом взятой на анализ навески исследуемых видов ивы и разведения, в мг/кг (у) рассчитывали по формуле (9): где С - массовая концентрация элемента в анализируемом растворе, найденная по градуировочному графику, мкг/см3; аx - масса навески испытуемого образца, г; V - объем анализируемого раствора, см3 .
Для определения противовоспалительного действия готовили водные суспензии измельченных до мелкодисперсного состояния коры и побегов ивы вавилонской и ее гибрида с ивой белой. Для устойчивости суспензии предварительно порошок ЛРС (900 мг) растирали с 3 каплями Твина-80. Далее порциями воды очищенной кору и побеги количественно переносили в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводили водой очищенной до метки. Крысе массой 200 г вводили 1,5 мл суспензии. При выборе дозировки исходили из дозировки капсул «Кора ивы белой – White Willow Bark» («Sunrider Manufacturing, L.P.», США), содержащих 400 мг измельченного сырья. В аннотации к ним указана суточная доза 400-800 мг [135]. Исследуемые объекты вводились в дозе 68 мг/кг, что соответствует приему человеком в сутки 800 мг порошка. Дозы используемого препарата пересчитывали на 1 кг массы тела животного так, что разовая доза, в расчете на 1 кг массы тела человека, увеличивали в 5,9 раз.
Расчет суточной дозы порошка побегов на одну крысу 800 мг порошка побегов (на человека в день) - 70 кг х - 0,2 кг х=2,29 мг 2,29 мл 5,9=13,5 мг (суточная доза на одну крысу) суточная доза в мг/кг веса крысы: 13,5 мг -5 = 67,5мг/кг (округляем до 68 мг/кг) Приготовление суспензии побегов: 900мг порошка растираем с Твином-80 в колбе вместимостью 100мл тогда в 1 мл суспензии 9мг порошка ввести надо 1,5 мл суспензии порошка
Препаратом сравнения являлся диклофенак натрия в дозе 8,5 мг/кг. Вещество также вводили в виде водной суспензии на Твине-80 в объеме 1,7 мл животному массой 200 г. Расчет суточной дозы диклофенака на одну крысу 100мг (человеку в день) - 70 кг х - 0,2 кг х=0,29мг 0,29 мг 5,9=1,7мг (суточная доза на одну крысу) Таблетки по 100 мг разведение: 1 табл. 100 мг в колбу 100 мл тогда в 1 мл раствора 1 мг и ввести надо 1,7мл
Исследование выполнено на 36 крысах-самках линии Wistar весом 200-220 г (на момент начала эксперимента). У белых крыс, находящихся под хлоралгидратным наркозом (доза 350 мг/кг), в области спины выстригалась шерсть. В асептических условиях делался разрез кожи и подкожной клетчатки. Разред длиной около 1 см делали ножницами. С помощью пинцета в подкожной клетчатке формировалась полость, и туда помещался простерилизованный ватный шарик, массой 15 мг. На рану накладывалось два шва. На восьмые сутки эксперимента извлекали имплантированный шарик с образовавшейся вокруг него грануляционной тканью. Сразу производили взвешивание, затем шарик высушивался до постоянной массы при 60-65оС.
О величине экссудативной фазы воспаления судили по разнице в массе шарика до и после высушивания, о величине пролиферативной фазы – по разнице в массе высушенного шарика с его исходной массой 15 мг. Экссудацию рассчитывали по формуле (10): m3 = m1 – m2, (10) где m3 - экссудация, г; m1 - масса ватного шарика сразу после извлечения из животного, г; m2 - масса ватного шарика после высушивания, г. Пролиферацию рассчитывали по формуле (11): m4 = m2 – 0,015, (11) где m4 - пролиферация, г; m2 - масса ватного шарика после высушивания, г.; 0,015 – исходная масса ватного шарика, г.
Изучаемые измельченные кору и побеги ивы вавилонской и гибрида, а также препарат сравнения в эквивалентном объеме вводили с помощью зонда в желудок в течение 7 дней. Контрольным животным аналогичным образом вводили физиологический раствор [136].
