Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Невидимые механические включения – базовый показатель в оценке качества
лекарственных препаратов для парентерального применения 11
1.2. Анализ материалов отечественной и зарубежных фармакопей и нормативной документации, регламентирующих качество ЛП для парентерального применения по показателю «Невидимые механические включения в лекарственных формах для парентерального применения» 19
1.3. Методические подходы к определению невидимых механических частиц
1.3.1. Счетно-фотометрический метод (светоблокировки) 23
1.3.2. Метод световой микроскопии 25
1.3.3. Метод электрочувствительных зон 25
1.4. Характеристика частиц 30
1.4.1. Свойства частиц 30
1.4.2. Размер частиц 31
1.5. Методы определения концентрации микробных клеток для микробиологического анализа 38
1.6. Размер жировых капель в эмульсиях для парентерального применения и методы их определения 41
1.7. Выводы по обзору литературы 44
Собственные исследования 45
Глава 2. Материалы и методы 45
Глава 3. Сравнительное изучение инструментальных методов определения невидимых механических включений в лекарственных препаратах 53
3.1. Оценка применимости метода электрочувствительных зон для фармацевтического анализа 56
3.2. Экспериментальная оценка методов определения невидимых частиц в различных лекарственных формах для парентерального применения 64
3.2.1. Растворы 64
3.2.2. Лиофилизаты 68
3.3. Сравнительная оценка методов определения невидимых частиц в окрашенных препаратах для парентерального применения 71
Глава 4. Применение метода электрочувствительных зон при оценке качества лекарственных средств по показателю «невидимые механические включения» и обоснование методических подходов к проведению анализа некоторых препаратов, требующих нестандартных условий 82
Глава 5. Оценка размера и количества жировых капель в эмульсиях для парентерального применения методом электрочувствительных зон 87
Глава 6. Применение метода электрочувствительных зон для измерения размера частиц материала отраслевого стандартного образца мутности бактериальных взвесей и определения концентрации микробных клеток 99
6.1 Отраслевой стандартный образец мутности бактериальных взвесей 99
6.2 Концентрация микробных клеток 103
Обсуждение результатов 111
- Анализ материалов отечественной и зарубежных фармакопей и нормативной документации, регламентирующих качество ЛП для парентерального применения по показателю «Невидимые механические включения в лекарственных формах для парентерального применения»
- Методы определения концентрации микробных клеток для микробиологического анализа
- Экспериментальная оценка методов определения невидимых частиц в различных лекарственных формах для парентерального применения
- Применение метода электрочувствительных зон для измерения размера частиц материала отраслевого стандартного образца мутности бактериальных взвесей и определения концентрации микробных клеток
Введение к работе
Актуальность и степень разработанности темы. Одной из актуальных задач фармацевтической науки и практики является разработка, апробация и внедрение новых методов в систему контроля качества лекарственных средств (ЛС) (Приказ №916 Минпромторг РФ от 10.09.2013 «Об утверждении Правил организации производства и контроля качества лекарственных средств»).
Перспективным направлением является использование метода
электрочувствительных зон, основанного на регистрации частиц любого дисперсного материала при прохождении через чувствительную апертуру счетчика частиц. В настоящее время этот метод применяется в различных областях науки и производства: в медицине, биотехнологии, биологии, пищевой, химической, электронной промышленности и др.
Представляется актуальным расширение области применения данного
метода, в частности, для целей фармацевтического анализа, например, для
оценки качества и безопасности лекарственных препаратов (ЛП) для
парентерального применения по показателям «Невидимые механические
включения» и «Размер частиц». Согласно утвержденным нормативным
документам (НД) в настоящее время указанные виды испытания осуществляют
инструментальными методами: счетно-фотометрическим или
микроскопическим (ГФ XI изд.; EP 8,0; USP 38). Однако для ряда препаратов их применение невозможно или сопряжено с существенными методическими сложностями, в связи с чем большое значение имеет расширение арсенала методов испытания качества ЛС.
Важную роль играет не только анализ качества готового
фармацевтического продукта, но и материалов, используемых для его разработки и оценки, например, отраслевого стандартного образца мутности (ОСО) бактериальных взвесей, тест-штаммов микроорганизмов и др. В настоящее время применяемые для этих целей методы требуют доработки и
совершенствования для повышения их информативности, точности и скорости выполнения анализа.
Все изложенное выше позволяет сделать вывод о необходимости включения метода электрочувствительных зон в систему фармацевтического анализа.
Цель. Расширение области применения метода электрочувствительных зон в фармацевтическом анализе.