Для изучения ульцерогенного действия исследуемых объектов после удаления ватных гранулём испытуемых животных декапитировали под хлоралгидратным наркозом. У них извлекали желудки и рассекали их по малой кривизне. Затем желудки промывали изотоническим раствором натрия хлорида для удаления содержимого из желудка и оценивали степень влияния на слизистую оболочку желудка исследуемых веществ. Степень повреждения желудка оценивали в баллах:
Качественный моносахаридный состав полисахаридов
Разделение и идентификацию органических кислот проводят методом ТСХ с использованием ПФ имеющих разную полярность. Используются ПФ: н бутанол – муравьиная кислота – вода (5:0,5:2), н-бутанол – уксусная кислота – вода (4:1:5), этилацетат – муравьиная кислота – вода (3:1:1), этилацетат – уксусная кислота – муравьиная кислота – вода (100:11:11:25) [151,152,153,154,155].
ТСХ определение аскорбиновой кислоты можно проводить в системе этилацетат – уксусная кислота (8:2) и проявителем 0,01 моль/л раствором 2,6 – дихлорфенолиндофенолята натрия (на розовом фоне белые пятна 0,01% раствора СО аскорбиновой кислоты [130].
В некоторых видах растительного сырья количественное определение свободных органических кислот проводят алкалиметрически с визуальной индикацией конечной точки титрования [130]. Описан метод кулонометрического титрования при постоянной силе тока и метод потенциометрического титрования для определения свободных органических кислот в плодах калины, рябины обыкновенной и шиповника [156,157]
Идентификацию органических кислот и аскорбиновой кислоты проводили методом тонкослойной хроматографии, как описано в п.2.2.6. Результаты исследования представлены в таблице 16. Таблица 16 - ТСХ-определение органических кислот в исследуемых видах ивы СО кислот Rf Кора ивывавилонской,Rf Побеги ивывавилонской,Rf Кора ивыгибрида,Rf Побеги ивыгибрида,Rf D-винная 0,25 - - - лимонная 0,28 - - - сорбиновая 0.30 - - - щавелевая 0,10 0,9 0,10 0,10 0,11 DL-яблочная 0,40 0,39 0,40 0,39 0,39 D-янтарная 0,51 - - - аскорбиновая 0,35 0,34 0,35 0,34 0,35
Таким образом, на хроматограммах коры и побегов и. вавилонской и ее гибрида с ивой белой обнаружены три органические кислоты: яблочная, щавелевая и аскорбиновая [158].
Количественное определение свободных органических кислот проводили титриметрическим методом, описанным в п.2.2.6. Исследования проводили на сырье, собранном летом 2013 года. Результаты количественного определения свободных органических кислот (среднее из трех параллельных определений) представлены в таблице 17.
Побеги ивы гибрида 25,1243 2,76 2,02 Из данных таблицы 17 следует, что содержание органических кислот в побегах двух видов ивы выше, чем в коре, и составляет в побегах и. вавилонской 1,90%, а в побегах ивы гибрида 2,02%. В коре исследуемых видов ивы содержание органических кислот также практически одинаково и составляет в и. вавилонской 1,51%, в иве гибриде 1,56%.
Количественное определение аскорбиновой кислоты проводили окислительно-восстановительным титрованием с 2,6-дихлорфенолиндофенолятом натрия (реактивом Тильманса). Метод основан на редуцирующих свойствах аскорбиновой кислоты. При этом аскорбиновая кислота окисляется до дегидроаскорбиновой кислоты. 2,6-дихлорфенолиндофенол имеет разную окраску при различных значениях рН среды: интенсивный синий цвет в щелочной среде и бледно-красный в кислой среде [159]. Результаты количественного содержания аскорбиновой кислоты (среднее из трех параллельных определений) в коре и побегах и. вавилонской и ее гибрида с ивой белой, собранных летом 2013 года, представлены в таблице 18.
Как следует из результатов таблицы 18, в коре исследуемых видов ивы содержание аскорбиновой кислоты незначительно превышает содержание в побегах и составляет в коре и. вавилонской 54,65 мг/%, в коре ивы гибрида – 67,34 мг/%, в побегах и. вавилонской – 41,57 мг/% и ее гибрида – 32,10 мг/%.
Таким образом, в коре и побегах и. вавилонской и ее гибриде с ивой белой идентифицированы органические кислоты и аскорбиновая кислота и определено их количественное содержание.
Различные химические процессы, проходящие в организме человека, сопровождаются окислительными реакциями, которые под влиянием вредных факторов окружающей среды увеличивают концентрацию свободных радикалов, нарушая тем самым процессы обмена веществ и энергии. Чтобы защититься от такого воздействия окружающей среды, в организме вырабатывается собственная антиоксидантная система борьбы с излишним количеством свободных радикалов, но она ослабляется и нуждается в активной поддержке [160].
В связи с этим актуальной задачей является выявление среди растений, произрастающих на территории России, таких лекарственных видов, которые бы удовлетворяли потребность организма в природных антиоксидантах, тем самым предохраняя его от развития целого ряда заболеваний.
Сущность амперометрического метода измерения массовой концентрации антиоксидантов заключается в измерении силы электрического тока, возникающего при окислении молекул антиоксиданта на поверхности рабочего электрода при определенном потенциале, который после усиления преобразуется в цифровой сигнал. Величина возникающей при этом силы электрического тока, будет зависеть как от природы и концентрации анализируемых веществ, так и от типа материала рабочего электрода и потенциала, приложенного к электроду [161].
Исследование суммарного содержания антиоксидантов в водном извлечении проводили методом амперометрического титрования на приборе «Цвет Яуза-01-АА» на кафедре органической химии Пятигорского медико-фармацевтического института – филиала ВолгГМУ при участии аспирантов кафедры О.С. Евсеевой и С.Л. Пеливановой [133].
Суммарное содержание антиоксидантов в водных извлечениях определяли исходя из площадей пиков дифференциальных кривых соответствующих извлечений по методике, указанной в п.2.2.8. Определение содержания водорастворимых антиоксидантов производили на сырье, собранном летом 2013 года [162]. Площади пиков, а также концентрации антиоксидантов в пересчете на галловую кислоту и кверцетин [163] представлены в таблице 19.
Объект Площадьпика (Sп нА/с) Кратностьразбавления,N Содержаниеантиоксидантов(в пересчете нагалловуюкислотумг/г) Содержаниеантиоксидантов(в пересчете накверцетинмг/г) Кора ивы вавилонской 2296 50 5,72±0,32 9,70±0,55 Побеги ивы вавилонской 1496 25 1,74±0,20 3,12±0,35 Кора ивы гибрида 1458 50 3,24±0,18 5,98±0,34 Побеги ивы гибрида 1669 25 1,87±0,21 3,49±0,39 Проведенные исследования показали, что суммарное содержание водорастворимых антиоксидантов в объектах исследования в пересчете на галловую кислоту составило от 1,7 мг/г до 5,7 мг/г, суммарное содержание водорастворимых антиоксидантов в пересчете на кверцетин составило от 3,1 мг/г до 9,7 мг/г. В целом суммарное содержание водорастворимых антиоксидантов выше в коре изучаемых видов ивы, чем в побегах.
Динамика накопления фенологликозидов
Одним из ключевых разделов ФС на ЛРС является подтверждение его подлинности. Ранее проведено анатомическое изучение ряда ив, произрастающих на Северном Кавказе и Поволжье. Так описано комплексное сравнительное анатомо-морфологическое исследование ЛРС представителей семейства Salicaceae L. (коры ивы прутовидной и ивы остролистной, почек представителей рода Тополь), в результате которого получены цифровые фотографии и выявлены диагностические признаки, для включения в современные разделы соответствующей НД [54]. Опубликованы материалы по морфолого-анатомическому изучению коры и побегов ивы белой, ивы трехтычинковой и ивы пурпурной [181,182] Имеются данные по анатомическому описанию коры ивы вавилонской, произрастающей в Турции [183].
С целью выявления диагностических морфолого-анатомических признаков использовали образцы цельного и измельченного сырья коры и побегов и. вавилонской и ее гибрида с ивой белой, собранных в Ставропольском крае, в окрестностях г. Пятигорска, (район реки Подкумок, парковые зоны) в июне 2013г.