Задачи исследования:
-
Провести сравнительный анализ действующей НД, регламентирующей требования и описывающей методы оценки качества различных ЛП по показателям «Невидимые механические включения» и «Размер частиц» для эмульсий.
-
Оценить метрологические характеристики фармакопейных методов определения невидимых частиц и метода электрочувствительных зон и провести их анализ.
-
Обосновать возможность применения метода электрочувствительных зон для определения размера и количества жировых капель в эмульсиях для парентерального применения.
-
Оценить возможность применения метода электрочувствительных зон для стандартизации материала ОСО мутности бактериальных взвесей и определения концентрации клеток микроорганизмов.
-
Разработать проекты общих фармакопейных статей (ОФС) «Невидимые механические включения в лекарственных формах для парентерального применения», «Определение концентрации микробных клеток» и Методические рекомендации по контролю невидимых механических включений в лекарственных формах для парентерального применения.
Научная новизна работы. На основании проведенной валидации доказана возможность использования метода электрочувствительных зон в фармацевтическом анализе, и определены основные области его применения.
Впервые проведено комплексное изучение методов оценки невидимых механических включений (НМВ) в различных препаратах для парентерального применения. Разработана методика испытания окрашенных ЛП методом электрочувствительных зон, что было оформлено заявкой на изобретение.
Теоретически и экспериментально обоснованы методические подходы к определению количеств и размеров жировых капель в эмульсиях для парентерального применения. Главными составляющими указанных подходов являются выбор метода и оптимальных условий анализа, обеспечивающих получение достоверных результатов с требуемым уровнем точности.
Данные, полученные в результате экспериментального исследования, позволили разработать оптимальный подход для стандартизации материала ( о каком идет речь) ОСО мутности бактериальных взвесей и наиболее полного определения его дисперсного состава, а также показать целесообразность использования метода электрочувствительных зон.
Впервые экспериментально оценены метрологические характеристики метода электрочувствительных зон при определении концентрации клеток микроорганизмов, отличающихся по форме и размеру, и показана возможность его применения в фармацевтическом анализе.
Теоретическая и практическая значимость работы. Впервые показана возможность:
определения НМВ в окрашенных ЛП для парентерального применения,
оценки размеров и количества жировых капель в парентеральных ЛП в виде эмульсий,
анализа дисперсного состава материала ОСО мутности бактериальных взвесей,
определения концентрации клеток микроорганизмов в суспензиях при микробиологических исследованиях.
Теоретическая и практическая значимость полученных результатов состоит в расширении области применения метода электрочувствительных зон в фармацевтическом анализе. Материалы работы реализованы разработкой:
- проектов ОФС «Невидимые механические включения в лекарственных
формах для парентерального применения» и «Определение концентрации
микробных клеток»;
- Методических Рекомендаций по контролю невидимых механических
включений в лекарственных формах для парентерального применения, о чем
свидетельствует акт внедрения от 13 мая 2015 г.
Поданы 2 заявки на изобретения в ФИПС:
регистрационный №2015120470 от 29.05.2015 «Применение способа электрочувствительных зон для определения невидимых механических включений в окрашенных лекарственных средствах»,
регистрационный № 2015120469 от 29.05.2015 «Применение способа электрочувствительных зон для определения количеств и размеров жировых капель в лекарственных препаратах для парентерального применения».
Методология и методы исследования. Исследовательские работы проводились в период с 2006 по 2015 гг. Основными объектами исследования являлись лекарственные препараты для парентерального применения различных лекарственных форм (ЛФ), суспензии микроорганизмов, отраслевые стандартные образцы для бактериальных взвесей. Методологическую основу диссертационного исследования составляют работы отечественных и зарубежных ученых, посвященных определению частиц в различных дисперсиях.
Степень достоверности результатов исследования и апробация работы. Научные положения, выводы и рекомендации основаны на достаточном количестве экспериментальных исследований со статистической обработкой результатов с помощью программ «Microsoft Excel 2010» и «Statistica 8.0».
Достоверность первичных материалов подтверждена их экспертной оценкой и не вызывает сомнений. Научные положения, полученные выводы и практические рекомендации достаточно обоснованы и логически вытекают из полученных данных.
Результаты и основные положения диссертационного исследования доложены и обсуждены на второй конференции молодых ученых ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России «Научные подходы к повышению качества экспертизы лекарственных средств: реалии и перспективы» в 2013г., на третьей конференции молодых ученых ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России «Приоритетные направления развития экспертной деятельности в области обращения лекарственных средств» в 2014 г., на XVI и XХ Российских Национальных Конгрессах «Человек и лекарство» в Москве в 2009 и 2013г., на Российской научно-практической конференции, посвященной 75-летию ПГФА «Актуальные проблемы науки фармацевтических и медицинских вузов: от разработки до коммерциализации» в Перми в 2013 г.; на IX международной заочной научно-практической конференции «Научная дискуссия: вопросы медицины» в Москве в 2013 г., а также на второй европейской конференции по биологическим и медицинским наукам в Вене в 2014 г.
Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических
наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планами научно-
исследовательских работ ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России и
Государственным заданием на 2012-2014 гг по теме «Научное обоснование
методических подходов к экспертной оценке фармакопейных показателей и
методов контроля качества лекарственных средств» (регистрационный номер
01201275290); на 2015-2017 гг по теме «Разработка гармонизированных с
международными нормами и подходами научных и технических руководств в
сфере обращения лекарственных средств, в том числе по разработке и
исследованиям лекарственных средств».
Соответствие диссертации паспорту научной специальности.
Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.04.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия конкретно пункту 2 – формулирование и развитие принципов стандартизации и установление нормативов качества, обеспечивающих терапевтическую активность и безопасность лекарственных средств и пункту 3 – разработка новых,
совершенствование, унификация и валидация существующих методов контроля качества лекарственных средств на этапах их разработки, производства и потребления.
Личное участие автора в получении научных результатов. Автору принадлежит основная роль в определении цели и постановке задач, и выборе объектов исследования, проведении экспериментальных исследований, теоретических изысканий, обобщении полученных результатов, а также их статистической обработке, представлении материалов диссертационной работы в виде докладов, публикаций, проектов ОФС, методических указаний.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 научных работ, из них 4 - в изданиях, входящих в «Перечень российских рецензируемых научных журналов и изданий…» ВАК Минобрнауки России.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Валидированный и адаптированный для целей фармацевтического анализа метод электрочувствительных зон, позволяющий определять НМВ в различных ЛФ.
-
Методика определения размера и количества жировых капель в эмульсиях для парентерального применения, отличающаяся быстротой и точностью выполнения.
-
Результаты определения количества и размера клеток микроорганизмов различных видов в бактериальных взвесях.
-
Результаты анализа дисперсного состава ОСО мутности бактериальных взвесей методом электрочувствительных зон.
Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 139 страницах компьютерного текста, содержит 34 таблицы, 24 рисунка, включает введение, обзор литературы (глава 1), экспериментальные исследования (главы 2-6), список цитируемой литературы, содержащий 155 отечественных и зарубежных библиографических источников, приложение.
Анализ материалов отечественной и зарубежных фармакопей и нормативной документации, регламентирующих качество ЛП для парентерального применения по показателю «Невидимые механические включения в лекарственных формах для парентерального применения»
Среди представленных на рынке ЛФ на долю парентеральных ЛС приходится около 30 %. Это связано с преимуществами парентерального пути введения в организм ЛС: быстрое действие и 100 % биологическая доступность лекарственного вещества, необходимые для лечения неотложных состояний, возможность введения лекарственного вещества больному, находящемуся в бессознательном состоянии, или когда пероральный прием оказывается невозможным, отсутствие воздействия пищеварительных ферментов, что имеет место при пероральном приеме лекарств, отсутствие необходимости коррекции вкуса и запаха лекарственной формы.
К параметрам безопасности и одним из обязательных требований к качеству ЛС для парентерального применения помимо стерильности, бактериальных эндотоксинов, подлинности и других показателей, относится допустимое содержание МВ. В ЛС для парентерального применения МВ называют посторонние подвижные нерастворимые частицы, за исключением пузырьков газа, случайно присутствующих в растворах ЛП [12]. Невидимыми принято считать частицы размером менее 50 мкм, а видимыми – свыше 50 мкм [13].
К ЛФ для парентерального применения, в которых необходимо определять НМВ, относятся: – растворы (концентраты); – порошки и лиофилизаты (в том числе «лиофилизированные порошки»); – эмульсии [14, 7].
Вероятными источниками МВ в ЛП могут быть субстанции, вспомогательные вещества, технологическое оборудование, материалы первичной упаковки (стекло, пластик, резина), воздух производственных помещений, персонал.
МВ могут попадать в готовый продукт на любой стадии производственного процесса. Даже при производстве парентеральных ЛС в условиях GMP не удается полностью исключить контаминацию МВ [15,16].
Попадая в организм больного парентеральным путем, частицы могут вызывать нежелательные реакции, выражающиеся в патологических изменениях структуры тканей внутренних органов, результаты которых зависят от химического состава включений, их размеров, формы и локализации, индивидуальных реакций и общего состояния пациента.