Цельное сырье. Куски коры желобоватые, трубчатые или узкие полоски различной длинны, которые имеют толщину до 1мм и ширину до 10 мм (рис. 8). Наружная поверхность коры слегка морщинистая или гладкая, матовая, реже слегка блестящая. Иногда с продольными морщинками. Имеются чечевички округлой формы. У гибрида диагностируются коричневые пигментные пятна (0,2-0,3 см). Внутренняя поверхность коры гибрида гладкая, а у ивы вавилонской имеется продольные тонкие ребрышки. В изломе кора мелковолокнистая, светлая. Наружная поверхность коры имеет цвет серый или серовато-коричневый, иногда с зеленоватым или желтоватым оттенком. Внутренняя поверхность - бледно-желтая, иногда с зеленоватым оттенком, при хранении она темнеет, становится коричневой (у гибрида при хранении коричневая окраска появляется в виде полос). Сырье имеет слабый своеобразный запах, усиливающийся при смачивании его водой. Вкус водного извлечения горький, вяжущий.
Анатомическое исследование коры
На поперечном срезе (рис. 9) под микроскопом видны в наружной коре клетки оранжево-коричневого цвета, 3-5 слоев, местами они прерываются разрушенными чечевичками. Далее располагается 5-10 слоев клеток светло-зеленого цвета - пластинчатая колленхима. В пластинчатой колленхиме встречаются обособленные овальные скопления клеток (группы лубяных волокон), которые имеют сильно утолщенные стенки. В качестве отличительного признака следует отметить, что у ивы вавилонской на границе первичной и внутренней коры имеются воздухоносные полости (рис. 10).
Во внутренней коре, между группами толстостенных одревесневших лубяных волокон, диагностированы однорядные сердцевинные лучи с темным содержимым. Лубяные волокна образуют концентрический пояс (у и. вавилонской они оранжево-желтого цвета, у гибрида темноокрашенные). Ближе к внутреннему краю коры располагаются крупные клетки (концентрический слой), соединенные между собой и образующие сплошную волнистую линию с сильно утолщенными стенками. Клетки паренхимы имеют овальную форму, некоторые из них имеют темно-коричневые включения – флобафены (рис. 9).
Одиночно встречающиеся кристаллы кальция оксалата имеют более крупный размер, а группы кристаллов, образующие цепочки – меньших размеров. Характерные формы кристаллов – друзы и мелкие призматические кристаллы (рис. 13А,Б). Между лубяных волокон можно обнаружить фрагменты ксилемы.
Цельное сырье. Олиственные ветви длиной 15-50 см у ивы вавилонской и 15-30 см у ее гибрида, диаметром 2-5 мм (до 5 мм) (рис. 14). Наружная поверхность коры ветвей более или менее гладкая, слегка блестящая с продольными морщинками (кора побегов и. вавилонской имеет светло-зеленый с желтоватым оттенком цвет, у гибрида цвет светло-коричневый с зеленоватым или желтоватым оттенком). Листья простые, ланцетной или линейно-ланцетной формы с клиновидным основанием и заостренной верхушкой. Край листа мелкопильчатый, жилкование сетчатое (у гибрида сильно выражена опушенность на верхушечных листьях, они покрыты светлыми прижатыми волосками, особенно с нижней стороны). Лист длиной 9-16 см, шириной – 0,5-1,5 см. Черешок ладьевидной формы длиной до 7 мм имеет гладкую или немного ребристую поверхностью. На границе листа и черешка присутствуют ладьевидные чешуйки, цельнокрайные, зеленовато-желтого цвета, размер до 5 мм (у гибрида имеется одна пара гроздьевидных выростов). Цвет листьев – сверху зеленый, с нижней стороны серо-зеленый, у гибрида верхушечные листья с серебристо-белым оттенком за счет опушения. Водное извлечение имеет горьковатый, вяжущий вкус. Запах сырья слабый, своеобразный.
Анатомические исследования. Побеги исследуемых видов ивы имеют характерное строение стебля для древесных двудольных растений. Общая схема поперечного среза побега исследуемых видов ивы представлена на рисунке 15. Для диагностики механических элементов побега поперечные срезы обрабатывали флороглюцином и серной кислотой концентрированной. Также, как и в иве белой, у исследуемых видов ивы выделяют три блока тканей: покровная ткань, кора, центральный цилиндр. Верхний слой - это перидерма. Ниже, расположен слой уголковой колленхимы, в котором располагаются воздухоносные полости и закрытые коллатеральные сосудисто-волокнистые пучки. В первичной коре наблюдается механический пояс, образованный группами лубяных волокон. Клетки феллемы имеют овально-округлую форму, плотно прилегая друг к другу. Эндодерма имеет четкую линию, у гибрида наблюдается утолщение стенок.