Особенно опасно попадание МВ в кровяное русло, откуда они могут проникнуть в легочную артерию, разветвляющуюся на множество капилляров. По данным Borchert с соавторами [17] именно невидимые частицы, особенно при их избыточном количестве, могут забивать капилляры кровеносных сосудов, размер просвета которых, в среднем, составляет 7-12 мкм, тем самым вызывая гранулемы и тромбозы.
Избыточное содержание МВ в парентеральных ЛП может вызывать различные поражения органов и тканей: тромбы, флебиты, эмболии, гранулемы, аллергические реакции и другие патологические явления [18]. Были отмечены также патологические изменения в органах, таких как легкие, почки, печень и селезенка [19].
Существует также риск загрязнения ЛС частицами стекла, которые могут попадать в раствор при вскрытии ампул [15].
Рисунок 1 демонстрирует вскрытие ампулы и появление различных осколков. Рисунок 1 – Вскрытие ампул с раствором ЛС [20].
При отборе раствора из ампулы или флакона с помощью иглы диаметром свыше 0,8 мм существует возможность попадания таких частиц в шприц и введения загрязненного раствора в организм больного.
Инфузии растворов, содержащих частицы стекла, могут приводить к возникновению узелкового фиброза печени, селезенки и тонкого кишечника – как реакции на попадание инородного тела [21]. Фрагменты осколков стекла в препаратах могут индуцировать нарушение микроциркуляции в сосудах легких с последующим повреждением стенок альвеол, вызывая, так называемый, респираторный дистресс-синдром [19]. В этой работе описаны также случаи возникновения гранулемы легких у недоношенных новорожденных детей при введении им препаратов, загрязненных фрагментами осколков стекла.
Preston с соавторами [22] обнаружили наличие частиц стекла размером более 130 мкм в 57 % проконтролированных растворов для инъекций. Кроме того, Lye [21] в 500 исследованных ампул различных препаратов выявил наличие, в среднем, 0,22 частицы стекла на ампулу. Введение таких растворов больным представляет определенную опасность возникновения нежелательных реакций. Возрастание риска таких реакций отмечено при введении ЛП, загрязненных МВ, больным, имеющим патологические изменения внутренних органов. В работе Lehr с соавторами [23] приводит данные о том, что частицы размером всего 1,5 мкм могут вызывать закупорку мелких капилляров у пациентов с хроническими заболеваниями внутренних органов, так как попадание частиц может обострять нарушение микроциркуляции крови в поврежденном органе. В своей работе исследователи обращают внимание на то, что частицы размером более 6 мкм могут вызывать закупорку капилляров даже у здоровых людей. Появление флебитов, сопровождающихся локальным повышением температуры, болью, отеком и покраснением в месте введения препарата, загрязненного частицами стекла, отмечается в работе Grunewald с соавторами [24].
Частицы пластика или силикона могут попадать в инфузионные растворы при прокалывании иглой пробок, закрывающих их. Загрязнение вводимых растворов частицами силикона может приводить к гранулематозным заболеваниям легких [25]. Другие авторы [26] отмечали осложнения в виде легочных заболеваний при попадании частиц в легочные капилляры, и, кроме того, возникновение миокардитов [27]. Следует указать, что в литературе недостаточно данных об отдаленных последствиях введения растворов, загрязненных различными частицами, в частности, силикона. В ряде экспериментальных исследований при введении животным растворов, загрязненных частицами силикона, показано наличие изменений в мозге [28] и легких [29, 30]. При попадании в организм с вводимыми растворами частиц резины отмечали возникновение таких патологических изменений, как бессимптомно протекающие легочные гранулемы и микроинфаркты. Частицы пластика или резины, также как и частицы стекла, попавшие в кровяное русло, могут стать причиной повреждений легких, почек и селезенки [31].
Методы определения концентрации микробных клеток для микробиологического анализа
Диапазон измеряемых размеров изучаемых частиц достаточно широк (от 1,3 мкм до 600 мкм). Принцип действия используемого прибора описан в литературном обзоре (стр. 23). В состав счетчика частиц, основанного на методе светоблокировки, входят: - шприцевой пробоотборник, который обеспечивает необходимую скорость прохождения жидкости через датчик и контролирует начало и конец подсчета частиц в заданном объеме жидкости, - датчик с электронным счетным устройством, которое по калибровочной кривой соотносит высоту импульсов сигнала с размером частиц и учитывает их в нужном канале, - компьютер для обработки и хранения результатов измерений и пользовательский интерфейс для ввода параметров и индикации хода измерений. При проведении настоящих исследований использовали счетчик частиц в жидкости НIАС 9703, производства «НАСН СОМРАNУ» США, предназначенный для измерения концентрации частиц в водных суспензиях.
Перед проведением исследований методом светоблокировки прибор калибровали с помощью эталонных стандартов латексных частиц N.I.S.T. (National Institute of Standarts and Technology) размером 5 мкм и проверка пригодности условий анализа. Сначала оборудование промывали водой, свободной от частиц, в количестве 150-200 мл, проводили «холостой» опыт для контроля чистоты рабочей зоны, используемой химической посуды и растворителя. Анализировали 4 пробы объемом 10 мл каждая, результат первой пробы отбрасывали. Условия проведения анализа считали удовлетворительными, если в каждой из 3-х проб содержалось не более 2 частиц размером 25 мкм и более. 2. Метод световой микроскопии
Микроскопический анализ позволяет определять размеры частиц, давая важные сведения об их форме, структуре и характеристике поверхности, а также об оптических свойствах, например, о прозрачности и цвете; дает возможность провести измерения, подсчет и идентификацию частиц на одном и том же фильтре. Принцип действия используемого прибора описан в литературном обзоре (стр. 25). Для подсчета частиц с помощью метода микроскопии использовали бинокулярный микроскоп BX41, производства Olympus Corporation, Япония, оснащенный окулярным микрометром. Для дополнительного освещения в режиме отраженного света применяли осветитель KL 1500 LCD, производства Schott AG, Германия. Для удерживания МВ используют фильтрационную систему производства «Sartorius», Германия, включающую колбу для фильтрации, держателя фильтра; вакуумного насоса; нитратцеллюлозные фильтры фирмы «Millipore», Германия, с диаметром пор 0,45 мкм с нанесенной разметкой. Для работы необходима чистая стеклянная посуда: стаканы для отбора проб; пипетки одноразовые объемом 1, 2, 10 мл, стерильные; цилиндры объемом 50 и 100 мл; предметные стекла.
Перед проведением исследований методом микроскопии выполняли проверку пригодности условий испытания. Для этого стеклянную посуду, фильтровальное оборудование (за исключением мембранных фильтров) и пинцет, тщательно промывали теплым раствором детергента и споласкивали большим объемом воды для удаления следов поверхностно-активного вещества. Непосредственно перед использованием повторяли промывание снаружи и внутри водой, свободной от частиц. Фильтр помещали в фильтродержатель и аккуратно устанавливали воронку, не касаясь поверхности мембраны, перед применением промывали мембрану профильтрованной, очищенной водой. Далее проводили «холостой» опыт для контроля качества подготовки мембраны, воронки и воды очищенной. Для этого в воронку фильтродержателя наливали около 50 мл воды очищенной, профильтрованной через мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм. Отфильтровывали воду под вакуумом. Мембранный фильтр помещали в чашку Петри и подсушивали.
Подсчет частиц в контрольной пробе воды и определение их размеров проводили по всей поверхности мембраны, перемещая ее слева направо и сверху вниз под объективом микроскопа. Под размером частиц подразумевали максимальный диаметр частиц или максимальный линейный размер. Условия проведения анализа считали удовлетворительными, если при этом обнаруживали не более 5 частиц размером более 25 мкм. В противном случае повторяли операции подготовки принадлежностей и воды очищенной до получения соответствующего результата.
Стеклянную химическую посуду, необходимую для проведения исследований (цилиндр вместимостью 100 мл и стакан для отбора проб вместимостью 250 мл) готовили следующим образом: мыли теплой водой с моющим средством «Прогресс», затем последовательно ополаскивали несколько раз теплой проточной водой, водой очищенной и профильтрованной водой очищенной.
При определении размера и количества невидимых частиц, клеток микроорганизмов, материала ОСО, а также жировых капель данным методом использовали счетчик частиц Coulter Counter MultisizerTM - 3, производства Beckman Coulter, США. Счетчик частиц представляет собой установку, содержащую стеклянную апертурную трубку (с отверстием определенного диаметра), систему анализа жидкостей, включающую насос и измерительный прибор, и элементы для управления апертурным током. Принцип действия используемого прибора описан в литературном обзоре (стр. 26).
Обычно измерение с помощью счетчика Култера занимает менее минуты, так как при подсчете и определении размера частиц возможны скорости до 10000 частиц в секунду, что является одной из основных отличительных особенностей рассматриваемого прибора. Другая важная характеристика - широкий диапазон измерения. Размеры апертур находятся в интервале от 20 до 2000 мкм. Каждая апертура может быть использована для измерения частиц в диапазоне от 2 % до 60 % своего номинального диаметра, что позволяет измерять частицы размером от 0,4 мкм до 1200 мкм, что достигается использованием апертур диаметрами 20, 50 и 100 мкм.
Перед проведением исследований методом электрочувствительных зон выполняли проверку пригодности условий анализа: измеряли количество МВ более 10 мкм в трех пробах растворителя Изотон II. Результаты проверки пригодности условий считали удовлетворительными, если в трех пробах общее количество частиц размером более 10 мкм не превышало 60.
Подготовку образцов для исследований проводили в шкафу с ламинарным потоком воздуха II класса, производства фирмы «Jouan», Франция, в условиях, ограничивающих попадание механических загрязнений.
Экспериментальная оценка методов определения невидимых частиц в различных лекарственных формах для парентерального применения
Для изучения и выявления факторов, влияющих на результаты экспериментов, был проведен дисперсионный анализ, предназначенный для проверки значимости отдельных факторов (метод испытания, образец, оператор). Обработку результатов эксперимента проводили с помощью программного обеспечения Minitab 17.1.0 по алгоритму, предложенному D.S. Paulson [150], определяя степень свободы (DF), критерий Фишера (F) и вероятность (P), которая является наиболее информативной статистической величиной при изучении данных дисперсионного анализа. Влияние фактора считали существенным в случаях Fвыч Fтабл. и P 0,001. Результаты представлены в таблице 23.
Образец 10 2 113,87 Fтабл. (0,05; 2; 59)=3,23 0,001 2 56,70 Метод 10 2 0,60 Fтабл. (0,05; 2; 59)=3,23 0,05 2 1,49 Оператор 10 1 18,24 Fтабл. (0,05; 1; 59)=4,08 0,001 1 19,72 По полученным данным приведенных в таблицы 23 видно, что существенное влияние на неопределенность результата оказывают человеческий фактор и особенности образца, при этом используемый метод не влияет на правильность получаемых результатов..
На рисунке 8 представлено процентное соотношение изученных ЛФ: растворов и концентратов (инфузионных, внутримышечных, внутривенных, подкожных, внутриполостных) – 2252 серии (69,3 %); лиофилизатов и порошков (для приготовления растворов для инъекций и инфузий) – 949 серий (29,2 %); эмульсий для парентерального применения (для анестезии и парентерального питания) – 49 серий (1,5 %);
Оценка качества некоторых ЛС по показателю НМВ представляет определенные трудности. В некоторых случаях, например, когда испытуемый препарат представляет собой окрашенный раствор или суспензию, анализ методом светоблокировки не представляется возможным, а с помощью световой микроскопии – затруднен, длителен, носит субъективный характер. При этом методом электрочувствительных зон удается достаточно быстро, надежно и достоверно провести оценку содержания НМВ в окрашенных ЛП, так как на получаемые результаты не влияют цвет частиц, показатель преломления частицы или жидкости.
В таблице 24 представлены примеры ЛП, требующие особого подхода при приготовлении образца для измерения НМВ методом электрочувствительных зон. Таблица 24 – Особенности испытания препаратов, требующих доработки методики при определении НМВ
Увеличение времени растворения Пиперациллин натрия, тазобактам натрия (8:1), полуфабрикат порошок;Джевтана, концентрат для приготовления раствора для инфузий 10 мг/мл Увеличение количества растворителя (разбавителя), в некоторых случаях до 100 мл и более. Таксол, концентрат для приготовления раствора для инфузий;Абитаксел, концентрат для приготовления раствора для инфузий 6 мг/мл Изменение концентрации растворителя (например, 4 % раствора натрия хлорида) Ондансетрон, раствор для внутривенного и внутримышечного введения 2 мг/мл Смена растворителя (например, использование воды) Амписид, порошок для приготовления раствора для внутривенного и внутримышечного введения Добавление в растворитель реагента Хумалог Микс 50, суспензия для подкожного введения 100 МЕ/мл; Андрокур Депо, раствор для внутримышечного введения (масляный) 100 мг/мл
В рамках экспериментов по подбору условий пробоподготовки препаратов, требующих нестандартных подходов, был проведен анализ более 728 серий различных порошков и лиофилизатов для приготовления растворов для инъекций, испытание которых сопряжено с дополнительной пробоподготовкой. В первую очередь это связано с растворением или разбавлением образца. Главная задача пробоподготовки перед анализом ЛС методом электрочувствительных зон – получить электропроводный раствор (суспензию) в условиях, ограничивающих загрязнение препарата НМВ. Именно для этого был использован в качестве растворителя Изотон II («0,9 % раствор натрия хлорида, свободный от частиц»), так и некоторые его модификации в виде раствора натрия хлорида с повышенной концентрацией последнего или дополнительное введение других реактивов.
К ЛС, требующим нестандартных условий пробоподготовки перед испытанием, следует отнести препараты, образующие с 0,9 % раствором натрия хлорида осадки. Среди них:
Были проанализированы более 30 серий подобных препаратов методом электрочувствительных зон, исключая при этом разведение испытуемого образца.
Если препарат не обладал электропроводностью и испытание на приборе выполнить было невозможно, в качестве растворителя использовали раствор натрия хлорида 4 %. Этот же раствор применяли и для предварительного промывания апертуры вместо раствора натрия хлорида 0,9 %.
Например, Ондансетрон раствор для внутривенного и внутримышечного введения 2 мг/мл испытывался без разведения, а для повышения его электропроводности добавляли 4 % раствор натрия хлорида в количестве 1 – 2 мл.
Во избежание образования осадков при контроле некоторых лиофилизатов, порошков, растворов и концентратов, в качестве растворителя использовали воду, свободную от частиц. Например: Амписид, порошок для приготовления раствора для внутривенного и внутримышечного введения растворяли в воде для инъекций, чтобы избежать появление осадка.
Особое внимание в нашей работе было уделено препаратам инсулинов в виде растворов и суспензий, причем исследованное количество этих лекарственных средств составляет 3,5 % от числа всех исследованных образцов. Препараты инсулинов, как правило, образуют осадки с раствором натрия хлорида 0,9 %, что приводит к невозможности определить НМВ. Нами предложено перед испытанием смешивать содержимое емкостей с 0,2 % раствором аскорбиновой кислоты в соотношении не менее 1:2. Полученный раствор далее можно использовать для измерения содержания частиц стандартным способом.
Нестандартными препаратами с точки зрения определения НМВ являются образцы в виде масляных растворов, например, Андрокур Депо, раствор для внутримышечного введения (масляный) 100 мг/мл, для которых был подобран разбавитель–электролит: 2% раствор аммония тиоцианата в изопропаноле. В этом электролите растворяли исследуемый образец в соотношении не менее 1:80. Перед измерением промывали апертуру тем же электролитом.
Таким образом, в ходе экспериментов были подобраны необходимые условия пробоподготовки для различных групп ЛС, требующих нестандартных подходов при определении НМВ методом электрочувствительных зон, что позволяет оценить качество указанных препаратов по показателю «Невидимые механические включения».
Применение метода электрочувствительных зон для измерения размера частиц материала отраслевого стандартного образца мутности бактериальных взвесей и определения концентрации микробных клеток
Для подтверждения правильности определения количества НМВ в окрашенных препаратах методом электрочувствительных зон был проведен эксперимент с использованием окрашенного препарата железа Венофер в сравнении с растворителем Изотон II при добавлении латексных стандартных образцов N.I.S.T. Coulter R CC Size Standards диаметром 10 и 20 мкм.
Выполненные исследования показали, что предлагаемый метод электрочувствительных зон применим для определения НМВ в окрашенных ЛП независимо от цвета и интенсивности окраски испытуемого образца, анализ которых существующими методами (светоблокировки и микроскопии) невозможен или сопряжен с определенными методическими трудностями. При этом содержание НМВ в испытанных образцах не превышало установленных нормативных требований.
Для изучения и выявления факторов, влияющих на результаты экспериментов, был проведен дисперсионный анализ, предназначенный для проверки значимости отдельных факторов (метод испытания, образец, оператор).
Обработку результатов эксперимента проводили с помощью программного обеспечения Minitab 17.1.0. по алгоритму, предложенному D.S. Paulson [150], определяя степень свободы (DF), критерий Фишера (F) и вероятность (P), которая является наиболее информативной статистической величиной при изучении данных дисперсионного анализа. Влияние фактора считали существенным в случаях Fвыч Fтабл. и P 0,001. По полученным результатам сделали вывод, что существенное влияние на неопределенность результата оказывают человеческий фактор и особенности образца, при этом используемый метод не влияет на правильность получаемых результатов.
В ходе работы показаны линейность и специфичность метода электрочувствительных зон. Доказательство специфичности валидируемой методики основывалось на рассмотрении полученных с ее использованием данных анализа модельной смеси латексных стандартных образцов для контроля концентрации. Внесение примеси в виде латексных стандартных образцов разного размера не влияло на возможность определения количества частиц заданного размера методом электрочувствительных зон [151, 152, 153, 154].
На основании проведенной валидации метода электрочувствительных зон с требуемой правильностью, повторяемостью и внутрилабораторной прецизионностью впервые доказана целесообразность и обоснована возможность применения метода электрочувствительных зон для целей фармацевтического анализа.
В период с 2006 по 2015 гг. с использованием метода электрочувствительных зон нами проанализированы 3250 серий ЛС для парентерального применения отечественного и зарубежного производства.
В рамках работы была разработана и предложена унифицированная современная методика определения НМВ в ЛП, а также количеств и размеров жировых капель в эмульсиях для парентерального применения. В нашей работе был выявлен приоритетный метод электрочувствительных зон для определения НМВ в окрашенные ЛП, испытание которых традиционными методами (светоблокировки или микроскопии) невозможно или сопряжено с существенными методическими трудностями.
Было исследовано 49 серий эмульсий для парентерального применения, 10 % из которых составляли эмульсии для парентерального питания, 90 % - для анестезии. Разработана методика определения количества и размера жировых капель в эмульсиях для парентерального применения с использованием метода электрочувствительных зон, а также предложены оптимальные условия проведения анализа.
Проведенные исследования показали, что метод электрочувствительных зон позволяет оценить качество жировых эмульсий для парентерального применения по показателю «Размер частиц» с требуемым уровнем точности и прецизионности.
Важную роль в контроле ЛС играет не только анализ качества готового фармацевтического продукта, но и материалов, используемых для его разработки и оценки, например, ОСО мутности бактериальных взвесей, тест-штаммов микроорганизмов и др. В настоящее время применяемые для этих целей методы требуют доработки и совершенствования для повышения их информативности, точности и скорости выполнения анализа.
В результате проведения комплекса экспериментальных исследований (физических, физико-химических, микробиологических) показана целесообразность использования метода электрочувствительных зон при оценке дисперсного состава материала ОСО мутности бактериальных взвесей и концентрации клеток микроорганизмов.
В процессе выполнения научных и экспертных микробиологических исследований возникает необходимость использования взвесей микроорганизмов, содержащих определенное количество микробных клеток.
Процедура подсчета концентрации микробных клеток в лабораторных условиях может выполняться вручную или с помощью автоматических устройств.
Различают методы прямого подсчета в счетных камерах и на фильтрах, определение количества колоний после высева микроорганизмов на питательные среды, а также непрямые методы определения: визуальные, основанные на светопоглощении (турбидиметрия), светорассеянии (нефелометрия), электропроводности микробных взвесей (кондуктометрия) и др. Кондуктометрические способы основаны на зависимости сопротивления или проводимости среды от концентрации клеток. Одним из таких методов является подсчет числа клеток в электронном счетчике Култера. В рамках настоящей работы методом электрочувствительных зон были проанализированы суспензии микроорганизмов с различной формой клеток: Enterococcus spp.; Bacillus spp.; Lactobacillus spp.; Saccharomyces spp.
Фактическое количество микроорганизмов определяли чашечным агаровым методом с использованием соответствующей плотной питательной среды. Устанавливали размер клеток методом микроскопии с помощью программы ВидеоТесТ–Размер7.0. Полученные разведения микроорганизмов анализировали с помощью метода электрочувствительных зон.
Количество клеток микроорганизмов, определенное с помощью метода электрочувствительных зон, с достоверностью не менее 80 % подтверждается результатами, полученными с помощью чашечного агарового метода.
Полученные в ходе проведенного исследования результаты позволили разработать проект соответствующей ОФС для включения в следующее издание ГФ.
Анализ наиболее перспективных методов оценки размера частиц позволил выбрать для решения поставленных задач метод электрочувствительных зон. Минимальный размер частиц, который можно определить данным методом составляет 0,4 мкм, однако особенность прибора такова, что для изучения частиц, размером менее 2 мкм, необходимо было применение двух апертур (50 и 20 мкм). ВОЗ рекомендует контролировать наличие во взвесях количество частиц, размер которых превышает 3,5 мкм.
Наличие во взвеси значительного количества частиц размером более 3,5 мкм является для материала ОСО мутности критичным, так как взвеси с большим количеством крупных частиц стекла будут оседать значительно быстрее, следовательно, мутность их будет уменьшаться, что может сказаться на результатах определения концентрации микроорганизмов. Поэтому для измерений была выбрана апертура, которая надежно выявляет частицы стекла, размер которых превышает 3,5 мкм (критический) – апертура 20 мкм. Было экспериментально установлено, что количество частиц стекла во взвеси, имеющих размеры, максимально идентичные микроорганизмам, составляет не менее 95 %.
По результатам исследования требования к дисперсному составу ОСО мутности сформулированы следующим образом: стандартный образец мутности бактериальных взвесей представляет собой взвесь химически нейтрального боросиликатного стекла со средним размером частиц от 0,5 до 3,5 мкм, содержание частиц этой фракции составляет не менее 95 %.